Method Article

ויזואליזציה של האקסון מנוע והניווט כימות של האקסון Arborization של העוברים העכבר באמצעות מיקרוסקופ אור גיליון קרינה פלואורסצנטית

DOI:

10.3791/57546

⸱

May 11th, 2018

 ,  , 
1Molecular and Cell Biology, Taiwan International Graduate Program, Academia Sinica and Graduate Institute of Life Sciences, National Defense Medical Center, 2Institute of Molecular Biology, Academia Sinica, 3Institute of Biotechnology, College of Bio-Resources and Agriculture, National Taiwan University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מתארים את פרוטוקול להמחשת הקרנה מוטור נוירון, האקסון arborization ב הטרנסגניים Hb9::GFP העכבר עוברי. לאחר immunostaining עבור מוטורי לגלוקוז, השתמשנו גיליון אור זריחה מיקרוסקופ כדי התמונה עוברי עבור ניתוח כמותי עוקבות. פרוטוקול זה חל תהליכים ניווט אחרים תא עצב במערכת העצבים המרכזית.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בעמוד השדרה מוטורי לגלוקוז (MNs) להרחיב את האקסונים שלהם לתקשר עם המטרות innervating שלהם, ובכך שליטה התנועה ועל משימות מורכבות גולגולת. לפיכך, חיוני לחשוף את המנגנונים המולקולריים של איך מנוע אקסונים לנווט, arborize ו innervate השרירים ההיקפיים שלהם מטרות במהלך התפתחות והתנוונות. למרות הטרנסגניים קווים העכבר Hb9::GFP שירתו זמן לדמיין מסלולים מוטוריים האקסון במהלך התפתחות עובריים, תיאורים מפורטים של הקשת של האקסון arborization מסוף להישאר שלם בשל המורכבות דפוס ו מגבלות של מיקרוסקופ אופטי הנוכחי. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול משופרת המשלבת אור גיליון פלורסצנטיות מיקרוסקופ (LSFM) וניתוח תמונות איכותית, באופן כמותי להמחיש פיתוח אקסונים מוטוריים. מערכת זו יכולים לאמץ בקלות לעבור מוטציות גנטיות או MN מודלים מחלה עם קווים Hb9::GFP , חשיפת המנגנונים המולקולריים הרומן להוביל לפגמים האקסון מנוע ניווט ו- arborization.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MNs בעמוד השדרה הם החלק של מערכת העצבים המרכזית אך innervate השרירים ההיקפיים בקרת תנועה. בחוט השדרה המתפתח, MN אבות (pMNs) נקבעו על פי האותות שמקורם מיתר הגב של somites הסמוך. כל הבדיל MNs mitotic שלאחר מכן מופקים מן pMNs, בסופו של דבר והוליד סדרה של MN יחוברו לאורך ציר rostrocaudal של חוט השדרה1,2. MNs בעמוד השדרה מאורגנים טופוגרפית, גם מבחינה אנטומית. הסידור שלהם מורפולוגי בקורלציה עם המיקום החדש של יעד בהתאמה שלהם של הפריפריה3. כשמגיעים ממטרותיהם שריר, אקסונים לקבל גורמים neurotrophic הסלולר ואת אקסוגני לגרום להם להרחיב, סניף נוסף לתוך השרירים. העצבוב של פגמים מסעף עשוי לתרום הכשל כדי ליצור צמתי neuromuscular (NMJ). לדוגמה, גליה, נגזר neurotrophic גורמים (GDNF)-Pea3 המושרה היא הכרחית עבור אקסון arborization אל תוך עורית מקסימוס (ס מ), שרירי הגב הרחיב (LD)4,5. בנוסף, דיין נוקאאוט העכבר עוברי מראים arborization פגומים של עצבים הסרעפת הסרעפת, גורם לכשל נשימתי ותמותה מיד לאחר הלידה6,7. לכן, זה הצעד האחרון של התבגרות MN (קרי, הקרנה עצב ומסעף) היא קריטית כדי להבטיח תקשורת בין נוירונים ותאי המטרה.

כדי להציג דפוסים arborization, חוקרים התנהגות בדרך כלל קונאפוקלית לדימות או מיקרוסקופ אור שני הפוטונים זריחה של דגימות משרטוטי או כולה-הר8,9,10. שתי טכניקות מיקרוסקופית אלו יוצרות מקובל הרזולוציה ועומק חדירה. מיקרוסקופ אור שני הפוטונים פלורסצנטיות כרוך עירור של fluorophores על ידי סימולטני קליטת פוטונים נמוכה יותר של אנרגיה שני11. מאז שני הפוטונים עירור משתמשת קרינה אינפרא אדום, התדר ירד עירור תורמת פיזור מופחתת, חדירה יותר רקמות עד 1 מ מ בתוך הרקמה, ובכך מאפשר הדמיה עם עומק גדול. מיקרוסקופיה קונפוקלית מסירה על-ידי מסנני out-of-להתמקד מאותת ולא רק אוסף אור בתוך מטוס מוקד12. עם גישה זו, ניתן לשלב תמונות של דגימות מטוסים מוקד שונים כדי לייצר תמונת תלת מימד (3D) באמצעות פונקציה Z-מחסנית. עם זאת, עוצמת האות פוחת כמו רוב האור נחסם ולאחר פתחים מספרית גבוהה מטשטשים את העומק השדה. חשוב מכך, בשתי הטכניקות לתרום נזקי חמור ואת phototoxicity מאז הדגימה כל מקבל תאורה גם כאשר המטוס היחיד הוא עם תמונה בזמן נתון.

כדי לעקוף חסרונות אלה, LSFM הפך חלופה המועדף, עם היתרונות של להיות מהיר, אור-יעיל, פחות פוטוטוקסי13,14. בנוסף, LSFM מאפשר הדמיה multi-view. גישה זו מתאימה במיוחד כדי להמחיש אקסונים מוטוריים ומסופי לפיזור שלהם כפי הם התפשטו בחלל תלת-ממד. LSFM outperforms שתי האפשרויות האחרות כי דגימות הם רכובים על במה המאפשרת סיבוב סביב ציר אנכי ותנועות לאורך x, y ו- z. זה לא רק מאפשר תצוגה חסומים מינימלית של המדגם, אלא גם הבחירה של נתיב רצויה תאורה, חסרונה של מיקרוסקופ שני הפוטונים, וידאו, אשר שניהם דורשים הרכבה של דגימות בשקופית שטוח. לכן, LSFM הוא הכלי המתאים ביותר עבור הדמיה תלת-ממדית של האקסון arborization, כימות של עצבים מוטוריים המסופים העכבר עוברי.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל החיות חי הוחזקו במתקן פתוגן מסוים חינם (SPF) בעלי חיים, אושרה ומנוהלת על ידי IACUC של האקדמיה Sinica.

1. קיבוע

  1. לאסוף את העוברים מתחלקים היום 12.5 (E12.5) ואז לערוף, המעיים אותם.
  2. את העוברים בנפרד ב- 24-ובכן צלחות עם 1 מ"ל/טוב של paraformaldehyde המוכנים באופן טרי 4% 1 x פוספט מאגר תמיסת מלח (PBS) בן לילה. דגירה-4 מעלות צלזיוס על מטרף.
  3. לשטוף את העוברים קבוע לפחות 3 x, כל אחד למשך 5-10 דקות, עם 1 מ"ל של PBS 1 x, דגירה בין לילה ב 4 ° C-מטרף כדי להסיר את paraformaldehyde שיורית.

2. כולה-הר Immunostaining

  1. Permeabilize כל העובר ב 1 מ"ל של 0.5% PBS-טריטון-X-100 (PBST) בן לילה-4 מעלות צלזיוס על מטרף.
  2. לחסום כל דגימה עם 1 מ"ל של 10% FBS המבושלות 1 x PBS בן לילה-4 מעלות צלזיוס על מטרף.
  3. דגירה העובר עם 1 מ"ל של נוגדן anti-GFP הראשי (1:1, 000 דילול ב 10% FBS) ב 4 מעלות צלזיוס במשך 72 h ברעידות תמידי להעצים את האות ה-GFP של העצבים המוטוריים.
  4. לאחר הדגירה נוגדן ראשוני, לשטוף עם 1 מ"ל של 0.5% PBST במהלך 1-2 ימים ב- 4 מעלות צלזיוס על מטרף, שינוי של 0.5% PBST לפחות שלוש פעמים.
  5. החל מ ל 1 של נוגדנים משניים (1:1, 000 דילול ב 10% FBS) דגירה בין לילה בחושך ב 4 ° C עם טלטול מתמיד.
  6. לשטוף 3 x 1 מ של 0.5% PBST ב 4 ° C-מטרף במשך 2-3 ימים. לשמור דגימות ב- 1 x PBS ב 4 ° C עד יום לפני הדמיה.
    הערה: יכול להיות גזור עוברי למקטעים קטנים יותר לפני ניקוי, בהתאם ידומה חלק העוברים. Forelimbs נשמרים בגישה ניסויית זו (איור 1 א').
  7. דגירה העובר ריאגנט ניקוי מסחרי עם מדד השבירה nD 1.49 צינור 1.5 mL, מוגן מפני אור בטמפרטורת החדר למשך הלילה, כדי להבהיר את העובר שקוף עבור הדמיה.
    הערה: הנפח של ניקוי הכימית היא כ חמש פעמים של אמצעי האחסון מדגם.

3. LSFM (2-3 שעות)

  1. דוגמה הגדרת
    1. להגדיר 5 X / 0.1 אופטיקה תאורה ו- 5 X / 0.16 זיהוי אופטיקה. להרכיב את בעל מדגם ואת מדגם נים (1.5 מ מ קוטר פנימי, ירוק) ולמקם אותם לתוך המיקרוסקופ.
      הערה: עיין במדריך ההפעלה של המיקרוסקופ להליכי הגדרת נתונים היסטוריים.
    2. הר העובר כדלקמן:
      1. להכין את הטיפ פיפטה P200 על ידי חיתוך של החלק העליון כך שיתאים הקוטר של נים ולהסיר את החלק המחודד (~ 3 מ מ) עבור הקובץ המצורף הדגימה.
      2. ממיסים הסוף קהות של קצה פיפטה באמצעות להבה קטנה.
      3. לכבות את הלהבה וצרף במהירות את העובר אנכית על קצה מומסת.
      4. להתאים את החלק העליון של קצה פיפטה עם נימי המדגם.
    3. לאפשר המאגר קאמרית equilibrate עם העובר במשך 1 דקה לנקות את הלכלוך או בועות.
    4. שימוש בתוכנת הדמיה, לבחור אתר נימי תחת הכרטיסיה אתר ולכוונן x, y, z צירים כדי למקם את נימי הדגימה.
    5. בחר אתר לדוגמה , םוז 0.6 X להתמקד על העובר. לסובב את העובר כדי להבטיח כי לציר הארוך של האיבר שבעורך מיישר בנתיב האור של שני מקורות אור (איור 1B).
  2. ייבוא תמונות
    1. תחת הלשונית רכישה , להגדיר את הפרמטרים נתיב האור כגון זיהוי מטרות, לייזר חסימה מסנן קרן הפיצול, מצלמות, לייזרים.
      הערה: ערוץ ה-GFP משמש בניסוי זה (אורך גל עירור: 488 ננומטר; מסנן פליטה: BP 505 כדי 545 ננומטר, קרן ספליטר: SPS LP 560).
    2. בדוק את תיבת הסימון סרוק pivot להפחתת צל.
    3. תורדגהה רכישה: קצת עומק, 16 סיביות; זום, 0.36-0.7 X; תאורה יחיד לצד (ימין/שמאל) או תאורה כפולה בצד.
    4. לחץ על רציף ולהגדיר את עוצמת הלייזר, זמן החשיפה, עוצמת הלייזר, והמיקום אור גיליון לרכוש תמונות חדות יותר.
      הערה: עוצמת הלייזר נשמרת נמוך ככל האפשר למזער את נזקי.
    5. הקש להפסיק לשים קץ ייבוא תמונות.
  3. רכישת רב-ממדי
    1. להגדיר את z-המחסנית על-ידי הזזת את מיקום Z עבור התמונה הראשונה והאחרונה. לחץ אופטימלית כדי להגדיר את המספר פרוסה.
    2. לחץ על ניסוי להתחיל לרכוש את z-אוסף התמונות שנבחר.
    3. כאשר זה נעשה, לשמור את התמונה בתבנית .czi.
  4. עיבוד תמונה (לא חובה)
    1. להמשיך עם פיוז'ן הצדדיים הכפולים תחת בערוץ Lightsheet עיבוד אם תאורה כפולה בצד מוחל. Multiview עיבוד הכרחי אם תצוגות מרובות של נרכשים לשלב תמונות מזוויות מרובות.
    2. ליצור תמונה דו-ממדית באמצעות נתוני הפיקסלים בעוצמה הגבוהה ביותר לאורך ציר הטלה תחת בערוץ הטלה בעוצמה המרבית .
    3. תחת ערוץ ההעתקה , לחץ על ערכת משנה כדי לבחור קבוצות משנה של תמונות מתוך הסט המקורי.

4. כימות של האקסון Arborization (30 דקות עבור כל עצב בודדים)

  1. לפתוח את קובץ התמונה בתוכנת ניתוח ההדמיה (כברירת מחדל, התמונה הכוללת את נתוני XYZ נפתח במצב Surpass ולא כתצוגה 3D שניתנו).
  2. להתאים את צבע התמונה, בהירות, וניגודים שימוש בחלון התצוגה התאמה (עריכה | התאמת תצוגת הצג) כדי לזהות חוטים בהתבסס על עוצמת המקומי חדות.
  3. לחץ על הסמל הוספת חוטים חדש ובחר את אלגוריתם Autopath (לא הלולאה) בתפריט הנפתח.
  4. בחר את האזור בעל עניין (במקרה זה, האקסון segmenting עניין). לחץ על הבא לאחר סיום.
  5. להגדיר את מתחילה, הזרעים נקודות על-ידי הקצאת המדידות בקוטר הגדול, הדק, אשר ניתן למדוד באמצעות מצב פרוסה .
  6. הקצאת נקודת התחלה בקצה של האזור בעל עניין. כדי להשיג ידנית בהוספה ובהסרה של נקודות התחלה, קודם לשנות את מצב המצביע (ניווט | בחר) ולאחר מכן Shift + לחיצה ימנית על נקודות עניין.
  7. בחר ספי ידנית הזרעים נקודות להבטיח כי כל arborization גלוי מסומן. לשנות את מצב המצביע (ניווט | בחר) ולאחר מכן Shift + שמאל לחץ בנקודות עניין כדי להוסיף או להסיר את הזרעים נקודות באופן ידני.
    הערה: חשוב להסיר באופן ידני רעשי רקע, אותות מרוב עצבים סמוכים.
  8. סמן את התיבה להסיר את הזרעים נקודות סביב כנקודות התחלה.
  9. בדוק הסר מנותק מקטעים כדי לאפשר אי-הכללה של נקודות זה רחוק מדי, זה עשוי לייצג את רעשי הרקע. ציין את האורך המרבי של הפער בשלב הבא כדי להגדיר את הגבול העליון עבור אי-הכללה.
  10. התאם את הסף עבור רקע חיסור, אשר משתמש מסנן לפי עקומת גאוס כדי להעריך את עוצמת רקע voxel בכל.
  11. לקבוע סף אוטומטי בקוטר דנדריט באמצעות האלגוריתם שטח חתך משוער .
  12. דלג על השלבים לחישוב עמוד השדרה.
  13. לסיום התהליך ובחרו את הסגנון הרצוי וצבע.
  14. בטל את סימון התיבה נפח מאפיינים כדי להציג רק את האקסונים המשוחזרת.
  15. תחת הכרטיסיה סטטיסטיקה , בחר מפורט. השתמש נימה לא. דנדריט מסוף נקודות לכמת את מסופי עצבים מוטוריים כמחוון של האקסון מנוע arborization.
    הערה: ביאור סטטיסטי ניתן להוסיף במידת הצורך.
  16. לייצא את התמונה של האקסון המשוחזרת כקובץ. tif.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LSFM מספק לוויזואליזציה תלת-ממדית מפורטת של מסלול MN arborization האקסון עכבר עוברי. תחת שדה בהיר, רקמות מופיעים שקוף לחלוטין לאחר להיות שקוע בתוך הכימית ניקוי מסחרי. אין התכווצות או נפיחות של המדגם היה לב אחרי שבוע אחד עד אחסון ניקוי ריאגנט לפני הדמיה. תחת קרינה פלואורסצנטית ערוץ, מוטורי לגלוקוז מסומנות עם GFP transgenically ביטוי (1 סרטים). במקרה כלשהו, נחשפו פרטים של המבנה האקסון. לדוגמה, באיור 2 מייצג הדמיה באיכות נמוכה. מספר גורמים יכולי...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מספר צעדים בפרוטוקול עלולים להיות נתונים לשינויים בנסיבות מסוימות. לדוגמה, משך הזמן של קיבעון תלוי גיל העוברים, משתנה מ- 2 h ימים 1 או יותר באמצעות paraformaldehyde טריים. מאז קיבוע מבוצע לפני כל הר immunostaining, עבור נוגדנים הרגישים crosslinking חלבון, מתנול יכול לשמש כסוכן מקבע חלופי. עבור יחס אות לרעש גבוה עם כתמים, זה הכרחי כדי למטב את הריכוז דטרגנט (בין 0.1-0.5%). צעדים נוספים כביסה לפני ואחרי נוגדן הדגירה יכול גם להגדיל את יחס אות לרעש. בנוסף, צעד ניקוי רקמות חשוב להבטיח נתיב האור החסימה לאורך כל התחזיות עצב עמוק...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LSFM ניסויים וניתוח נתונים בוצעו באופן חלקי באמצעות מיקרוסקופים אופטיים מתקדמים של חלוקה של כלי השירות Sinica אקדמיה, בסיועם של גברת שו-חן שן. אנו מודים גב' סו-פינג לי מהספינה הדמיה הליבה מתקן של IMB לסיוע טכני ניכר עם ניתוח תמונות Imaris. הליבה של IMB המדעית עריכה עברית סקרו את כתב היד. עבודה זו ממומן על ידי האקדמיה Sinica הקריירה פיתוח פרס (CDA-107-L05) ביותר (104-2311-B-001-030-MY3), NHRI (NHRI-EX106-10315NC).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Hb9::GFPמעבדת ג'קסון005029לאסוף עוברים של יום עוברי 12.5 (E12.5)
4% פרפורמלדהיד (PFA)עבור 200 מ"ל: הוסף 20 מ"ל 10X PBS, 8 גרם PFA ב-ddH2O. התאם את ה-pH ל-7.4 עם NaOH (10N). מסננים, מעקרים ומאחסנים בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
מלח פוספט 10X (PBS 10X)עבור 1 ליטר: הוסף 80 גרם NaCl, 2 גרם KCl, 14.4 גרם Na2HPO4, 2.4 גרם KH2PO4 ומלא ב-ddH2O. חיטוי ואחסון ב-RT.
Triton X-100SigmaX100-500ML
סרום בקר עובריThermoFisher26140079
כבשים פוליקלונלי אנטי-GFPAbD Serotec4745-10511:1000
Alexa Fluor 488 חמור נגד כבשיםInvitrogenA-110151:1000
RapiClear 1.49 מגיב ניקויSunJin LabRC149001
1.5 מ"ל מיקרו צינור Sarstedt72.690.001
24 בארות צלחתThermoFisher142475
5 SA פינצטהאידיאלי-טק3480641
איריס מספריים סטריאט חד / חדAesculapBC110R
מיקרוכירורגיה אזמלים, לשימוש חד פעמיAesculapBA365
ניתוח מיקרוסקופניקוןSMZ800
שייקרTKSRS-01
גיליון אור Z.1 מיקרוסקופקרל זייס מיקרוסקופיה
Imaris 8.4.0 תוכנת ניתוח תמונותBitplane, ציריך, שוויץ
B6.Cg-Tg(Hlxb9-GFP)1Tmj/J (Hb9::עכברי GFP)מעבדת ג'קסון005029
מי

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Davis-Dusenbery, B. N., Williams, L. A., Klim, J. R., Eggan, K. How to make spinal motor neurons. Development. 141, 491-501 (2014).
  2. Stifani, N. Motor neurons and the generation of spinal motor neuron diversity. Front Cell Neurosci. 8, 293(2014).
  3. Kania, A., Jessell, T. M. Topographic motor projections in the limb imposed by LIM homeodomain protein regulation of ephrin-A:EphA interactions. Neuron. 38, 581-596 (2003).
  4. Livet, J., et al. ETS gene Pea3 controls the central position and terminal arborization of specific motor neuron pools. Neuron. 35, 877-892 (2002).
  5. Kanning, K. C., Kaplan, A., Henderson, C. E. Motor neuron diversity in development and disease. Annu Rev Neurosci. 33, 409-440 (2010).
  6. Matsumoto, S., Kiryu-Seo, S., Kiyama, H. Motor Nerve Arborization Requires Proteolytic Domain of Damage-Induced Neuronal Endopeptidase (DINE) during Development. J Neurosci. 36, 4744-4757 (2016).
  7. Nagata, K., et al. ECEL1 mutation implicates impaired axonal arborization of motor nerves in the pathogenesis of distal arthrogryposis. Acta Neuropathol. 132, 111-126 (2016).
  8. Catela, C., Shin, M. M., Lee, D. H., Liu, J. P., Dasen, J. S. Hox Proteins Coordinate Motor Neuron Differentiation and Connectivity Programs through Ret/Gfralpha Genes. Cell Rep. 14, 1901-1915 (2016).
  9. Bonanomi, D., et al. Ret is a multifunctional coreceptor that integrates diffusible- and contact-axon guidance signals. Cell. 148, 568-582 (2012).
  10. Tung, Y. T., et al. Mir-17 approximately 92 Governs Motor Neuron Subtype Survival by Mediating Nuclear PTEN. Cell Rep. 11, 1305-1318 (2015).
  11. Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).
  12. Jonkman, J., Brown, C. M. Any Way You Slice It-A Comparison of Confocal Microscopy Techniques. J Biomol Tech. 26, 54-65 (2015).
  13. Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists. Nat Methods. 12, 30-34 (2015).
  14. Santi, P. A. Light sheet fluorescence microscopy: a review. J Histochem Cytochem. 59, 129-138 (2011).
  15. Hanley, O., et al. Parallel Pbx-Dependent Pathways Govern the Coalescence and Fate of Motor Columns. Neuron. 91, 1005-1020 (2016).
  16. De Marco Garcia, N. V., Jessell, T. M. Early motor neuron pool identity and muscle nerve trajectory defined by postmitotic restrictions in Nkx6.1 activity. Neuron. 57, 217-231 (2008).
  17. Li, C. J., et al. MicroRNA filters Hox temporal transcription noise to confer boundary formation in the spinal cord. Nat Commun. 8, 14685(2017).
  18. Swoger, J., Pampaloni, F., Stelzer, E. H. Light-sheet-based fluorescence microscopy for three-dimensional imaging of biological samples. Cold Spring Harb Protoc. 2014, 1-8 (2014).
  19. Pantazis, P., Supatto, W. Advances in whole-embryo imaging: a quantitative transition is underway. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 327-339 (2014).
  20. Reynaud, E. G., Tomancak, P. Meeting report: first light sheet based fluorescence microscopy workshop. Biotechnol J. 5, 798-804 (2010).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Motor Axon NavigationLight Sheet MicroscopyAxon ArborizationMouse EmbryosHb9 GFP MiceImage Analysis SoftwareFilament QuantificationSample ClearingAntibody IncubationZ Stack Acquisition

Related Articles