Method Article

ויזואליזציה של האקסון מנוע והניווט כימות של האקסון Arborization של העוברים העכבר באמצעות מיקרוסקופ אור גיליון קרינה פלואורסצנטית

DOI:

10.3791/57546

⸱

May 11th, 2018

 ,  , 
1Molecular and Cell Biology, Taiwan International Graduate Program, Academia Sinica and Graduate Institute of Life Sciences, National Defense Medical Center, 2Institute of Molecular Biology, Academia Sinica, 3Institute of Biotechnology, College of Bio-Resources and Agriculture, National Taiwan University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מתארים את פרוטוקול להמחשת הקרנה מוטור נוירון, האקסון arborization ב הטרנסגניים Hb9::GFP העכבר עוברי. לאחר immunostaining עבור מוטורי לגלוקוז, השתמשנו גיליון אור זריחה מיקרוסקופ כדי התמונה עוברי עבור ניתוח כמותי עוקבות. פרוטוקול זה חל תהליכים ניווט אחרים תא עצב במערכת העצבים המרכזית.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בעמוד השדרה מוטורי לגלוקוז (MNs) להרחיב את האקסונים שלהם לתקשר עם המטרות innervating שלהם, ובכך שליטה התנועה ועל משימות מורכבות גולגולת. לפיכך, חיוני לחשוף את המנגנונים המולקולריים של איך מנוע אקסונים לנווט, arborize ו innervate השרירים ההיקפיים שלהם מטרות במהלך התפתחות והתנוונות. למרות הטרנסגניים קווים העכבר Hb9::GFP שירתו זמן לדמיין מסלולים מוטוריים האקסון במהלך התפתחות עובריים, תיאורים מפורטים של הקשת של האקסון arborization מסוף להישאר שלם בשל המורכבות דפוס ו מגבלות של מיקרוסקופ אופטי הנוכחי. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול משופרת המשלבת אור גיליון פלורסצנטיות מיקרוסקופ (LSFM) וניתוח תמונות איכותית, באופן כמותי להמחיש פיתוח אקסונים מוטוריים. מערכת זו יכולים לאמץ בקלות לעבור מוטציות גנטיות או MN מודלים מחלה עם קווים Hb9::GFP , חשיפת המנגנונים המולקולריים הרומן להוביל לפגמים האקסון מנוע ניווט ו- arborization.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MNs בעמוד השדרה הם החלק של מערכת העצבים המרכזית אך innervate השרירים ההיקפיים בקרת תנועה. בחוט השדרה המתפתח, MN אבות (pMNs) נקבעו על פי האותות שמקורם מיתר הגב של somites הסמוך. כל הבדיל MNs mitotic שלאחר מכן מופקים מן pMNs, בסופו של דבר והוליד סדרה של MN יחוברו לאורך ציר rostrocaudal של חוט השדרה1,2. MNs בעמוד השדרה מאורגנים טופוגרפית, גם מבחינה אנטומית. הסידור שלהם מורפולוגי בקורלציה עם המיקום החדש של יעד בהתאמה שלהם של הפריפריה3. כשמגיעים ממטרותיהם שריר, אקסונים לקבל גורמים neurotrophic הסלולר ואת אקסוגני לגרום להם להרחיב, סניף נוסף לתוך השרירים. העצבוב של פגמים מסעף עשוי לתרום הכשל כ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל החיות חי הוחזקו במתקן פתוגן מסוים חינם (SPF) בעלי חיים, אושרה ומנוהלת על ידי IACUC של האקדמיה Sinica.

1. קיבוע

  1. לאסוף את העוברים מתחלקים היום 12.5 (E12.5) ואז לערוף, המעיים אותם.
  2. את העוברים בנפרד ב- 24-ובכן צלחות עם 1 מ"ל/טוב של paraformaldehyde המוכנים באופן טרי 4% 1 x פוספט מאגר תמיסת מלח (PBS) בן לילה. דגירה-4 מעלות צלזיוס על מטרף.
  3. לשטוף את העוברים קבוע לפחות 3 x, כל אחד למשך 5-10 דקות, עם 1 מ"ל של PBS 1 x, דגירה בין לילה ב 4 ° C-מטרף כדי להסיר את paraformaldehyde שיורית.

2. כולה-הר Immunostaining

  1. Permeabilize כל העובר ב 1 מ"ל של 0.5% PBS-טריטון-X-100 (PBST) בן ל....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LSFM מספק לוויזואליזציה תלת-ממדית מפורטת של מסלול MN arborization האקסון עכבר עוברי. תחת שדה בהיר, רקמות מופיעים שקוף לחלוטין לאחר להיות שקוע בתוך הכימית ניקוי מסחרי. אין התכווצות או נפיחות של המדגם היה לב אחרי שבוע אחד עד אחסון ניקוי ריאגנט לפני הדמיה. תחת קרינה פלואורסצנטית ערוץ, מוטורי לגלוקוז מסומנות עם GFP transgenically ביטוי (1 סרטים). במקרה כלשהו, נחשפו פרטים של המבנה האקסון. לדוגמה, באיור 2 מייצג הדמיה באיכות נמוכה. מספר גורמים יכולי.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מספר צעדים בפרוטוקול עלולים להיות נתונים לשינויים בנסיבות מסוימות. לדוגמה, משך הזמן של קיבעון תלוי גיל העוברים, משתנה מ- 2 h ימים 1 או יותר באמצעות paraformaldehyde טריים. מאז קיבוע מבוצע לפני כל הר immunostaining, עבור נוגדנים הרגישים crosslinking חלבון, מתנול יכול לשמש כסוכן מקבע חלופי. עבור יחס אות לרעש גבוה עם כתמים, זה הכרחי כדי למטב את הריכוז דטרגנט (בין 0.1-0.5%). צעדים נוספים כביסה לפני ואחרי נוגדן הדגירה יכול גם להגדיל את יחס אות לרעש. בנוסף, צעד ניקוי רקמות חשוב להבטיח נתיב האור החסימה לאורך כל התחזיות עצב עמוק.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LSFM ניסויים וניתוח נתונים בוצעו באופן חלקי באמצעות מיקרוסקופים אופטיים מתקדמים של חלוקה של כלי השירות Sinica אקדמיה, בסיועם של גברת שו-חן שן. אנו מודים גב' סו-פינג לי מהספינה הדמיה הליבה מתקן של IMB לסיוע טכני ניכר עם ניתוח תמונות Imaris. הליבה של IMB המדעית עריכה עברית סקרו את כתב היד. עבודה זו ממומן על ידי האקדמיה Sinica הקריירה פיתוח פרס (CDA-107-L05) ביותר (104-2311-B-001-030-MY3), NHRI (NHRI-EX106-10315NC).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Hb9::GFPמעבדת ג'קסון005029לאסוף עוברים של יום עוברי 12.5 (E12.5)
4% פרפורמלדהיד (PFA)עבור 200 מ"ל: הוסף 20 מ"ל 10X PBS, 8 גרם PFA ב-ddH2O. התאם את ה-pH ל-7.4 עם NaOH (10N). מסננים, מעקרים ומאחסנים בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
מלח פוספט 10X (PBS 10X)עבור 1 ליטר: הוסף 80 גרם NaCl, 2 גרם KCl, 14.4 גרם Na2HPO4, 2.4 גרם KH2PO4 ומלא ב-ddH2O. חיטוי ואחסון ב-RT.
Triton X-100SigmaX100-500ML
סרום בקר עובריThermoFisher26140079
כבשים פוליקלונלי אנטי-GFPAbD Serotec4745-10511:1000
Alexa Fluor 488 חמור נגד כבשיםInvitrogenA-110151:1000
RapiClear 1.49 מגיב ניקויSunJin LabRC149001
1.5 מ"ל מיקרו צינור Sarstedt72.690.001
24 בארות צלחתThermoFisher142475
5 SA פינצטהאידיאלי-טק3480641
איריס מספריים סטריאט חד / חדAesculapBC110R
מיקרוכירורגיה אזמלים, לשימוש חד פעמיAesculapBA365
ניתוח מיקרוסקופניקוןSMZ800
שייקרTKSRS-01
גיליון אור Z.1 מיקרוסקופקרל זייס מיקרוסקופיה
Imaris 8.4.0 תוכנת ניתוח תמונותBitplane, ציריך, שוויץ
B6.Cg-Tg(Hlxb9-GFP)1Tmj/J (Hb9::עכברי GFP)מעבדת ג'קסון005029
מי

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Davis-Dusenbery, B. N., Williams, L. A., Klim, J. R., Eggan, K. How to make spinal motor neurons. Development. 141, 491-501 (2014).
  2. Stifani, N. Motor neurons and the generation of spinal motor neuron diversity. Front Cell Neurosci. 8, 293(2014).
  3. Kania, A., Jessell, T. M.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Motor Axon NavigationLight Sheet MicroscopyAxon ArborizationMouse EmbryosHb9 GFP MiceImage Analysis SoftwareFilament QuantificationSample ClearingAntibody IncubationZ Stack Acquisition

Related Articles