הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

. פשוט תאכל לשעבר אלקטרופורציה ותרבויות פרוסה Organotypic מוח עובריים בעכבר עבור Live-הדמיה של העברת Interneurons GABAergic

9.9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/57526

⸱

20 באפריל 2018

 ,  ,  , 
1Centre de recherche du CHU Sainte-Justine, 2Department of Neuroscience, Université de Montréal, 3Department of pathology and cellular biology, Université de Montréal, 4Department of Pediatrics, Université de Montréal

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מספקים שיטה נמוכים ואמין כדי ליצור electroporated המוח organotypic פרוסה תרבויות מעוברים עכבר מתאים מיקרוסקופיה קונפוקלית טכניקות הדמיה לחיות.

תקציר

GABAergic interneurons (INs) הם מרכיבים קריטיים של רשתות עצביים לנהוג קוגניציה והתנהגות. תוספות נועד לאכלס את קליפת להעביר tangentially את מקומם המוצא telencephalon הגחוני (ובכלל זה המדיאלי, סימטרית ganglionic הרוחביים (MGE, CGE)) לצלחת בקליפת המוח הגבי בתגובה מגוון של פנימי, חיצוני רמזים. מתודולוגיות שונות פותחו במהלך השנים גנטית לתמרן מסלולים ספציפיים ולחקור כיצד הם להסדיר את השינויים הדינמיים cytoskeletal הדרושים עבור נאות בהעברה. אלקטרופורציה בתוך הרחם נעשה שימוש נרחב כדי לחקור את ההשפעה של דיכוי גנים או ביטוי ב- IN מסוימים תת תוך הערכת ההשפעה על מורפולוגיה והמיקום הסופי. עם זאת, בעוד גישה זו משמשת ברצון לשנות בצורה רדיאלית העברת תאים כפירמידה, זה יותר מבחינה טכנית מאתגר כאשר המיקוד מהווה בתוך הרחם אלקטרופורציה יוצרת תשואה נמוכה נותן שיעורי ההישרדות ירידה של הגורים כאשר אלקטרופורציה מבוצע לפני e14.5, כפי שמקובל כשלמדתי נגזר MGE הארצי. בגישה אלטרנטיבית, MGE explants מספקים גישה נוחה אל MGE וכדי להקל על ההדמיה של In מהונדסים. עם זאת, ב- explants אלה, תוספות נודדים אל מטריצה מלאכותיים, ללא הדרכה אנדוגני רמזים, תשומות דפנות התלמוס. זה הוביל אותנו כדי למטב את שיטת איפה הארצי יכול להעביר בסביבה יותר נטורליסטי, תוך עקיפת האתגרים הטכניים של גישות בתוך הרחם . בנייר זה, אנו מתארים את השילוב של הרחם לשעבר אלקטרופורציה מוח עובריים בעכבר ואחריו organotypic תרבויות פרוסה בקלות לעקוב אחר, תמונה, לשחזר מהונדסים תוספות מעבר לאורך שבילים טבעיים שלהם, בתגובה רמזים אנדוגני. גישה זו מאפשרת כימות שני של ההיבטים דינמי בהעברה עם הדמיה קונאפוקלית זמן לשגות, כמו גם את ניתוח מפורט של פרמטרים שונים מורפולוגית באמצעות שחזורים העצבית על רקמת immunolabeled קבוע.

מבוא

GABAergic קורטיקלית interneurons (INs) מגוונים לגבי תכונותיהם הביוכימי, מאפיינים פיזיולוגיים וקישוריות, ולסיים הם פונקציות שונות רשתות בוגר1,2,3 ,4,5. המפרט של תתי סוגים שונים של תוספות קורטיקלית מוסדר בחוזקה דרך מפלי גנטי כי כבר למדה בהרחבה1,2. הרוב (70%) של תוספות GABAergic קורטיקלית מקורן אבות ב המדיאלי ganglionic קדושתו (MGE), מבנה עובריים ממוקם ventrally, ו עליך להעביר על פני מרחקים ארוכים יחסית כדי להגיע את צלחת קורטיקלית1, 2 , 6. בזמן תאים קורטיקליים כפירמידה להעביר בצורה רדיאלית מאזור חדרית (VZ) לצלחת קורטיקלית לאורך לגרדום עכשיו רדיאלי, דונלד, ההעברה וקולו של תוספות, אשר לא צורפו כזה גרדום, דורש מגוון מהותי ו הסימנים החיצוניים כדי למשוך נוירונים נודדים כלפי הלוח בקליפת המוח, בזמן מנחה אותם הרחק מבני קורטיקלית-2,-7,-8. לאחר היציאה מחזור התא, תוספות הם שמופץ מ MGE על-ידי רמזים כימותרפיה-דוחה הביע בתוך VZ של MGE, אשר מפעיל העברה משיק לקראת9,קורטיקלית צלחת10. העברת תוספות למנוע את סטריאטום בעזרת רמזים שונים דוחה11 והם, כשמגיעים לצלחת קורטיקלית, להחליף בין וקולו מצב ההעברה רדיאלי להגיע אל המיקום למינריות הסופי שלהם, חלקית בתגובה רמזים של פירמידה תאים12 ו אחרים אוכלוסיות הסלולרית13. ההעברה של In, עבור אוכלוסיות עצביים אחרים, כרוך שינויים מורפולוגיים דינמיים שונים להתיר תנועת בפועל של הנוירון. ומכניקה עצביים כביכול זו מאופיינת מחזורים חוזרות של שלושה שלבים רצופים: התארכות של תהליך מוביל, של תנועה anterograde פעיל של הגרעין (nucleokinesis), משיכת תהליך נגרר14. בהעברה מוסדר על ידי רמזים רבים פנימי ולא חיצוני להסיע את מסעף ו שיפוץ פעיל של התהליך מוביל להנחות הארצי בכיוון הנכון, קביעת כיוון ומהירות ההעברה14,15 ,16.

גורמים ויסות קורטיקלית בהעברה נחקרו בהרחבה בשנים האחרונות1,2,7,17,18,19,20, יש כבר שמהווה שיבוש בחלק מן השחקנים מולקולרית להוביל להפרעות התפתחותיות, כגון רפואת ילדים עקשן אפילפסיה או אוטיזם ספקטרום הפרעות1,2,21, 22 , 23 , 24. לפיכך, הפיתוח של גישות שונות במבחנה , ויוו יש כנראה תפס לקדם בצורה משמעותית את היכולת שלנו ללמוד תהליך דינמי זה, כפי שנבדקו בעבר25. במבחנה שיטות, כולל וזמינותו קאמרית בוידן, פס בחירה וזמינותו, לספק את האמצעים והמהירה ביותר לשחזור להעריך את הדרישה וההשפעה התא האוטונומי של גנים ספציפיים או חלבונים במהלך ההעברה עצביים, ללא השפעת גורמים אחרים25. אלה מבחני שימושיות במיוחד בשילוב עם הדמיה live8,26,27. עם שיטות אלה, הן בקלות שאוחזר מ- e13.5 MGE והתבניות מבודדת על ידי דיסוציאציה אנזימטי ועל מכניים, אחרי אשר איתות המסלולים שונה, הדרכה רמזים יכול ייחקרו, כמופיע בעבר8,28 . עם זאת, אלה מבחני לקחת את המקום מטריצה חוץ-תאית מלאכותי בהיעדרו של רקמות תלת מימדי אדריכלות, אשר עשוי לשנות מאפייני התנהגות של תאים עצביים, פוטנציאל להשפיע תא העברה ו/או הישרדות25. כדי לעקוף את מגבלות אלה, פותחו vivo לשעבר MGE explants ככלי חלופי כדי לכמת את השינויים מורפולוגי דינמיים המתרחשים במהלך ההעברה יחד עם פרמטרים כגון מהירות וכיוון14, 29. MGE explants הוא יחסית פשוט ושוויונית כבר בהרחבה תיאר במקום30. היא מצריכה את ציפוי של תמצית קטנה של MGE על טפט של תאים קורטיקליים מעורבת, או בתערובת של matrigel וקולגן בנוכחות רמזים מושך או דוחה25, למרות האחרונים הם אופציונליים31. MGE explants לאפשר רזולוציה גבוהה הדמיה של תאים עם תוויות בדלילות, לפשט את המחקר של תהליכים תאיים, כגון שיפוץ cytoskeletal בתהליך המוביל הסתעפות, כפי שמוצג בעבר32,33 ,34 , במחקר הנוכחי. MGE explants שימשו בהצלחה כדי להעריך שינויים cytoskeletal דינמי במהלך ההעברה בסביבה דו-מימדית, למשל לאחר ספציפי מניפולציות תרופתי או chemotactic (ראה, לדוגמה, Tielens. ואח 201633) . אולם, עם גישה זו, תוספות להעביר במסגרת מלאכותי, זה עשוי לשנות ב התנהגות הפארמצבטית ואת המשמעות של תוצאות הניסוי.

לעומת זאת, בתוך הרחם אלקטרופורציה מאפשר מניפולציה גנטית של תוספות בסביבתם הטבעית, היא שיטה הנפוצה להעריך במהירות וביעילות את ההשפעה של רווח הפסד של תפקוד הגן תוך עקיפת המגבלות של נוקאאוט יקר וארוך, טוק-in אסטרטגיות25,35. אלקטרופורציה בתוך הרחם עלולים להיות מוטים לכיוון בבית אבות באמצעות תא סוג ספציפי היזמים ועל ידי מיקום האלקטרודות לכיוון מבני ventromedial, כולל את MGE36. יתר על כן, בתוך הרחם אלקטרופורציה מאפשר ביטוי בזמן של בונה ניסיוני בתוך 1-2 ימים, לעומת 7-10 ימים נדרש לבנות ביטוי באמצעות ויראלי המומנט25. עם זאת, בתוך הרחם אלקטרופורציה של בבית אבות נוטה להיות תפוקה נמוכה. למרות אבות תא כפירמידה ממוקם באזור הגבי חדרית יכולה להיות transfected ביעילות באמצעות בתוך הרחם אלקטרופורציה, פילוח יותר ventrally ממוקם מבנים, כגון MGE, הוא יותר מבחינה טכנית מאתגר, בפרט קטן e13.5 עוברי, השיעור הגבוה של עובריים קטלני עוד יותר מפחית את התשואה ניסיוני25.

כדי לעקוף חלק המגבלות הטכניות הקשורות במבחנה MGE explant הניסויים ולא אלקטרופורציה ויוו ברחם , שמחוץ organotypic פרוסה תרבויות היה מפותח8,37, 38,39. המוח organotypic פרוסה תרבויות מציעים תנאים היתרון מחקה ויוו , בעת היותו פחות יקרים ולגזול מאשר חיה ביצירת מודלים25. אכן, הכנות אלה מאפשרים גישה נוחה MGE, יחד עם הפריט החזותי ספציפי של תוספות, ולא יכול להיות משולב עם מוקד אלקטרופורציה לחקור מסלולים מולקולריים ספציפי ב- INs נודדות סביבה יותר פיזיולוגית8 , 39 , 40 , 41. אנחנו ולכן יש אופטימיזציה גישה עבור organotypic תרבויות38, אשר אנחנו בשילוב עם רחם לשעבר אלקטרופורציה והדמיה קונאפוקלית זמן לשגות, בכדי להעריך את תהליך דינמי מורפולוגיים המתרחשים במהלך ההעברה וקולו של MGE-In. בפרוטוקול הנוכחי הותאם וממוטב אחרים אשר השתמשו לשעבר הרחם או בתוך הרחם המוח אלקטרופורציה organotypic פרוסה תרבויות ללמוד את ההעברה של תאים כפירמידה42,43 ו בקליפת המוח תוספות36,39,44. באופן ספציפי, העכבר העוברים נמצאים ערף, MGE הוא electroporated vivo לשעבר לאחר הזרקה ע של פלסמידים ניסיוני, ומאפשר יותר יעיל, מדויק פילוח של אבות MGE מאשר מה ניתן להשיג באמצעות אלקטרופורציה בתוך הרחם . המוח ואז מופקים למחלקה לפרוסות הילתית כל המוח זה יכול להיות תרבותי לכמה ימים, ובכך מאפשר רציפה מעקב, הדמיה של transfected In. גישה זו תוויות בדרך כלל 5-20 tangentially העברת תוספות לחתיכה המוח, למזער את מספר האיטראציות ניסיוני נדרש להגיע מובהקות סטטיסטית, תוך תיוג אוכלוסיה עצביים דליל מספיק כדי להבטיח הפרדת קל נוירונים בודדים עבור שחזור והערכה מורפולוגי משובחים. יתר על כן, בהשוואה ל- MGE explants, organotypic תרבויות להבטיח כי העברת תוספות נחשפים סביבה טבעית יותר, כולל נוגדנים מופרשים באופן מקומי, תשומות מ afferents דפנות התלמוס. גישה זו מתאימה מאוד ובכך לכמת את כיוון והנתיב נודדות שאומצה על ידי transfected In, תוך מתן פרטים אנטומיים מספיקים כדי לאפשר אפיון תהליכים דינאמיים עדינה יותר כגון מוביל תהליך הסתעפות, nucleokinesis, נגררים תהליך הכחשה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל הניסויים המערבות בעלי חיים אושרו על-ידי les avec Comité Institutionnel des Bonnes Pratiques Animaux דה Recherche (CIBPAR) במרכז המחקר Sainte-ז'וסטין צ'ו ולא נערכו על פי המועצה הקנדית על המדריך של חיה אכפת טיפול ושימוש של חיות ניסוי (גליון 2).

הפרוטוקול המתואר כאן היה ממוטב אלקטרופורציה העובר ביום עובריים (e) 13.5, בכל פעם כאשר נגזר MGE הארצי באופן פעיל נוצרים, לפני שיא של CGE, נגזר תוספות ייצור45,46. יתר על כן, הטיה של אלקטרופורציה לכיוון GABAergic הארצי, אנו משתמשים מקדם באופן סלקטיבי לידי ביטוי תוספות (למשל Dlx5/6 יזם עם שיפור מינימלי שלה)47.

1. הכנה של פתרונות אלקטרופורציה ותרבויות פרוסה Organotypic

  1. להכין 125 מ של אמצעי התרבות סטרילי.
    1. למדוד 125 מ של מדיום תרבות ספציפית נוירון רגיל (ראה טבלה של חומרים ניסוח) בבקבוק מעוקר ב אבטחה קודם לכן עיקור UV ארון ריסס עם 70% אתנול. הוסף 2.25 מ של 50 x ספציפי נוירון סרום ללא תוספת, 1.75 מ של גלוטמין 200 מ"מ (הריכוז הסופי של 0.5 מ מ), 6.25 מ של הסוס לא פעיל חום סרום בעבר aliquoted בתנאים סטריליים. לערבב ביסודיות, aliquot ב- 15 מ"ל צינורות חרוט סטרילי, ולאחסן ב 4 º C.
      הערה: בינוני תרבות מוכן ניתן לאחסן עד 3 שבועות ב 4 º C.
    2. לחלק 100 X פתרון מניות של ניסוח של Botteinstein N-248 aliquots µL 150 בתנאים סטריליים ומקפיאים ב-20 ° C עד השימוש.
  2. להכין 1 ליטר של נוזל מוחי שדרתי מלאכותי סטרילי (כלנית חדד).
    1. למדוד 800 מ ל מים מזוקקים בתוך 1 ליטר. להוסיף 25.67 גר' סוכרוז, 5.08 גר' נתרן כלורי (NaCl), 2.18 גר' נתרן ביקרבונט (NaHCO3), 1.80 גר' גלוקוז, 0.19 g של אשלגן כלורי (אשלגן), 0.15 גרם monobasic נטול מים סודיום פוספט (NaH2PO4), 1 מ"ל של 1 מ' מניות CaCl2 .2H2O ו- 2 מ של 1 מ' במניה MgSO4.7H2O. מערבבים כדי להמיס בטמפרטורת החדר. להוסיף מים מזוקקים להגיע הנפח הכולל של 1 ל'
    2. באמצעות מסנן מיקרומטר 0.22, לסנן את הפתרון לתוך בקבוק סטרילי ב אבטחה סטיריליים ארון ולאחסן ב 4 ° C עד כחודש.
  3. להכין פתרון טריים של 4% agarose ב כלנית חדד לפני ניסוי.
    1. למדוד 25 מ של חנה המבר בעבר מוכן צינור חרוטי סטרילי 50-mL ולהוסיף 1g של agarose נקודת התכה נמוכה.
    2. חום במשך 45 s בתנור מיקרוגל. כדי למנוע את שפיכת, פסיקה חימום כל 3-4 s כאשר רותחים מתחיל, פתח הצינור לשחרר את הלחץ החוצה, יסגרו אותו שוב, להתסיס באופן ידני כדי לערבב את agarose. חזור עד הפתרון agarose הוא הומוגני. שמור את הפתרון agarose ב 42 ° C במהלך השארית של הניסוי כדי למנוע ייבוש.
      הערה: טמפרטורות גבוהות יותר יגרום נזק לרקמות המוח.

2. הכנה של פלסמידים להזרקה

  1. משוך על פיפטה microinjection זכוכית
    1. הגדר את פולר micropipette עם הפרמטרים הנכון, לאבטח את נימי זכוכית בחלל סיפק וודא כי ממורכזת עם חוט הלהט.
    2. לחץ על לחצן משיכה.
    3. הסר בזהירות פיפטות microinjection עשה לאחרונה את החום פולר, מקום בתיבה או צלחת פטרי נקי עד שימוש נוסף כדי למנוע נזק את הטיפ.
  2. אבטחה ארון עם כל הכלים הדרושים בשביל זה ניסוי (ראה איור 1 א'), בנדיבות לרסס כל הכלים באבטחה ארון עם 70% אתנול הקמה לעקר את הכלים ואת הסביבה עם אור UV למשך 15-20 דקות.
  3. במהלך השלב עיקור, להפשיר פלסמידים על קרח (4 ° C).
  4. מודדים 10 µL של פלסמיד פתרון מניות (4 µg/µL) לתוך שפופרת צנטרפוגה mL 1.5 נקי. הוסף 0.01% FCF ירוק. לערבב בעדינות, ספין בקצרה, לשמור על הקרח עד השימוש.
    הערה: מקסי-הכנה DNA כדאי להיערך על פי הפרוטוקול של היצרן באמצעות ערכת נטולת אנדוטוקסין מקסי-הכנה. יכול להיות solubilized DNA במאגר טה או נטול נוקלאז H2O והכנת פלסמיד עם צבע יכול פתרון, אבל לא צריך להתבצע בתנאים סטריליים. פלסמידים של מקסי-הכנה צריך להיות aliquoted כדי למנוע מספר מחזורים ההקפאה-הפשרה. פלסמידים aliquoted אמור. להיות מעורב עם לצבוע אין יותר את 2 h לפני השימוש, לא צריך להיות והוקפאו לשימוש נוסף.
  5. לאחר עיקור, להכין את הננו-מזרק כדלקמן.
    1. בחר באחד פיפטה microinjection זכוכית בעבר מוכן מאוחסנים בתיבת נקי או צלחת פטרי, פינצטה קטנה להשתמש כדי לחתוך את קצה פיפטה בדרך משופע כדי להשיג את הקוטר החיצוני של בערך 15 מיקרומטר.
      הערה: הקוטר החיצוני שניתנו כאן הוא אמצעי המשוער כדי להעניק למשתמש מושג במה להשתמש בניסויים שלנו ואת מוטבה כדי להקל על אקט של הגולגולת להזרקה פלסמיד ללא פגיעה במוח, תוך מתן אפשרות לקבלת נוזל טעינת ושחרור של ה-DNA. ניתן למדוד את הקוטר החיצוני על ידי הסתכלות על הקצה לחתוך הזכוכית microinjection פיפטה. אני בטוח לבר סולם מיקרומטר תחת מיקרוסקופ שדה בהיר.
    2. השתמש במזרק כדי למלא את micropipette עם שמן מינרלי מסופה unpulled (לגרש את כל האוויר).
    3. הכנס את micropipette זכוכית מלא הננו-מזרק לפי הוראות היצרן.
    4. ריקה 2/3rds של micropipette זכוכית (שמירה מספיק שמן למניעת כניסת אוויר).
  6. בזהירות להוסיף את micropipette מוכן בצינור המכיל את הפתרון פלסמיד/לצבוע ולמלא את micropipette זכוכית עם הפתרון פלסמיד/צבע.

3. אוסף של העכבר העוברים מן הנקבות בהריון

  1. לפקח על רבייה נקבות מדי יום כדי להעריך המיועדים הנרתיק, רצוי באותו זמן מדי יום (בשעות הצהריים). יום e0.5 מקביל ביום הראשון כאשר נצפית פקק הנרתיק.
    הערה: הניסויים המתוארים כאן יכול להתבצע בעכברים פראי-סוג. עם זאת, כדי להקל על הזיהוי של MGE לתייג כל תוספות GABAergic (או ערכות משנה ספציפיות כגון תוספות נגזר MGE), חיות הטרנסגניים ניתן להשתמש (למשל: GAD67EGFP; Dlx5/6Cre עם אלל Cre-עיתונאי,47,וכו '49). במצב זה, פלסמיד ניסיוני מוזרק צריך לבטא fluorophore אחרת (למשל mCherry או TdTomato) כדי לאפשר ויזואליזציה של ה In transfected (צהוב) אשר ניתן להשוואה עם תוספות שאינן transfected (ירוק).
  2. להקריב את הנקבה-עובריים ביום e13.5, על ידי הצוואר.
    הערה: סוכנים הרדמה שניתן במועד של הקרבה עשוי להשפיע ב-50,של ההעברה והישרדות -51 , יש להימנע.
  3. לאסוף העוברים על ידי קיסרי כדלקמן.
    1. תרסיס בנדיבות בבטן הנקבה עם 70% אתנול. תמשוך בעור בטן עם זוג מלקחיים סטיריליים ולהשתמש, ביד האחרת, מספריים כירורגיים סטיריליים לחתוך את העור מן הבטן.
    2. עם זוג השני של סטיריליים מלקחיים ומספריים, תעלה fascia בטן וחותכים אותו תוך הימנעות בקפידה את הרחם.
    3. באמצעות זוג שלישי סטיריליים מלקחיים ומספריים, משוך את הקרניים הרחם, לגזור אותם חלל האגן. מניחים את הקרניים הרחם ביתור בצלוחית סטרילי 60 מ מ מלא מבוסס על עצבי בינוני תרבות בתוספת חומצות אמינו, ויטמינים ומלחים אורגניים (ראה טבלה של חומרים למוצר זמין מסחרית).
  4. ב- cabinet אבטחה סטרילי, להשתמש שני זוגות של פינצטה בסדר (אחת בכל יד) כדי לנתח את העוברים מחוץ השליה ולבודד את ראשי ע י עריפת ראשו.
  5. שיקוע-חתך קצה פיפטה העברה פלסטיק mL 3 סטרילי, תשאף ראשי, העברת אותם בצלוחית חדש סטרילי 60 מ מ שכבתית עם שעווה שחור הקרושה ומלא אותו עצבית מבוססת שיושלם תרבות בינוני כמפורט לעיל.
    הערה: שלב זה ממזער את העברת מזהמים (העכבר שיער, דם). שעווה שחור משמש כדי לייצב את הראש במהלך ניתוח. תרבות המדיה לא צריך להיות חמצן במהלך הליכים אלה.

4. ע פלסמיד זריקות ואלקטרופורציה Vivo לשעבר של MGE

הערה: השלבים הבאים חייב להתבצע בתנאים סטריליים ב אבטחה מוכן קודם לכן ארון.

  1. במקום 60-מ מ הפטרי שכבתית עם שעווה שחור, המכיל את ראשים ערופים ב עצבית מבוססת שיושלם תרבות בינוני תחת המשקפת ב אבטחה הקבינט.
  2. לייצב את הראש, החלק rostral פונה, עם פינצטה בסדר עם יד שמאל ולהשתמש הננו-מזרק ביד ימין להחדיר µL 1-2 של הפתרון פלסמיד/צבע לתוך החדר הימנית.
    הערה: ניתן ביטוי שיתוף ניסויים שערך co-electroporating של פלסמיד הצלה, פלסמיד לבטא shRNA על ידי ערבוב בשני פלסמידים בריכוזים equimolar.
  3. Electroporate המוח מוזרק.
    1. שים את ראשך בין האלקטרודות עם האלקטרודה השלילית dorsally ממוקם ומקבילי בראש את האלקטרודה החיובית כלפי הצד הבטני של הראש כדי למקד את MGE.
    2. ברגע האלקטרודות ממוקמות היטב, מספקים פולסים מרובע 4 של 40 V עבור ms 50-500 ms במרווחים הבין-דופק.
    3. הסר כל רקמות שיורית האלקטרודות באמצעות פינצטה שכבר התבצעו באבטחה הקבינט.
      הערה: פרמטרים אלה מוטבו במיוחד עבור electroporator להשתמש בניסויים שלנו. אנו ממליצים כי המשתמשים לבצע בדיקות אופטימיזציה מראש אם באמצעות סוג אחר של electroporator.
    4. חזור על הצעדים 4.1 4.3 כל המוח הנותרים.
      הערה: למרות פרוטוקול זה מתאר המניפולציות נדרש מוח אחד, זה ניתן להזריק עד 4 מוח ברצף לפני electroporating כל המוח, ובכך מגדילים את התשואה. אסטרטגיה זו היא יתרון במיוחד כאשר פלסמידים 2 או יותר שונים מוזרקים ברצף (למשל שליטה או ניסיוני פלסמיד) במהלך הניסוי אותו (המאפשר השוואה בין הארנבונים מאותה). בנוסף, זה אפשרי להזריק electroporate בו זמנית שני הצדדים של המוח, כדי להגדיל את התשואה, על-ידי מיקום האלקטרודות מקביל לחלוטין פני השטח של המוח.

5. המוח לנתיחה ותרבויות פרוסה Organotypic

  1. זמן מניפולציה עדיין בסביבה סטרילית של אבטחה הקבינט, לנתח את המוח מחוץ לגולגולת.
    1. ייצוב הראש על השכבה של שעווה שחור על ידי החדרת מחט לתוך כל עין תוך הימנעות המוח.
    2. השתמש זוג מלקחיים בסדר להחזיק בצד שמאל של הצוואר וזוג תגליתו בסדר להרוס את העור מן הגולגולת, מתוך מהסוף השני.
    3. בעוד אתה מחזיק את הראש רוחבית עם פינצטה ביד אחת, להשתמש עוד זוג מלקחיים וביד השנייה כדי לחתוך בזהירות את הגולגולת ברמה של גזע המוח ומשוך בעדינות את הגולגולת למעלה. עם כל פינצטה, לחתוך את הגולגולת במטוס sagittal (קו האמצע) לחזית ולאחר מכן פצעים וחתכים רוחבית לשחרור חלקי הגולגולת.
    4. הרם את גזע המוח, לחתוך בזהירות את קרומי המוח ואת עצבי עד המוח היא לחלוטין לא הגולגולת.
      הערה: כל השלבים המתוארים 5.1 צריכה להתבצע בתנאים סטריליים מחמירים ב אבטחה ארון.
  2. להטביע את המוח ב- 4% התכה נמוכה נקודת agarose על חלוקתה.
    1. למלא צלחת פטרי 35 מ מ עם הפתרון agarose המוכן מעל (כל הזמן נוזלי ב 42 ° C).
    2. במהירות העברה של המוח electroporated המנה מלא agarose באמצעות פיפטה של העברת לחתוך קודם לכן. שמור את המנה בטמפרטורת החדר.
    3. מערבבים את agarose עם מקל מתכת לשמור על המוח באמצע הבאר (כדי למנוע שוקע) ומקם את המוח על מטוס rostro-סימטרית במקביל המנה. תפסיק לערבב agarose מתחיל לגבש, כדי למנוע כל נזק מוחי.
    4. השימוש סכין גילוח לחתוך את agarose המקיפים את המוח כדי ליצור בלוק מלבני, משאיר שוליים של 1-2 מילימטרים מסביב למוחו. ודא כי החלק rostral של המוח הוא בניצב למגבלת הקדמי של הבניין כדי להקל על ההכוונה אופטים והשלבים הבאים.
    5. חזור על כל המוח.
      הערה: זה אפשרי לחתוך מוח יותר מפעם אחת בכל פעם (מקסימום 3) ידי בעיצוב אבני agarose נפרד בעת הגדרת כל המוח בגבהים שונים.
  3. Vibratome מקטעים הילתית ותרבות פרוסה.
    1. הפשרה aliquot אחד של 100 X N-2 תוספת (150 µL) על קרח והוסף לבינונית תרבות aliquoted 15 mL, בתנאים סטריליים.
    2. העברת µL 750 תרבות בינוני (עם תוספת X N2 1) כל טוב של צלחת 6-ובכן תרבות.
    3. עם פינצטה מעוקל, מקום אחד הוספה התרבות התא (בקוטר 30 מ מ, גודל הנקבוביות מיקרומטר 0.4, PTFE) בכל אחד בינוני מלא טוב.
    4. למלא את האמבטיה vibratome חנה המבר מחומצן ללא הרף. מגניב עד 4 ° C עם קרח המקיפים את האמבטיה, או להשתמש vibratome בקירור.
    5. הגדר את מהירות vibratome 0.150 מ"מ/s ואת התדירות ל- 80 הרץ.
    6. דבק הרחוב agarose על פלטפורמה vibratome, rostral הקצה פונה כלפי מטה, הגחוני / edge בפני המשתמש.
    7. לחתוך את המוח בסעיפים הילתית להשיג חלקים מיקרומטר בעובי 250 (ב 4 ° C).
    8. עם שפכטלים מעוקר, לאסוף את סעיפים 2-3 המכילות את MGE ואת המקום להוסיף כל המקטעים המוח מחיה לחיה על קרום 30-מ מ יחיד, תוך הימנעות חפיפה בין מקטעים. מקם את תותב טוב אחד של צלחת 6-ובכן תרבות (המכיל 750 µL של תרבות שהושלם בינוני, כפי שתואר לעיל). לחלופין, כל מקטע להנחה על קרום בקוטר 13 מ מ נפרד בצלחת 12-ובכן תרבות מלא 500 µl בתוספת תרבות בינוני. הכמות של תרבות בינוני מומלצת מכל קידוח מאפשר את הסעיפים המוח כדי להיות מוזנת ע י התקשורת מבלי להיות מתחת למים.
      הערה: השלבים המתוארים 5.3.6, 5.3.7 אינן נעשות בתנאים סטריליים מלאה, אלא אם כן vibratome ניתן לעקר, בשימוש של אבטחה בארון. לכן, זה הכרחי לבצע שלבים אלה בקפידה כדי למנוע כל זיהום. ציוד מגן מתאים (נקי מסכה, כפפות כירורגי, חלוק המעבדה) צריך ללבוש בכל הזמנים ובכל חלקי הגוף, אפילו מכוסה, כגון שיער, פנים, ידיים, צריך לעולם לא תעבור על הצלחות תרבות (עם או בלי תרבות בינוני). כמו כן מומלץ לרסס 70% אתנול לעתים קרובות על כפפות ועל שפכטלים נהג לאסוף את החלקים של המוח.
    9. מקם את הצלחת תרבות חממה סטרילי מאוורר ב 37 ° C עם 60% לחות ו-5% CO2 48 או 72 h.
      הערה: אלו פעמים הדגירה אופטימציה להצגה הדמיה בצילום מואץ של In MGE, נגזר והדימות קונאפוקלית של פרוסות קבוע, בהתאמה. הדגירה אופטימלית פעמים צריך להיבדק מראש עבור כל עיצוב ניסיוני. בנוסף, אם הדגירה שבחרת הוא 72 h, תחת, יש צורך לשנות את המדיום תרבות. משכי זמן ארוכים יותר דגירה, המדיום תרבות יש לשנות כל 2-3 ימים.
    10. לאחר זמן הדגירה הרצוי, להעביר את המקטעים של עניין coverslip תאיים 8 ולהוסיף 3-5 µL של תרבות בינוני. המקום coverslip בתא סביבתיים (37 מעלות צלזיוס, 60% לחות, 5% CO2) מחובר הפוך ספינינג דיסק וידאו מצוידים עם תוכנת המחשב בסיוע רכישה שיבנו ההפעלה הדמיה בצילום מואץ.
      הערה: לחלופין, סעיפים ניתן לתקן עם 4% paraformaldehyde (בן לילה ב 4 ° C או 2 h בטמפרטורת החדר) ובעקבות כך immunostained עם נוגדנים שונים עבור ויזואליזציה של התכונות מורפולוגי של electroporated תוספות תחת קונפוקלי מיקרוסקופ. למרות eGFP ו- mCherry ניתן לאבחן על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית ללא כל הליך נגד מוכתמים, אנו ממליצים על ביצוע אימונוהיסטוכימיה נגד ה-GFP, mCherry כדי לשפר את האות מאז תהליך פיקסציה. המצמצמים פלורסצנטיות, הפחתת זיהוי רכיבי עדינה יותר של נוירונים עובריים, כגון סניפים קטנים יותר בתהליכי מובילים או נגררים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

בחלק זה, אנו מספקים תוצאות נציג שהושג בעקבות אלקטרופורציה את הרחם לשעבר של פלסמיד הבקרה, או על פלסמיד ניסיוני מיקוד גנים של עניין, MGE של e13.5 העכבר העוברים ואחריו organotypic פרוסה תרבויות הדגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות (עבור הדמיה בצילום מואץ) או 72 h (עבור קיבוע, תיוג immunohistochemical) (ראה איור 1B סכימתי פרוטוקול). דוגמאות מייצגות של תוספות מעבר מ- explant MGE הם גם מאוירים (ראה איור 1C עבור פרוטוקול סכמטי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

במאמר זה, אנו מספקים שיטה אמינה עבור ביצוע לשעבר עם רחם אלקטרופורציה של העכבר MGE-e13.5, הדור של תרבויות organotypic של פרוסות המוח העוברי. למרות שיטות במבחנה , כמו וזמינותו קאמרית בוידן, שקל יחסית לבצע והוא יכול לשמש כדי להעריך תפקידים ספציפיים של גנים שונים, חלבונים ללא ההפרעה של גורמים אחרים, הם למנוע החקירה של דינמיקה ההעברה ביחס נתיב כיוון והעברה25. MGE explants לספק אמצעי שימושי כדי ללמוד את השינויים cytoskeletal הדינמיים המתרחשים במהלך ההעברה, כפי שנראה כאן, אבל הם ללא רמז...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף. הדיעות בזאת ואינן מייצגות בהכרח את נופי שר הבריאות או בית הממשלה של קנדה.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי הפעלה מענקי הקרן סבוי, קרן אפילפסיה התרופה, באמצעות ציוד מענקים מקרן הקנדית לחדשנות כשלקחו (מיקרוסקופ קונפוקלי), G.H (ספינינג דיסק מיקרוסקופ קונפוקלי). בחדר המיון מקבל פרס על הקריירה של Fonds דה קוויבק du רשרש-Santé (FRQ-S; פרס Clinician-scientist) כמו גם כמו מן המוסדות הקנדי למחקר בריאות (CIHR; פרס החוקר הצעיר). ג. ה הוא חוקר בכיר FRQ-S. עם זיגוג היא זוכת הפרס הכשרה פוסט-דוקטורט Steriade-סבוי מטעם קרן סבוי, בפרס הכשרה פוסט-דוקטורט צ'ו Sainte-ז'וסטין קרן ופרס הכשרה פוסט-דוקטורט FRQ-S, בשותפות עם קרן של כוכבים. פרויקט זה כבר מתאפשרת על ידי המוח קנדה באמצעות קרן מחקר המוח. קנדה, באמצעות סיוע כספי של הבריאות בקנדה, מוענק זה

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
NeurobasalMedium ThermoFisher Scientific21103049מדיום תרבית ספציפי לנוירונים זמין מסחרית. הנוסחה המלאה זמינה באתר זה: תוסף תזונה ללא
סרום B-27ThermoFisher Scientific17504044תוסף ספציפי לנוירונים ללא סרום 50X
שפופרות צנטריפוגות סטריליותSarstedt62.554.002
Leibovitz's (1X) L-15 בינוני (+ L-גלוטמין)ThermoFisher Scientific11415064מדיום תרבית מבוסס עצבים זמין מסחרית בתוספת חומצות אמינו, ויטמינים ומלחים אנאורגניים. הפורמולה המלאה זמינה באתר המפיץ 
L-גלוטמיןInvitrogen25030-081
סרום סוסים,Millipore-SigmaH1138-500ML
Neurocell מומת בחום N-2 100XWisent305-016ניסוח N-2 של בוטינשטיין
VWR בקבוקי מדיה מרובעים PETG 125 מ"לVWR89132-062
Class II סוג A ארון בטיחות ביולוגיתNuaireNU-540
סוכרוזביושופSUC700.1
נתרן כלורידBioShopSOD001.1
נתרן ביקרבונטThermoFisher ScientificS233-500
D+ גלוקוזMillipore-SigmaG7528-250G
אשלגן כלוריThermoFisher ScientificP217-500
נתרן פוספט מונובסיסי ביושופSPM400.500
סידן כלוריד דיהידרט ThermoFisher ScientificC79-500
מגנזיום סולפט heptahydrateBiosShopMAG522
AgaroseBioShopAGA002.500
50 מ"ל צינורות צנטריפוגה סטרילייםSarstedt62.547.004
צינורות צנטריפוגה 1.5 מ"לSarstedt72.690.001
P-97 חולץ מיקרופיפטה בוער/חוםסאטר אינסטרומנטסדגם P-97
0.4 מ"מ תעודת זהות x 75 מ"מ צינור נימידראמונד מדעי1-000-800/12
אתנולVWRE193
5 מ"ל מזרקBecton Dickinson & Co309646
שמן מינרלי (כבד)Rougier Pharma
WPI פינצטה שוויצרית #5World Precision Instruments50451111 ס"מ, ישר, 0.06x0.07 מ"מ קצות, אנטי מגנטי. תזדקק ל-2 כאלה.
WPI פינצטה שוויצרית #7World Precision Instruments50450411.5 ס"מ, 0.18x0.2 מ"מ, קצוות מעוקלים
HTC פינצטהWorld Precision Instruments50461711 ס"מ, ישרים, מספריים הפעלה שטוחים
World Precision Instruments50122516 ס"מ, חד/חד, ישר. תזדקק לשלושה כאלה.
חבישת מלקחייםWorld Precision Instruments50121712.5 ס"מ, ישר, משונן,
איריס מלקחייםWorld Precision Instruments50447810.2 ס"מ, עקומה מלאה, משוננת
DeBakey TissueClinicps World Precision Instruments 50199615 ס"מ, זווית 45 מעלות, לסת עדינה, רוחב 1.5 מ"מ
Fisherbran Microspatula עם קצוות מעוגליםFisherScientific21-401-5תזדקק ל-2 כאלה.
Nanoject II מזרק ננוליטר אוטומטיDrummond scientific3-000-204
TC צלחת 60, תקןSarstedt83.3901צלחת 60 מ"מ
צלחת תרבית רקמותSarstedt83.1800צלחת 35 מ"מ
שעווה שחורהFisherScientificS17432
פיפטות העברה Ultident170-CTB700-2123 מ"ל, נורה קטנה
מיקרוסקופ סטריאוLeica BiosystemsLeica M80במקום הסטריאומיקרוסקופ שלנו שהופסק על ידי היצרן (StereoMaster מבית FisherScientific)
אלקטרו מרובע PoratorBTX מכשיר הרווארדECM 830
פינצטה, מצופה פלטינום, 3 מ"מBTX מכשיר הרווארד45-0487
25 גרם 1 1/2בקטון דיקינסון & Co305127
Leica VT1000S להב רוטט מיקרוטוםLeica BiosystemsVT1000S
GEM, סכין גילוח קצה יחידמדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית71952-10הסר את הקצה הקהה לפני הכנסת החלל המיועד ללהב של הוויברטום
&מיקרו;-שקופית 8 בארIbidi80827חבילה של 15
הכנסת תרביתתאים מילי-תאMillipore-SigmaPICM0RG5030 מ"מ, PTFE הידרופילי, 0.4 ומיקרו; נקבוביות, חבילה של 50. 
מיקרוסקופ Leica DMi6000Leica MicrosystemsN/A
ראש קונפוקלי דיסק מסתובב Ultraview VoxPerkin ElmerN/A
Volocity 6.0 תוכנת רכישהImprovision/Perkin ElmerN/A
LiveCell Stage מערכת הדגירה העליונההתקני פתולוגיהLC30030מספק בקרת טמפרטורה, CO2 ולחות. 
מיקרוסקופ קונפוקלי SP8Leica
mCherry-Lifeact-7Addgene54491מתנה מבקבוק מייקל דוידסון
Fast Green FCFMillipore-SigmaF7258-25G25G, מאושר על ידי הוועדה לכתמים ביולוגיים
https://www.thermofisher.com/ca/en/home/technical-resources/media-formulation.251.html תוסף נטול מים

מקורות

  1. Rossignol, E. Genetics and function of neocortical GABAergic interneurons in neurodevelopmental disorders. Neural Plast. , 649325(2011).
  2. Jiang, X., Lachance, M., Rossignol, E. Involvement of cortical fast-spiking parvalbumin-positive basket cells in epilepsy. Prog Brain Res. 226, 81-126 (2016).
  3. Ascoli, G. A., et al. Petilla terminology: nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex. Nature Reviews Neuroscience. 9, 557-568 (2008).
  4. Klausberger, T., Somogyi, P. Neuronal diversity and temporal dynamics: the unity of hippocampal circuit operations. Science. 321, 53-57 (2008).
  5. Somogyi, P., Klausberger, T. Defined types of cortical interneurone structure space and spike timing in the hippocampus. J Physiol. 562 (Pt 1), 9-26 (2005).
  6. Rudy, B., Fishell, G., Lee, S., Hjerling-Leffler, J. Three groups of interneurons account for nearly 100% of neocortical GABAergic neurons. Dev Neurobiol. 71 (1), 45-61 (2011).
  7. Marin, O. Cellular and molecular mechanisms controlling the migration of neocortical interneurons. Eur J Neurosci. 38 (1), 2019-2029 (2013).
  8. Flames, N., et al. Short- and long-range attraction of cortical GABAergic interneurons by neuregulin-1. Neuron. 44 (2), 251-261 (2004).
  9. Zhu, Y., Li, H. -S., Zhou, L., Wu, J. Y., Rao, Y. Cellular and molecular guidance of GABAergic neuronal migration from an extracortical origin to the neocortex. Neuron. 23, 473-485 (1999).
  10. Zimmer, G., et al. Ephrin-A5 acts as a repulsive cue for migrating cortical interneurons. Eur J Neurosci. 28 (1), 62-73 (2008).
  11. Nobrega-Pereira, S., et al. Postmitotic Nkx2-1 controls the migration of telencephalic interneurons by direct repression of guidance receptors. Neuron. 59 (5), 733-745 (2008).
  12. Lodato, S., et al. Excitatory projection neuron subtypes control the distribution of local inhibitory interneurons in the cerebral cortex. Neuron. 69 (4), 763-779 (2011).
  13. Elias, L. A., Turmaine, M., Parnavelas, J. G., Kriegstein, A. R. Connexin 43 mediates the tangential to radial migratory switch in ventrally derived cortical interneurons. J Neurosci. 30 (20), 7072-7077 (2010).
  14. Bellion, A., Baudoin, J. P., Alvarez, C., Bornens, M., Metin, C. Nucleokinesis in tangentially migrating neurons comprises two alternating phases: Forward migration of the Golgi/centrosome associated with centrosome splitting and myosin contraction at the rear. J Neurosci. 25 (24), 5691-5699 (2005).
  15. Marin, O., Valiente, M., Ge, X., Tsai, L. H. Guiding neuronal cell migrations. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (2), a001834(2010).
  16. Martini, F. J., Valdeolmillos, M. Actomyosin contraction at the cell rear drives nuclear translocation in migrating cortical interneurons. J Neurosci. 30 (25), 8660-8670 (2010).
  17. Wamsley, B., Fishell, G. Genetic and activity-dependent mechanisms underlying interneuron diversity. Nat Rev Neurosci. , (2017).
  18. Chu, J., Anderson, S. A. Development of cortical interneurons. Neuropsychopharmacology. 40 (1), 16-23 (2015).
  19. Metin, C., Baudoin, J. P., Rakic, S., Parnavelas, J. G. Cell and molecular mechanisms involved in the migration of cortical interneurons. Eur J Neurosci. 23 (4), 894-900 (2006).
  20. Hernandez-Miranda, L. R., Parnavelas, J. G., Chiara, F. Molecules and mechanisms involved in the generation and migration of cortical interneurons. ASN Neuro. 2 (2), e00031(2010).
  21. Batista-Brito, R., et al. The cell-intrinsic requirement of Sox6 for cortical interneuron development. Neuron. 63 (4), 466-481 (2009).
  22. Marcorelles, P., et al. Evidence for tangential migration disturbances in human lissencephaly resulting from a defect in LIS1, DCX and ARX genes. Acta Neuropathol. 120 (4), 503-535 (2010).
  23. McManus, M. F., Nasrallah, I. M., Pancoast, M. M., Wynshaw-Boris, A., Golden, J. A. Lis1 is necessary for normal non-radial migration of inhibitory interneurons. Am J Pathol. 165 (3), 775-784 (2004).
  24. Pancoast, M., Dobyns, W., Golden, J. A. Interneuron deficits in patients with the Miller-Dieker syndrome. Acta Neuropathol. 109 (4), 400-404 (2005).
  25. Azzarelli, R., Oleari, R., Lettieri, A., Andre, V., Cariboni, A. In Vitro, Ex Vivo and In Vivo Techniques to Study Neuronal Migration in the Developing Cerebral Cortex. Brain Sci. 7 (5), (2017).
  26. Wang, Z. Z., et al. Chemokine-like factor 1 promotes the migration of rat primary cortical neurons by the induction of actin polymerization. Neuroreport. 25 (15), 1221-1226 (2014).
  27. Zito, A., et al. Neuritin 1 promotes neuronal migration. Brain Structure and Function. 219 (1), 105-118 (2014).
  28. Rakic, S., et al. Cdk5 phosphorylation of ErbB4 is required for tangential migration of cortical interneurons. Cereb Cortex. 25 (4), 991-1003 (2015).
  29. van den Berghe, V., et al. Directed migration of cortical interneurons depends on the cell-autonomous action of Sip1. Neuron. 77 (1), 70-82 (2013).
  30. Nery, F. C., et al. New methods for investigation of neuronal migration in embryonic brain explants. J Neurosci Methods. 239, 80-84 (2015).
  31. Vidaki, M., et al. Rac1-dependent cell cycle exit of MGE precursors and GABAergic interneuron migration to the cortex. Cereb Cortex. 22 (3), 680-692 (2012).
  32. Lysko, D. E., Putt, M., Golden, J. A. SDF1 reduces interneuron leading process branching through dual regulation of actin and microtubules. J Neurosci. 34 (14), 4941-4962 (2014).
  33. Tielens, S., et al. Elongator controls cortical interneuron migration by regulating actomyosin dynamics. Cell Res. 26 (10), 1131-1148 (2016).
  34. Shinohara, R., et al. A role for mDia, a Rho-regulated actin nucleator, in tangential migration of interneuron precursors. Nat Neurosci. 15 (3), S371-372 373-380 (2012).
  35. LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cereb Cortex. 19, Suppl 1. i120-i125 (2009).
  36. De Marco Garcia, N. V., Fishell, G. Subtype-selective electroporation of cortical interneurons. J Vis Exp. (90), e51518(2014).
  37. Tobet, S. A., Hanna, I. K., Schwarting, G. A. Migration of neurons containing gonadotropin releasing hormone (GnRH) in slices from embryonic nasal compartment and forebrain. Dev Brain Res. 97 (2), 287-292 (1997).
  38. Stoppini, L., Buchs, P. -A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).
  39. Steinecke, A., Gampe, C., Valkova, C., Kaether, C., Bolz, J. Disrupted-in-Schizophrenia 1 (DISC1) is necessary for the correct migration of cortical interneurons. J Neurosci. 32 (2), 738-745 (2012).
  40. Friocourt, G., et al. Both doublecortin and doublecortin-like kinase play a role in cortical interneuron migration. J Neurosci. 27 (14), 3875-3883 (2007).
  41. Murthy, S., et al. Serotonin receptor 3A controls interneuron migration into the neocortex. Nat Commun. 5, 5524(2014).
  42. Nichols, A. J., O'Dell, R. S., Powrozek, T. A., Olson, E. C. Ex utero electroporation and whole hemisphere explants: a simple experimental method for studies of early cortical development. J Vis Exp. (74), (2013).
  43. Pacary, E., Guillemot, F. Cerebral cortex electroporation to study projection neuron migration. Curr Protoc Neurosci. 77, 2.26.21-22.26.18 (2016).
  44. Yozu, M., Tabata, H., Nakajima, K. The caudal migratory stream: A novel migratory stream of interneurons derived from the caudal ganglionic eminence in the developing mouse forebrain. J Neurosci. 25 (31), 7268-7277 (2005).
  45. Butt, S. J., et al. The requirement of Nkx2-1 in the temporal specification of cortical interneuron subtypes. Neuron. 59 (5), 722-732 (2008).
  46. Miyoshi, G., et al. Genetic fate mapping reveals that the caudal ganglionic eminence produces a large and diverse population of superficial cortical interneurons. J Neurosci. 30 (5), 1582-1594 (2010).
  47. Zerucha, T., et al. A highly conserved enhancer in the Dlx5/Dlx6 intergenic region is the site of cross-regulatory interactions between Dlx genes in the embryonic forebrain. J Neurosci. 20 (2), (2000).
  48. Bottenstein, J. E. Cell culture in the neurosciences. , Plenum Press. (1985).
  49. Wang, Y., et al. Dlx5 and Dlx6 regulate the development of parvalbumin-expressing cortical interneurons. J Neurosci. 30 (15), 5334-5345 (2010).
  50. Zheng, H., et al. Sevoflurane anesthesia in pregnant mice induces neurotoxicity in fetal and offspring mice. Anesthesiology. 118 (3), 516-526 (2013).
  51. Zhao, T., et al. Prenatal ketamine exposure causes abnormal development of prefrontal cortex in rat. Sci Rep. 6, 26865(2016).
  52. Timpe, J. M., Wang, C. Z., Kim, J., Johnson, K. M. Alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazoleproprionic acid receptor activation protects against phencyclidine-induced caspase-3 activity by activating voltage-gated calcium channels. J Neurosci Res. 92 (12), 1785-1791 (2014).
  53. Myers, A. K., Meechan, D. W., Adney, D. R., Tucker, E. S. Cortical interneurons require Jnk1 to enter and navigate the developing cerebral cortex. J Neurosci. 34 (23), 7787-7801 (2014).
  54. Lopez-Bendito, G., et al. Chemokine signaling controls intracortical migration and final distribution of GABAergic interneurons. J Neurosci. 28 (7), 1613-1624 (2008).
  55. Close, J., et al. Satb1 is an activity-modulated transcription factor required for the terminal differentiation and connectivity of medial ganglionic eminence-derived cortical interneurons. J Neurosci. 32 (49), 17690-17705 (2012).
  56. Anderson, S. A., et al. Mutations of the homeobox genes Dlx-1 and Dlx-2 disrupt the striatal subventricular zone and differentiation of late born striatal neurons. Neuron. 19 (1), 27-37 (1997).
  57. Stuhmer, T., Anderson, S. A., Ekker, M., Rubenstein, J. L. Ectopic expression of the Dlx genes induces glutamic acid decarboxylase and Dlx expression. Development. 129 (1), 245-252 (2002).
  58. Godin, J. D., et al. p27(Kip1) is a microtubule-associated protein that promotes microtubule polymerization during neuron migration. Dev Cell. 23 (4), 729-744 (2012).
  59. Rossokhin, A. V., Sharonova, I. N., Bukanova, J. V., Kolbaev, S. N., Skrebitsky, V. G. Block of GABA(A) receptor ion channel by penicillin: Electrophysiological and modeling insights toward the mechanism. Mol Cell Neurosci. 63, 72-82 (2014).
  60. Lindquist, C. E., Dalziel, J. E., Cromer, B. A., Birnir, B. Penicillin blocks human alpha 1 beta 1 and alpha 1 beta 1 gamma 2S GABAA channels that open spontaneously. Eur J Pharmacol. 496 (1-3), 23-32 (2004).
  61. Bortone, D., Polleux, F. KCC2 expression promotes the termination of cortical interneuron migration in a voltage-sensitive calcium-dependent manner. Neuron. 62 (1), 53-71 (2009).
  62. Lin-Hendel, E. G., McManus, M. J., Wallace, D. C., Anderson, S. A., Golden, J. A. Differential mitochondrial requirements for radially and non-radially migrating cortical neurons: Implications for mitochondrial disorders. Cell Rep. 15 (2), 229-237 (2016).
  63. Lourenco, M. R., Garcez, P. P., Lent, R., Uziel, D. Temporal and spatial regulation of interneuron distribution in the developing cerebral cortex--an in vitro study. Neuroscience. 201, 357-365 (2012).
  64. Mahajani, S., et al. Lamin B1 levels modulate differentiation into neurons during embryonic corticogenesis. Sci Rep. 7 (1), 4897(2017).
  65. Liodis, P., et al. Lhx6 activity is required for the normal migration and specification of cortical interneuron subtypes. J Neurosci. 27 (12), 3078-3089 (2007).
  66. Close, J. L., et al. Single-cell profiling of an in vitro model of human interneuron development reveals temporal dynamics of cell type production and maturation. Neuron. 93 (5), e1035 1035-1048 (2017).
  67. Chen, Y. J., et al. Single-cell RNA sequencing identifies distinct mouse medial ganglionic eminence cell types. Sci Rep. 7, 45656(2017).
  68. Michaud, J. L., et al. The genetic landscape of infantile spasms. Hum Mol Genet. 23 (18), 4846-4858 (2014).
  69. Allen, A. S., et al. De novo mutations in epileptic encephalopathies. Nature. 501 (7466), 217-221 (2013).
  70. Bery, A., Merot, Y., Retaux, S. Genes expressed in mouse cortical progenitors are enriched in Pax, Lhx, and Sox transcription factor putative binding sites. Brain Res. 1633, 37-51 (2016).
  71. Nelson, B. R., Hodge, R. D., Bedogni, F., Hevner, R. F. Dynamic interactions between intermediate neurogenic progenitors and radial glia in embryonic mouse neocortex: potential role in Dll1-Notch signaling. J Neurosci. 33 (21), 9122-9139 (2013).
  72. Simon, R., et al. A dual function of Bcl11b/Ctip2 in hippocampal neurogenesis. EMBO J. 31 (13), 2922-2936 (2012).
  73. Venkataramanappa, S., Simon, R., Britsch, S. Ex utero electroporation and organotypic slice culture of mouse hippocampal tissue. J Vis Exp. (97), (2015).
  74. Machacek, M., et al. Coordination of Rho GTPase activities during cell protrusion. Nature. 461 (7260), 99-103 (2009).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

נדידת נוירונים ביניהיים GABAergicמוח עכברי עוברידימוי קונפוקאלי בשיטת Time-lapseשחזור נוירונליהבליטה הגנגליונית המדיאלית (Medial Ganglionic Eminence)חיתוך קורונליהטמעה באגרוזחיתוך בוויברטום
. פשוט תאכל לשעבר אלקטרופורציה ותרבויות פרוסה Organotypic מוח עובריים בעכבר עבור Live-הדמיה של העברת Interneurons GABAergic
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.