Method Article

לחקור את השורש Microbiome: שליפת נתונים הקהילה חיידקי מן האדמה, Rhizosphere, Endosphere שורש

DOI:

10.3791/57561

⸱

May 2nd, 2018

 ,  ,  , 
1Department of Plant and Microbial Biology, University of California, Berkeley, 2Plant Gene Expression Center, USDA ARS

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מתארים את פרוטוקול להשיג אמפליקון רצף נתונים של קרקע, rhizosphere, microbiomes endosphere השורש. מידע זה יכול לשמש כדי לחקור את הרכב ואת הרב-גוניות של צמח-הקשורים קהילות מיקרוביאלי, מתאים לשימוש עם מגוון רחב של מיני צמחים.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

האינטראקציה אינטימי בין המארח צמחים ומיקרואורגניזמים המשויך הוא קריטי לקביעת כושר צמח, שיכול לטפח עמידות משופרת בפני והאביוטיים לחצים ומחלות. ככל microbiome הצמח יכול להיות מאוד מורכבות, בעלות נמוכה, תפוקה גבוהה שיטות כמו מבוססי אמפליקון רצף של הגן rRNA מטוסי אף-16 לעיתים קרובות המועדפת על אפיון הרכב מיקרוביאלי והמגוון שלה. עם זאת, הבחירה של המתודולוגיה המתאימה כאשר עורכים ניסויים אלה חיוני להפחתת הטיות שיכולים לעשות ניתוח והשוואות בין מחקרים ודוגמאות קשה. פרוטוקול זה מתאר בפירוט מתודולוגיה מתוקננת מספקת כדי להפוך את אוסף מן האדמה, rhizosphere, ודוגמאות שורש החילוץ של ה-DNA. בנוסף, אנחנו לסמן קו 16 ומבוססת rRNA אמפליקון רצף צינור המאפשר עבור חקר ההרכב של קהילות חיידקי בדגימות אלה, ולא ניתן להתאים בקלות עבור גנים סמן אחרים. צינור זה אומתה למגוון רחב של מיני צמחים, כולל סורגום, תירס, חיטה, תות שדה, אגבה, והוא יכול לעזור להתגבר על בעיות הקשורות לזיהום של צמח organelles.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

צמח-הקשורים microbiomes מורכב דינאמי ומורכב קהילות מיקרוביאלית של חיידקים ארכאונים, וירוסים, פטריות, מיקרואורגניזמים אחרים האיקריוטים. בנוסף תפקידם למד היטב בגרימת מחלות צמחים, חיידקים הקשורים צמח יכול גם להשפיע לטובה על בריאות הצמח על ידי שיפור עמידות בפני לחצים ביוטיים, והאביוטיים קידום זמינות חומרי הזנה, שיפור צימוח דרך הייצור של phytohormones. מסיבה זו, קיים עניין מיוחד באפיון taxa מקשר עם הצמח שורש endospheres, rhizospheres את האדמה שמסביב. בעוד כמה חיידקים יכולים להיות בתרבית בבידוד במדיה שנוצר מעבדה, רבים לא ניתן, בין השאר כי הם עשויים מסתמכים על יחסי סימביוזה עם חיידקים אחרים, גדלים באיטיות, או דורשים תנאים שלא ניתן לשכפל בסביבת מעבדה. בגלל זה עוקף את הצורך בטיפוח והוא יחסית זול, תפוקה גבוהה, המבוססת על רצף פילוגנטי פרופיל של דגימות מיקרוביאלי סביבתיים הקשורים מארח הפכה שיטה מועדפות assaying קהילת חיידקים ההרכב.

הבחירה של טכנולוגיות רצף המתאימים שסופקו על-ידי שונים הדור הבא רצף פלטפורמות (הגדרות)1 היא תלויה צורכי המשתמשים, עם גורמים חשובים כולל: כיסוי הרצוי, אורך אמפליקון, צפוי הקהילה גיוון, כמו גם קביעת רצף שיעור שגיאה באורך לקריאה, את העלות-לכל-ההפעלה/megabase. משתנה נוסף צריך להיחשב בניסויים מבוססי אמפליקון רצף הוא ג'ין מה הגברה מה תחל לשמש. בעת תכנון או בחירת צבעי בסיס, חוקרים נאלצים לעיתים קרובות לבצע עיסקאות חליפין בין האוניברסליות של הגברה הרזולוציה בטקסונומיה השגה מ amplicons שנוצר. מסיבה זו, אלו סוגים של מחקרים בחרה לעיתים קרובות תחל וסמנים המיועדות באופן סלקטיבי הנדונים של microbiome. הערכת ההרכב של קהילות חיידקי מושגת בדרך כלל על ידי רצף אחד או יותר של האזורים hypervariable של2,3גנים rRNA 16 חיידקי. במחקר זה, אנו מתארים של אמפליקון המבוסס רצף פרוטוקול שפותחו עבור פלטפורמה המיתרים באותו אזור bp V3-V4 מטרות ה-500 של הגן rRNA חיידקי מטוסי אף-16, המאפשר הגברה רחבה של חיידקי taxa גם בעת מתן השתנות מספיקות כדי מבחין בין taxa שונים. בנוסף, פרוטוקול זה בקלות ניתן להתאים לשימוש עם ערכות פריימר אחרות, כגון אלה פילוח הסמן ITS2 של פטריות או יחידת משנה של rRNA 18S של פרוקריוטים.

ואילו השני מתקרב כגון רובה metagenomics, metatranscriptomics ורצף מתא בודד, מציעים יתרונות נוספים לרבות הגנום מיקרוביאלי נפתרה ומדידה ישירה יותר של פונקציית הקהילה, טכניקות אלה הן בדרך כלל יותר יקר ולא שהמפתחות אינטנסיבית יותר פרופיל פילוגנטי המתוארים כאן4. בנוסף, ביצוע רובה metagenomics ו- metatranscriptomics על בסיס דגימות התשואות ואחוז גדול של קריאות השייכים הגנום הצמח הפונדקאי, שיטות להתגבר על מגבלה זו מתבצעת עדיין מפותח5,6.

כמו עם כל פלטפורמה ניסיוני, מבוסס אמפליקון פרופיל יכול להציג את מספר הטיות אפשריות אשר יש לקחת בחשבון במהלך עיצוב ניסיוני וניתוח נתונים. אלה כוללים שיטות איסוף הדגימה DNA החילוץ, מבחר של PCR תחל, איך מתבצעת ההכנה הספרייה. שיטות שונות יכולים להשפיע באופן משמעותי את כמות הנתונים שמיש שנוצר, גם יכול לעכב את המאמצים כדי להשוות בין תוצאות בין מחקרים. לדוגמה, שיטת הסרת חיידקים rhizosphere7 והשימוש בטכניקות שונות מיצוי או ברירה של דנ א מיצוי ערכות8,9 הוכחו להשפיע באופן משמעותי ניתוח במורד הזרם, מה שמוביל מסקנות שונות לגבי אשר חיידקים הם המתנה ו- abundances היחסי שלהם. מאז מבוססי אמפליקון פרופיל יכול להיות מותאם אישית, ביצוע השוואות בין לימודי יכול להיות מאתגר. הפרויקט Microbiome הארץ הציע כי החוקרים ללמוד מערכות מורכבות כגון microbiome צמח-הקשורים ירוויחו הפיתוח של פרוטוקולים סטנדרטיים, כאמצעי מזעור ההשתנות נגרם על-ידי היישום של שיטות שונות בין מחקרים10,11. כאן, נדון רבים מן הנושאים הנ ל, להציע הצעות לגבי שיטות עבודה מומלצות היכן המתאים.

הפרוטוקול מדגים את התהליך של איסוף קרקע, rhizosphere, ודוגמאות השורש של דורה bicolor ודנ א חילוץ באמצעות ומבוססת DNA בידוד ערכת11. בנוסף, פרוטוקול שלנו כולל אמפליקון מפורט רצף זרימת עבודה, באמצעות פלטפורמה הגדרות שימוש נפוץ, כדי לקבוע את המבנה של קהילות חיידקי12,13,14. פרוטוקול זה אומתה לשימוש במגוון רחב של צמחים מארחים במחקר שפורסם לאחרונה של שורשים, rhizosphere, הקשורים-קרקעות של 18 מינים monocot, כולל דורה bicolor, זיה מייז, ו חיטת הלחם15. שיטה זו גם אומתה לשימוש עם גנים אחרים סמן, כפי שמתואר על-ידי היישום המוצלח שלה ללמוד את הגן סמן ITS2 פטרייתי במחקרים של אגבה microbiome16,17 , תות microbiome 18.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. איסוף והפרדה של שורש Endosphere, Rhizosphere, דגימות אדמה

  1. לפני הכניסה למגרש, תא לחץ מים הנדסה גנטית (לפחות 90 מ"ל של מים עבור דגימה) לחטא. להכין אפיפיט הסרת מאגר (לפחות 25 מ לכל דגימה) על-ידי הוספת 6.75 גרם2פו ח'4, 8.75 g K-2-HPO-4ו- 1 מ"ל של טריטון X-100, 1 ליטר של מים סטריליים. לעקר את המאגר באמצעות מסנן ואקום עם גודל הנקבוביות מיקרומטר 0.2.
    1. לקבלת צעדים 1.2 עד 1.5, לבשו כפפות נקי מחוטא עם אתנול בכלל פעמים והחלף את הכפפות בין כל מדגם למניעת זיהום. לעקר את כל הציוד עם 70% אתנול, תנקה כל הציוד בין הדגימות. לפני דגימה, לקבוע את עומק דגימה מיטבי עבור הניסוי שלך, להיות עקבי עם כל האוספים אדמה ושורש.
  2. כדי לאסוף דגימות. אדמה בתפזורת, השתמש אספן הליבה אתנול-עיקור קרקע להשגת אדמת חינם שורשי הצמח על ידי איסוף ליבה של 23 עד 30 ס מ מבסיס הצמח.
  3. להעביר את הקרקע שקית ניילון, homogenize את הקרקע ע י ניעור עדין, העברה של aliquot של המדגם אדמה (כ 600 מ ג) למלא שפופרת אחת 2 מ"ל. מיד במקום הצינור 2 מ"ל על קרח יבש או פלאש להקפיא את הצינור נוזלי N2 עד מוכן להמשיך עם ה-DNA החילוץ (שלב 2).
    1. בסביבות מסוימות, האדמה שמסביב יכולים להכיל חומר צמחי. במקרה זה, השתמש מסננת סטיריליים 2 מ מ להפריד את הלכלוך צמח האדמה לפני הצבתו בשקית פלסטיק.
  4. כדי לאסוף את השורש ואת rhizosphere, להשתמש האת של אתנול-לעקר לגלות את הצמח, מקפיד לקבל כל כך הרבה של השורש ככל האפשר. עומק יהיה תלוי הצמח. בעוד מפעלים קטנים כמו חיטה ניתן להסיר על ידי מציאת מספר סנטימטרים, צמחים גדולים יותר כגון דורה עשויים לדרוש 30 ס מ או יותר. בעדינות לנער עודפי אדמה מן השורשים עד כ- 2 מ מ של אדמה הקפדה על פני השורש.
    הערה: תשמרי כאשר עובדים עם מפעלים קטנים, עם שורשים שביר או בקרקעות תוכן יבש, קליי גבוהה. באופן אידיאלי, צריך רק להיות שכבה דקה של האדמה שנותרו על השורשים לאחר רועדת. אם נשארים אגרגטים גדולים של אדמה, פטיש גומי יכול לשמש כדי לסלק את האדמה על ידי להכות בעדינות את הבסיס של הצילומים. אם כמות אדמה שנותרה לאחר תהליך זה חורג או נופל קצר של 2 מ מ, עובי משוער יש לציין.
  5. צמחים גדולים, לשימוש מספריים סטרילי ו/או מספריים כדי לגזור תת נציג של שורשים מקום לפחות 500 מ ג של רקמת השורש לתוך בקבוקון חרוט 50 מ. לקבלת עשבים קטנים יותר, למקם מערכת השורשים כולו לתוך הבקבוקון. הוסף את מאגר להסרת אפיפיט מספיק כדי לכסות את השורשים, ואז מיד שים המדגם על קרח יבש או פלאש להקפיא את דגימת נוזל N2.
    הערה: הקפידו לא תמלא יותר מדי את המבחנה חרוט של 50 מ ל, לעשות כביסה שלב קשה. צריך להיות די שטח ריק כך המאגר אפיפיט היא היכולת לזרום לתחתית להקיף את השורשים לכל אורך המבחנה, לכסות את החלק העליון. בגלל כמה עשבים ביומסה שורש יותר מכפי שניתן לתוך בקבוקון חרוט 50 מ ל, צריך לאסוף סעיף משנה של השורשים. עם זאת, יצוין כי חיתוך השורשים עלולה להוביל חיידקים endophytic להיות נשטף החוצה לתוך השבר rhizosphere, אז פרץ שורשים צריך להיות ממוזער. אם הדגימות לא יעובדו מיד לאחר מבוקש מעבדה, והם יכולים להיות מאוחסנים ב- 80 ° c
  6. כדי להפריד את rhizosphere מן השורשים, להפשיר המדגם השורש על קרח, ואז sonicate את הדגימות שורש ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות עם פולסים של 160 W ב-30 s, מופרדים על ידי העברה ס' 30 השורשים לתוך צונן (4 ° C), 50 מ ל צינור באמצעות מלקחיים סטרילי נקי. אל תשליך את הצינור המקורי עם מאגר ואדמה, שהינו השבר rhizosphere (איור 1).
  7. Centrifuge הצינור המכיל מאגר של rhizosphere במשך 10 דקות ב 4 ° C, x 4,000 ג'י Decant תגובת שיקוע, פלאש להקפיא את הצינור המכיל את השבר rhizosphere נוזלי N2, ולאחר לאחסן את השבר rhizosphere ב-80 מעלות צלזיוס עד מוכן להמשיך עם ה-DNA חילוץ (שלב 2).
  8. לשטוף את השורשים, להוסיף כ 20 מ ל מים סטריליים צוננת (4 ° C) השבר שורש. לשטוף את השורש ע י ניעור נמרצות (על ידי היד או מערבל, עבור s 15-30) ולאחר מכן לנקז את המים.
  9. חזור על שלב זה לפחות פעמיים, עד הקרקע לא נשאר על פני השורש. אם הפקת דנ א (שלב 2) לא מתבצעת מיידית, לעטוף את השורשים בנייר אלומיניום סטרילי, פלאש להקפיא את השורשים נוזלי N2וחנות הדגימות ב-80 מעלות צלזיוס עד מוכן להמשיך עם מיצוי הדנ א.

2. הפקת דנ א

הערה: במהלך שלבים 2 ו-3, כפפות נקי מחוטא עם אתנול לענידה בכל עת, כל העבודה יש לבצעו על משטח לעקר עם אתנול.

  1. תמצית ה-DNA בין דגימות קרקע ומי rhizosphere.
    1. השתמש במרית סטרילי להעביר במהירות את 250 מ"ג של אדמה, rhizosphere מצעדי 1.3 ו 1.7 לתוך צינורות אוסף נפרד המסופקים בערכה בידוד של דנ א מסחרי המיועד לחילוץ מן הקרקע, ואז להמשיך עם ה-DNA בידוד באמצעות של הספק ערכת פרוטוקול.
    2. לאחר eluting ה-DNA במאגר • תנאי שסופק על-ידי ערכת בידוד ה-DNA, לאחסן את ה-DNA ב-20 ° C עד מוכן להמשיך את שלב 3.
  2. תמצית ה-DNA בין דגימות שורש.
    1. מקררים ומכתש סטיריליים באמצעות נוזל N2. למדוד את 600-700 מ"ג של רקמת השורש ולמקם את הרקמה לתוך המליטה. . בזהירות, מוסיפים מספיק נוזל N2 כדי לכסות את השורשים.
    2. לטחון את השורשים לחתיכות קטנות. המשך התהליך של הוספת נוזל N2 וטחינה (לפחות שתי פעמים, להיות עקבי בין דוגמאות), עד השורשים אבקה. ודא כי רקמת השורש לא להפשיר במהלך שלב זה.
      התראה: שימוש ציוד מגן אישי המתאים (חלוק המעבדה במשקפי מגן, כפפות קריוגני) כאשר עובדים עם נוזל N2.
      הערה: להפקת DNA באיכות נמוכה, זה יכול להיות מועיל לטחון שורשים עודף לאבקה, לאחסן את האבקה ב-80 מעלות צלזיוס.
    3. . מהר, לפני השורש אבקת מתחיל להפשיר, להשתמש במרית סטרילי כדי להעביר את אבקת שורש לתוך צינורות mL 1.5 שנשקל מראש על קרח. להקליט את המשקל של הצינורית, אבקת. בדרך כלל, 300-400 מ ג של אבקת מועבר.
    4. השתמש במרית סטרילי להעביר במהירות 150 מ ג של אבקת שורש הצינור אוסף המסופקים בערכה בידוד של דנ א מסחרי המיועד לחילוץ מן הקרקע, ולאחר מכן להמשיך עם ה-DNA בידוד באמצעות הפרוטוקול של הספק ערכת.
      הערה: עבור דגימות שורש, שם ניתן ריכוז גבוה של אורגניקס שנותרו בגדר הדנ א, אשר מונע ההגברה של ה-DNA במהלך PCR, במיוחד כאשר פרוטוקול מיצוי הדנ א אחר (למשל., מיצוי CTAB) משמש. במידת הצורך, לנקות את ה-DNA על פי ההוראות המסופק בערכה ניקיון סביבתי הדנ א.
  3. מודדים את ריכוז כל דגימות די אן איי באמצעות fluorometer של רגישות גבוהה benchtop.
    1. להוסיף 1-20 µL של כל. דנ א eluted לתוך צינורות המסופק בערכה assay רגישות גבוהה dsDNA. הוסף הפתרון עובד fluorometer (צבע 1:200: מאגר) עד 200 µL.
    2. להכין שני צינורות נוספים המכילים 10 µL של DNA רגיל 1 (0 ng/µL דנ א) או 10 µL של תקן 2 (100 ng/µL), וכן להוסיף 190 µL של הפתרון עובד fluorometer כל סטנדרט.
    3. מודדים את ריכוז המידה ואת כל דגימה. אם זה לא נעשה באופן אוטומטי, לחשב את ריכוז הדנ א מהפלט ספיגת מאת רגרסיה ליניארית שני תקנים.

3. אמפליקון ספריית בהכנה והגשה

  1. הגדרת חומרים עבור התגובה הגברה.
    1. הפשרת דגימות די אן איי ב 4 ° C ולשמור אותם על קרח לאורך כל שלב 3. אקראי הסדר של דגימות די אן איי כדי לצמצם הטיה בשל המיקום על הצלחת ה-PCR (טבלה 2).
    2. בצלחת PCR 96-ובכן, לדלל הדנ א של כל מדגם במים ברמה מולקולרית כדי ng/µL 5 ב הנפח הכולל של 20 להוסיף 20 µL µL. מולקולרית-כיתה מים לבארות פינת ארבע כפקדי שלילי עבור הגברה (ריקים) (טבלה 2).
    3. סדר את תחל לבר-קוד (10 מיקרומטר) או רצועת המבחנות או צלחת 96-ובכן כך ניתן להוסיף עם פיפטה רב ערוצית (איור 2).
    4. להכין מספיק PCR מיקס מאסטר כדי להגביר כל מדגם ה-DNA דולר. להכין µL 1.5 של BSA (20 מ"ג/מ"ל), µL 37.5 של מוכנות מראש 2 x מיקס מאסטר (המורכבת של מאגר ה-PCR, MgCl2, dNTPs ו הדנ א. אנזימים ), µL 0.57 של כלורופלסט הרשות הפלסטינית (100 מיקרומטר), µL 0.57 של הרשות הפלסטינית מיטוכונדריאלי (100 מיקרומטר), ו- µL 25.86 של מים ברמה המולקולרית.
    5. יוצקים המיקס מאסטר לתוך 25 מ ל סטרילי של מאגר פיפטה רב-ערוצי ולהפיץ µL 66 של מיקס מאסטר לתוך כל טוב של צלחת חדשה של ה-PCR 96-ובכן באמצעות פיפטה רב-ערוצי.
      הערה: בעת חישוב ריאגנט כרכים על המיקס מאסטר, הקפד לכלול גם הבארות ריק 4 לכל צלחת.
    6. בעזרת פיפטה של רב ערוצית, להוסיף 6 µL של 5 ng/µL DNA (מהצלחת DNA מנורמל) לצלחת מיקס מאסטר. לאחר מכן להוסיף לוח אב 1.5 µL של 10 מיקרומטר פריימר לפנים כזה כי בכל עמודה יש ברקוד קדימה שונים, ו 1.5 µL של 10 מיקרומטר הפוך תחל כך שכל שורה תכיל ברקוד הפוכה שונים (איור 2).
      הערה: לפני הוספת תחל, צלחות אקראי של מיקס מאסטר יכול לשמש כדי להגביר את הגנים פטרייתי בקשתה או ITS2 אם נוספו תחל שונים. אם זה המקרה, ניתן להשתמש בעיצוב פריימר דומה.
    7. ספין למטה הצלחת בקצרה ב 3,000 x ג להשתמש פיפטה רב ערוצית לערבב בעדינות, ואז לחלק את שלוש צלחות עם 25 µL תערובת התגובה.
      הערה: למרות משכפל שלוש אינם הדבר הכרחי לחלוטין, זה מקטין את ההשפעה של השתנות טכני.
  2. להגביר את ה-DNA בצלחת לכל שימוש thermocycler להגדיר את התנאים הבאים: 180 s ב 98 ° C, 30 מחזורים של: 98 ° C עבור 45 s (denaturing), 78 מעלות צלזיוס במשך 10 s (חישול הרשות הפלסטינית), 55 ° C 60 s (פריימר חישול), ו- 72 מעלות צלזיוס במשך 90 s (סיומת) , ואז 600 s ב-72 מעלות ואחריו של 4 ° C להחזיק שלב. לאחר ההגברה, בריכת הלוחות שכפל שלוש לתוך לוח 96-ובכן בודד אחד.
  3. לכמת את הדנ א באמצעות רגישות גבוהה fluorometer ריאגנטים קורא 96-ובכן צלחת.
    1. להוסיף 2 µL של כל מוצר ה-PCR microplate 96-ובכן, יחד עם µL 98 של הפתרון עובד fluorometer (צבע 1:200: מאגר). כולל 4 בארות באמות מידה: 5 µL של ה-DNA 1 רגיל (0 ng/µL ה-DNA), µL 1 2 רגיל (10 ng/µL) µL 2 2 רגיל (20 ng/µL), µL 5 תקן 2 (50 ng/µL). לאחר מכן להוסיף fluorometer הפתרון עובד עבור אמצעי אחסון הסופי של 100 µL.
      הערה: כל מדגם ניתן למדוד באמצעות fluorometer benchtop כפי שמתואר בשלב 2.3 אם קורא הלוח אינו זמין.
    2. חשב את ריכוז הדנ א מהפלט ספיגת מאת רגרסיה ליניארית ארבעה תקנים.
    3. עבור לבר-קוד בהצלחה מוגבר מוצרים (אלה שיש להם ריכוז גדול מ- 15 ng/µL), בריכה 100 ננוגרם של כל מדגם לתוך צינור יחיד mL 1.5 (טבלה 2).
    4. לחשב את הנפח הממוצע של דגימות שהתווסף למאגר באמצעות הפונקציה =AVERAGE() בתוכנית גיליון אלקטרוני. הוסף את עוצמת הקול של מוצרי ה-PCR "ריק" הדגימות במאגר.
      הערה: מאז המוצרים PCR "ריק" יש שילובים ברקוד ייחודי משלהם, הם יכולים להיות רציף כדי לבדוק אם כל מזהמים מעבדה.
  4. למדוד את הריכוז של המוצר במאגר באמצעות fluorometer benchtop כפי שמתואר שלב 2.3, לקחת 600 ng של ה-DNA, לדלל במים ברמה המולקולרית לאמצעי הסופי של µL 100 צינור 1.5 מ. לאחסן את המוצר במאגר הנותרים ב-20 ° C.
  5. לשטוף את הדנ א נג 600 aliquot על ידי ביצוע תהליך טיהור PCR הוקמה עם חרוזים טיהור פאראמגנטיים בתבנית 96-ובכן עם כמה יוצאים מן הכלל.
    1. להפוך µL 600 טריים aliquot של 70% אתנול. לנער את הבקבוק של beads מגנטי להשעות מחדש חרוזים ליישב את העניין.
    2. להוסיף נפח x 1 (100 µL) של פתרון חרוז aliquot ng 600 ה-DNA. לערבב ביסודיות על ידי pipetting 10 פעמים. תקופת דגירה של 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    3. מקם את הצינורית על גבי המעמד מגנטית למשך 2 דקות (או עד פתרון ברור) להפריד חרוזים פתרון. כאשר הצינור נמצא עדיין הדוכן מגנטי, וארוקן את תגובת שיקוע ברור בזהירות מבלי לגעת את החרוזים מגנטי, ולמחוק את תגובת שיקוע ברורה.
      הערה: בשלב זה, המוצרים אמפליקון מאוגדים החרוזים מגנטי. כל החרוזים כי הם השאיפה מופרע או אבד במהלך תגרום לאובדן של ה-DNA.
    4. להשאיר את הצינור ביציע מגנטי ולהוסיף 300 µL של 70% אתנול הצינור; תקופת דגירה בטמפרטורת החדר של 30 ס' וביופסיה אתנול, להשליך. חזור על תהליך זה, ולהסיר כל אתנול לאחר לשטוף את השני. להסיר את הצינור מן הדוכן מגנטי, אוויר יבש במשך 5 דקות.
    5. להוסיף 30 µL של מים ברמה המולקולרית החרוזים יבשים ומערבבים על ידי pipetting 10 פעמים. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 2 דק לשוב לדוכן מגנטי עבור 1 דקות ברכבת התחתית להפריד את החרוזים פתרון. להעביר את eluate צינור חדש.
      הערה: beads מגנטי לא ישפיעו על תגובות במורד הזרם.
  6. למדוד את הריכוז הסופי של ניקו, במאגר הדנ א באמצעות fluorometer benchtop כפי שמתואר בשלב 2.3. לדלל עם aliquot 10 nM, נפח סופי 30 µL, או ריכוז ונפח המועדף על המתקן רצף.
  7. לנצל את השירותים של מתקן רצף רצף ה-DNA על פלטפורמה המיתרים, 2 x 300 bp לזווג-קצה רצף.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ביצוע הפרוטוקול המומלץ יביא dataset הקריאות לזווג-קצה באינדקס שניתן מתאימים לחזור כל דגימה או שהוקצו או בקטריאלית ביחידות תפעוליות בטקסונומיה (OTU) או רצף המדויק משתנה (אשד מזרקות, המכונה גם אמפליקון רצף variant (ASV) ויחידת תפעולי בטקסונומיה (sOTU)), בהתאם לניתוח במורד הזרם. על מנת לקבל נתונים רצף איכותי, חייבים להקפיד בכל שלב כדי לשמור על עקביות בין דגימות ולצמצם את המבוא של כל הטיה אפשרית במהלך עיבוד הדגימה או ספריית הכנה. לאחר איסוף, עיבוד, חילוץ DNA דגימות (שלבים 1 ו- 2), eluate שנוצ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מדגים של צינור הוקמה עבור חקר הבסיס endosphere, rhizosphere ו אדמת הקהילה מיקרוביאלי יצירות, שהדגימה שדה דוגמת עיבוד ורצף במורד הזרם. Microbiomes שורש-הקשורים לומד מציג באתגרים הייחודיים לה, בשל באופן חלקי הקשיים הכרוכים בחילוף מן הקרקע. קרקעות הן מאוד משתנה מבחינת הפיסיקליות והכימיות, בתנאי קרקע שונים יכול להיות מופרדים קטנה כמו כמה מילימטרים28,29. זה יכול להוביל הדגימות אשר נאספו מאתרי דגימה סמוכים נתקל לקהילה מיקרוביאלית משמעותית אחרת יצירות ו פעיל...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו מומן על ידי משרד החקלאות-ארס (כריס 2030-21430-008-00D). TS נתמך על-ידי התוכנית אחוות ה-NSF מחקר לתואר שני.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.1-10/20 ומיקרו; L טיפים מיקרופיפטה מסונניםארה"ב סיינטיפיק1120-3810יכול להחליף במקביל מספקים אחרים.
צינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"לארה"ב סיינטיפיק1615-5510יכול להחליף במקביל מספקים אחרים.
10 ומיקרו; L פיפטה רב ערוציתEppendorf3122000027יכול להחליף במקביל מספקים אחרים.
10 ומיקרו; L, 100 ומיקרו; L, ו-1000 ומיקרו; L מיקרופיפטותEppendorf3120000909יכול להחליף במקביל מספקים אחרים.
100 ומיקרו; L פיפטה רב ערוציתEppendorf3122000043יכול להחליף במקביל מספקים אחרים.
1000 ומיקרו; טיפים מיקרופיפטה מסוננים Lארה"ב סיינטיפיק1122-1830יכול להחליף במקביל מספקים אחרים.
צינורות מיקרוצנטריפוגה 2 מ"לארה"ב מדעי1620-2700יכול להחליף במקביל מספקים אחרים.
מסננת אדמה 2 מ"מספקי יערות60141009יכול להחליף במקביל מספקים אחרים.
200 ומיקרו; L טיפים מיקרופיפטה מסונניםארה"ב מדעי1120-8810יכול להחליף במקביל מספקים אחרים.
מאגרי 25 מ"לVWR International LLC89094-664יכולים להחליף במקביל מספקים אחרים.
בקבוקונים חרוטיים של 50 מ"לThermo Fisher Scientific352098יכול להחליף במקביל מספקים אחרים.
מסנני ואקום 500 מ"ל (0.2 ומיקרו; גודל נקבוביות m)VWR International LLC156-4020
96-well microplatesUSA Scientific655900
96-well PCR צלחותBioRad
AMPure XP חרוזיםThermo Fisher ScientificNC9933872הוראות שימוש:
https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/ajax/downloadDocument/B37419AA.pdf?autonomyId=TP_DOC_150180
&documentName=B37419AA.pdf
טיילתרדיד אלומיניום7124יכול להחליף במקביל מספקים אחרים.
סולם אנליטי ברזולוציה של 0.001 גרםOhaus PioneerPA323יכול להחליף במקביל מספקים אחרים.
Bioruptor Plus ultrasonicatorDiagenodeB01020001
בקר סרום אלבומין (BSA) 20 מ"ג/מ"לניו אינגלנד BiolabsB9000S
צנטריפוגהאפנדורף5811000908כולל מתאמי דלי צלחת 50 מ"ל ו-96 בארות
כפפות קריוגניותMillipore SigmaZ183490יכול להחליף במקביל מספקים אחרים.
ערכת DNeasy PowerClean (אופציונלי)Qiagen Inc.12877-50בעבר ערכת MoBio
DNeasy PowerSoilQiagen Inc.12888-100בעבר MoBio
קרח יבשכל
DynaMag-2Thermo Fisher Scientific12321Dאין להחליף
אתנולVWR International LLC89125-188יכול להחליף במקביל מספקים אחרים.
שקיות מקפיא בגודל גלוןZiplocNAיכול להחליף במקביל מספקים אחרים.
Gemini EM Microplate Readerמכשירים מולקולרייםEMיכול להשתמש בפלואורומטר אחר הקורא צלחות של 96 בארות מלמעלה.
K2HPO4Sigma-AldrichP3786
KH2PO4Sigma-AldrichP5655
מעיל מעבדהWorkriteJ1367יכול להחליף בשווה ערך מספקים אחרים.
נוזל N2כלNAיכול להחליף בשווה ערך מספקים אחרים.
נוזל N2 dewarThermo Fisher Scientific4150-9000יכול להחליף במקביל מספקים אחרים.
מערכת טיהור מים אולטרה-טהורה Milli-QMillipore SigmaSYNS0R0WW
מיני צנטריפוגהEppendorf5404000014
מים בדרגה מולקולריתThermo Fisher Scientific4387937יכול להחליף במקביל מספקים אחרים.
מרגמותVWR International LLC89038-150יכול להחליף במקביל מספקים אחרים.
כפפות ניטרילThermo Fisher Scientific19167032Bיכול להחליף במקביל מספקים אחרים.
מגבות ניירVWR International LLCBWK6212יכול להחליף במקביל מספקים אחרים.
סרט איטום צלחת PCRThermo Fisher ScientificNC9684493
צינורות רצועת PCRUSA Scientific1402-2700
PestlesVWR International LLC89038-166יכול להחליף במקביל מספקים אחרים.
מרית פלסטיקLevGo, Inc.17211
פלטינום Hot Start PCR Master Mix (2x)Thermo Fisher Scientific13000014
PNAs - כלורופלסט ומיטוכונדריהPNA BioNAהקפד לאמת את הרצף מבחינה ביואינפורמטית
משקפי מגןMillipore SigmaZ759015יכול להחליף במקביל מספקים אחרים.
קיוביט 3.0 פלואורומטרתרמו פישר סיינטיפיקQ33216
קיוביט dsDNA HS ערכת בדיקהתרמו פישר סיינטיפיקQ32854
פטיש גומי (אופציונלי)Ace Hardware2258622יכול להחליף במקביל מספקים אחרים.
מספריים או מספרייםVWR International LLC89259-936יכול להחליף במקביל מספקים אחרים.
את חפירההום דיפו2597400יכול להחליף במקביל מספקים אחרים.
אספן ליבת קרקע (קוטר קטן: < 1 אינץ')Ben Meadows221700יכול להחליף במקביל מספקים אחרים.
בקבוקי ריסוסSanta Cruz Biotechnologysc-395278יכולים להחליף במקביל מספקים אחרים.
פריימרים ברקודים מותפלים סטנדרטיים (10 ומיקרו; M) (טבלה 1)IDTNA4 nmole Ultramer DNA Oligo עם התפלה סטנדרטית. מתאם NGS ופריימר ריצוף (טבלה 1) מיועדים לשימוש עם Illumina MiSeq באמצעות כימיה v3.
ThermocyclerThermo Fisher ScientificE950040015יכול להחליף במקביל מספקים אחרים.
Triton X-100Sigma-AldrichX100יכול להחליף במקביל מספקים אחרים.
שקילת סירותספקטרום כימיקליםB6001Wיכול להחליף במקביל מספקים אחרים.
HSP9631-Agencourt מגנט NA

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. R. Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies. Nat Rev Genet. 17 (6), 333-351 (2016).
  2. Soergel, D. A. W., Dey, N., Knight, R., Brenner, S. E. Selection of primers for optimal taxonomic classification of environmental 16S rRNA gene sequences. ISME J. 6 (7), 1440-1444 (2012).
  3. Takahashi, S., Tomita, J., Nishioka, K., Hisada, T., Nishijima, M. Development of a Prokaryotic Universal Primer for Simultaneous Analysis of Bacteria and Archaea Using Next-Generation Sequencing. PLoS One. 9 (8), e105592(2014).
  4. Poretsky, R., Rodriguez-R, L. M., Luo, C., Tsementzi, D., Konstantinidis, K. T. Strengths and Limitations of 16S rRNA Gene Amplicon Sequencing in Revealing Temporal Microbial Community Dynamics. PLoS One. 9 (4), e93827(2014).
  5. Sharpton, T. J. An introduction to the analysis of shotgun metagenomic data. Front Plant Sci. 5, 209(2014).
  6. Jiao, J. -Y., Wang, H. -X., Zeng, Y., Shen, Y. -M. Enrichment for microbes living in association with plant tissues. J Appl Microbiol. 100 (4), 830-837 (2006).
  7. Richter-Heitmann, T., Eickhorst, T., Knauth, S., Friedrich, M. W., Schmidt, H. Evaluation of Strategies to Separate Root-Associated Microbial Communities: A Crucial Choice in Rhizobiome Research. Front Microbiol. 7, 773(2016).
  8. Mahmoudi, N., Slater, G. F., Fulthorpe, R. R., Mahmoudi, N., Slater, G. F., Fulthorpe, R. R. Comparison of commercial DNA extraction kits for isolation and purification of bacterial and eukaryotic DNA from PAH-contaminated soils. Can J Microbiol. 5709, 623-628 (2011).
  9. Vishnivetskaya, T. A., et al. Commercial DNA extraction kits impact observed microbial community composition in permafrost samples. FEMS Microbiol Ecol. 87 (1), 217-230 (2014).
  10. Busby, P. E., et al. Research priorities for harnessing plant microbiomes in sustainable agriculture. PLoS Biol. 15 (3), e2001793(2017).
  11. Thompson, L. R., et al. A communal catalogue reveals Earth's multiscale microbial diversity. Nature. , (2017).
  12. Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. ISME J. 6 (8), 1621-1624 (2012).
  13. Kozich, J. J., Westcott, S. L., Baxter, N. T., Highlander, S. K., Schloss, P. D. Development of a Dual-Index Sequencing Strategy and Curation Pipeline for Analyzing Amplicon Sequence Data on the MiSeq Illumina Sequencing Platform. Appl Environ Microb. 79 (17), 5112-5120 (2013).
  14. Degnan, P. H., Ochman, H. Illumina-based analysis of microbial community diversity. ISME J. 6 (1), 183-194 (2012).
  15. Naylor, D., DeGraaf, S., Purdom, E., Coleman-Derr, D. Drought and host selection influence bacterial community dynamics in the grass root microbiome. ISME J. , (2017).
  16. Desgarennes, D., Garrido, E., Torres-Gomez, M. J., Peña-Cabriales, J. J., Partida-Martinez, L. P. Diazotrophic potential among bacterial communities associated with wild and cultivated Agave species. FEMS Microbiol Ecol. 90 (3), 844-857 (2014).
  17. Coleman-Derr, D., et al. Plant compartment and biogeography affect microbiome composition in cultivated and native Agave species. New Phytol. 209 (2), 798-811 (2016).
  18. De Tender, C., et al. Dynamics in the Strawberry Rhizosphere Microbiome in Response to Biochar and Botrytis cinerea Leaf Infection. Front Microbiol. 7, 2062(2016).
  19. Kapp, J. R., et al. Variation in pre-PCR processing of FFPE samples leads to discrepancies in BRAF and EGFR mutation detection: a diagnostic RING trial. J Clin Pathol. 68 (2), 111-118 (2015).
  20. Simbolo, M., et al. DNA qualification workflow for next generation sequencing of histopathological samples. PLoS One. 8 (6), e62692(2013).
  21. O'Neill, M., McPartlin, J., Arthure, K., Riedel, S., McMillan, N. Comparison of the TLDA with the Nanodrop and the reference Qubit system. J Phys Conf Ser. 307 (1), 012047(2011).
  22. Callahan, B. J., McMurdie, P. J., Rosen, M. J., Han, A. W., Johnson, A. J. A., Holmes, S. P. DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data. Nat Methods. 13 (7), 581-583 (2016).
  23. Amir, A., et al. Deblur Rapidly Resolves Single-Nucleotide Community Sequence Patterns. mSystems. 2 (2), e00191-e00116 (2017).
  24. Edgar, R. C. UNOISE2: improved error-correction for Illumina 16S and ITS amplicon sequencing. bioRxiv. , 081257(2016).
  25. Nguyen, N. -P., Warnow, T., Pop, M., White, B. A perspective on 16S rRNA operational taxonomic unit clustering using sequence similarity. NPJ Biofilms Microbiomes. 2, 16004(2016).
  26. Callahan, B. J., McMurdie, P. J., Holmes, S. P. Exact sequence variants should replace operational taxonomic units in marker-gene data analysis. ISME J. , (2017).
  27. Lundberg, D. S., Yourstone, S., Mieczkowski, P., Jones, C. D., Dangl, J. L. Practical innovations for high-throughput amplicon sequencing. Nat Methods. 10 (10), 999-1002 (2013).
  28. O'Brien, S. L., et al. Spatial scale drives patterns in soil bacterial diversity. Environ Microbiol. 18 (6), 2039-2051 (2016).
  29. Fierer, N., Lennon, J. T. The generation and maintenance of diversity in microbial communities. Am J Bot. 98 (3), 439-448 (2011).
  30. Fierer, N. Embracing the unknown: disentangling the complexities of the soil microbiome. Nat Rev Microbiol. 15 (10), 579-590 (2017).
  31. Buckley, D. H., Schmidt, T. M. Diversity and dynamics of microbial communities in soils from agro-ecosystems. Environ Microbiol. 5 (6), 441-452 (2003).
  32. Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biol. 12, 87(2014).
  33. Weiss, S., Amir, A., Hyde, E. R., Metcalf, J. L., Song, S. J., Knight, R. Tracking down the sources of experimental contamination in microbiome studies. Genome Biol. 15 (12), 564(2014).
  34. Sutlović, D., Definis Gojanović, M., Andelinović, S., Gugić, D., Primorac, D. Taq polymerase reverses inhibition of quantitative real time polymerase chain reaction by humic acid. Croat Med J. 46 (4), 556-562 (2005).
  35. Sutlovic, D., Gamulin, S., Definis-Gojanovic, M., Gugic, D., Andjelinovic, S. Interaction of humic acids with human DNA: proposed mechanisms and kinetics. Electrophoresis. 29 (7), 1467-1472 (2008).
  36. Aleklett, K., Leff, J. W., Fierer, N., Hart, M. Wild plant species growing closely connected in a subalpine meadow host distinct root-associated bacterial communities. PeerJ. 3, e804(2015).
  37. Bogas, A. C., et al. Endophytic bacterial diversity in the phyllosphere of Amazon Paullinia cupana associated with asymptomatic and symptomatic anthracnose. Springerplus. 4, 258(2015).
  38. Hiscox, J., Savoury, M., Müller, C. T., Lindahl, B. D., Rogers, H. J., Boddy, L. Priority effects during fungal community establishment in beech wood. ISME J. 9 (10), 2246-2260 (2015).
  39. Zhang, T., Yao, Y. -F. Endophytic Fungal Communities Associated with Vascular Plants in the High Arctic Zone Are Highly Diverse and Host-Plant Specific. PLoS One. 10 (6), e0130051(2015).
  40. Ghyselinck, J., Pfeiffer, S., Heylen, K., Sessitsch, A., De Vos, P. The effect of primer choice and short read sequences on the outcome of 16S rRNA gene based diversity studies. PLoS One. 8 (8), e71360(2013).
  41. Wintzingerode, F., Landt, O., Ehrlich, A., Göbel, U. B. Peptide nucleic acid-mediated PCR clamping as a useful supplement in the determination of microbial diversity. Appl Environ Microb. 66 (2), 549-557 (2000).
  42. Cruaud, P., Vigneron, A., Lucchetti-Miganeh, C., Ciron, P. E., Godfroy, A., Cambon-Bonavita, M. -A. Influence of DNA extraction method, 16S rRNA targeted hypervariable regions, and sample origin on microbial diversity detected by 454 pyrosequencing in marine chemosynthetic ecosystems. Appl Environ Microb. 80 (15), 4626-4639 (2014).
  43. Yang, B., Wang, Y., Qian, P. -Y. Sensitivity and correlation of hypervariable regions in 16S rRNA genes in phylogenetic analysis. BMC Bioinformatics. 17, 135(2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Root Microbiome16S rRNA SequencingSoil DNA ExtractionRhizosphere IsolationRoot EndosphereAmplicon Library PreparationPCR PurificationBacterial Community AnalysisPlant Microbiome ProfilingDNA Isolation Kit

Related Articles