כאן, אנו מתארים את פרוטוקול להשיג אמפליקון רצף נתונים של קרקע, rhizosphere, microbiomes endosphere השורש. מידע זה יכול לשמש כדי לחקור את הרכב ואת הרב-גוניות של צמח-הקשורים קהילות מיקרוביאלי, מתאים לשימוש עם מגוון רחב של מיני צמחים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
לחקור את השורש Microbiome: שליפת נתונים הקהילה חיידקי מן האדמה, Rhizosphere, Endosphere שורש
במאמר זה
סיכום
תקציר
האינטראקציה אינטימי בין המארח צמחים ומיקרואורגניזמים המשויך הוא קריטי לקביעת כושר צמח, שיכול לטפח עמידות משופרת בפני והאביוטיים לחצים ומחלות. ככל microbiome הצמח יכול להיות מאוד מורכבות, בעלות נמוכה, תפוקה גבוהה שיטות כמו מבוססי אמפליקון רצף של הגן rRNA מטוסי אף-16 לעיתים קרובות המועדפת על אפיון הרכב מיקרוביאלי והמגוון שלה. עם זאת, הבחירה של המתודולוגיה המתאימה כאשר עורכים ניסויים אלה חיוני להפחתת הטיות שיכולים לעשות ניתוח והשוואות בין מחקרים ודוגמאות קשה. פרוטוקול זה מתאר בפירוט מתודולוגיה מתוקננת מספקת כדי להפוך את אוסף מן האדמה, rhizosphere, ודוגמאות שורש החילוץ של ה-DNA. בנוסף, אנחנו לסמן קו 16 ומבוססת rRNA אמפליקון רצף צינור המאפשר עבור חקר ההרכב של קהילות חיידקי בדגימות אלה, ולא ניתן להתאים בקלות עבור גנים סמן אחרים. צינור זה אומתה למגוון רחב של מיני צמחים, כולל סורגום, תירס, חיטה, תות שדה, אגבה, והוא יכול לעזור להתגבר על בעיות הקשורות לזיהום של צמח organelles.
מבוא
צמח-הקשורים microbiomes מורכב דינאמי ומורכב קהילות מיקרוביאלית של חיידקים ארכאונים, וירוסים, פטריות, מיקרואורגניזמים אחרים האיקריוטים. בנוסף תפקידם למד היטב בגרימת מחלות צמחים, חיידקים הקשורים צמח יכול גם להשפיע לטובה על בריאות הצמח על ידי שיפור עמידות בפני לחצים ביוטיים, והאביוטיים קידום זמינות חומרי הזנה, שיפור צימוח דרך הייצור של phytohormones. מסיבה זו, קיים עניין מיוחד באפיון taxa מקשר עם הצמח שורש endospheres, rhizospheres את האדמה שמסביב. בעוד כמה חיידקים יכולים להיות בתרבית בבידוד במדיה שנוצר מעבדה, רבים לא ניתן, בין השאר כי הם עשויים מסתמכים על יחסי סימביוזה עם חיידקים אחרים, גדלים באיטיות, או דורשים תנאים שלא ניתן לשכפל בסביבת מעבדה. בגלל זה עוקף את הצורך בט....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. איסוף והפרדה של שורש Endosphere, Rhizosphere, דגימות אדמה
- לפני הכניסה למגרש, תא לחץ מים הנדסה גנטית (לפחות 90 מ"ל של מים עבור דגימה) לחטא. להכין אפיפיט הסרת מאגר (לפחות 25 מ לכל דגימה) על-ידי הוספת 6.75 גרם2פו ח'4, 8.75 g K-2-HPO-4ו- 1 מ"ל של טריטון X-100, 1 ליטר של מים סטריליים. לעקר את המאגר באמצעות מסנן ואקום עם גודל הנקבוביות מיקרומטר 0.2.
- לקבלת צעדים 1.2 עד 1.5, לבשו כפפות נקי מחוטא עם אתנול בכלל פעמים והחלף את הכפפות בין כל מדגם למניעת זיהום. לעקר את כל הציוד עם 70% אתנול, תנקה כל הציוד בין הדגימות. לפני דגימה, לקבוע את עומק דגימה מיטבי עבור הניסוי שלך, להיות עקבי עם כל האוספים אדמה ושורש.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
ביצוע הפרוטוקול המומלץ יביא dataset הקריאות לזווג-קצה באינדקס שניתן מתאימים לחזור כל דגימה או שהוקצו או בקטריאלית ביחידות תפעוליות בטקסונומיה (OTU) או רצף המדויק משתנה (אשד מזרקות, המכונה גם אמפליקון רצף variant (ASV) ויחידת תפעולי בטקסונומיה (sOTU)), בהתאם לניתוח במורד הזרם. על מנת לקבל נתונים רצף איכותי, חייבים להקפיד בכל שלב כדי לשמור על עקביות בין דגימות ולצמצם את המבוא של כל הטיה אפשרית במהלך עיבוד הדגימה או ספריית הכנה. לאחר איסוף, עיבוד, חילוץ DNA דגימות (שלבים 1 ו- 2), eluate שנוצ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
פרוטוקול זה מדגים של צינור הוקמה עבור חקר הבסיס endosphere, rhizosphere ו אדמת הקהילה מיקרוביאלי יצירות, שהדגימה שדה דוגמת עיבוד ורצף במורד הזרם. Microbiomes שורש-הקשורים לומד מציג באתגרים הייחודיים לה, בשל באופן חלקי הקשיים הכרוכים בחילוף מן הקרקע. קרקעות הן מאוד משתנה מבחינת הפיסיקליות והכימיות, בתנאי קרקע שונים יכול להיות מופרדים קטנה כמו כמה מילימטרים28,29. זה יכול להוביל הדגימות אשר נאספו מאתרי דגימה סמוכים נתקל לקהילה מיקרוביאלית משמעותית אחרת יצירות ו פעיל.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים אין לחשוף.
תודות
עבודה זו מומן על ידי משרד החקלאות-ארס (כריס 2030-21430-008-00D). TS נתמך על-ידי התוכנית אחוות ה-NSF מחקר לתואר שני.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 0.1-10/20 ומיקרו; L טיפים מיקרופיפטה מסוננים | ארה"ב סיינטיפיק | 1120-3810 | יכול להחליף במקביל מספקים אחרים. |
| צינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל | ארה"ב סיינטיפיק | 1615-5510 | יכול להחליף במקביל מספקים אחרים. |
| 10 ומיקרו; L פיפטה רב ערוצית | Eppendorf | 3122000027 | יכול להחליף במקביל מספקים אחרים. |
| 10 ומיקרו; L, 100 ומיקרו; L, ו-1000 ומיקרו; L מיקרופיפטות | Eppendorf | 3120000909 | יכול להחליף במקביל מספקים אחרים. |
| 100 ומיקרו; L פיפטה רב ערוצית | Eppendorf | 3122000043 | יכול להחליף במקביל מספקים אחרים. |
| 1000 ומיקרו; טיפים מיקרופיפטה מסוננים L | ארה"ב סיינטיפיק | 1122-1830 | יכול להחליף במקביל מספקים אחרים. |
| צינורות מיקרוצנטריפוגה 2 מ"ל | ארה"ב מדעי | 1620-2700 | יכול להחליף במקביל מספקים אחרים. |
| מסננת אדמה 2 מ"מ | ספקי יערות | 60141009 | יכול להחליף במקביל מספקים אחרים. |
| 200 ומיקרו; L טיפים מיקרופיפטה מסוננים | ארה"ב מדעי | 1120-8810 | יכול להחליף במקביל מספקים אחרים. |
| מאגרי 25 מ"ל | VWR International LLC | 89094-664 | יכולים להחליף במקביל מספקים אחרים. |
| בקבוקונים חרוטיים של 50 מ"ל | Thermo Fisher Scientific | 352098 | יכול להחליף במקביל מספקים אחרים. |
| מסנני ואקום 500 מ"ל (0.2 ומיקרו; גודל נקבוביות m) | VWR International LLC | 156-4020 | |
| 96-well microplates | USA Scientific | 655900 | |
| 96-well PCR צלחות | BioRad | ||
| AMPure XP חרוזים | Thermo Fisher Scientific | NC9933872 | הוראות שימוש: https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/ajax/downloadDocument/B37419AA.pdf?autonomyId=TP_DOC_150180 &documentName=B37419AA.pdf |
| טיילת | רדיד אלומיניום | 7124 | יכול להחליף במקביל מספקים אחרים. |
| סולם אנליטי ברזולוציה של 0.001 גרם | Ohaus Pioneer | PA323 | יכול להחליף במקביל מספקים אחרים. |
| Bioruptor Plus ultrasonicator | Diagenode | B01020001 | |
| בקר סרום אלבומין (BSA) 20 מ"ג/מ"ל | ניו אינגלנד Biolabs | B9000S | |
| צנטריפוגה | אפנדורף | 5811000908 | כולל מתאמי דלי צלחת 50 מ"ל ו-96 בארות |
| כפפות קריוגניות | Millipore Sigma | Z183490 | יכול להחליף במקביל מספקים אחרים. |
| ערכת DNeasy PowerClean (אופציונלי) | Qiagen Inc. | 12877-50 | בעבר ערכת MoBio |
| DNeasy PowerSoil | Qiagen Inc. | 12888-100 | בעבר MoBio |
| קרח יבש | כל | ||
| DynaMag-2 | Thermo Fisher Scientific | 12321D | אין להחליף |
| אתנול | VWR International LLC | 89125-188 | יכול להחליף במקביל מספקים אחרים. |
| שקיות מקפיא בגודל גלון | Ziploc | NA | יכול להחליף במקביל מספקים אחרים. |
| Gemini EM Microplate Reader | מכשירים מולקולריים | EM | יכול להשתמש בפלואורומטר אחר הקורא צלחות של 96 בארות מלמעלה. |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P3786 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| מעיל מעבדה | Workrite | J1367 | יכול להחליף בשווה ערך מספקים אחרים. |
| נוזל N2 | כל | NA | יכול להחליף בשווה ערך מספקים אחרים. |
| נוזל N2 dewar | Thermo Fisher Scientific | 4150-9000 | יכול להחליף במקביל מספקים אחרים. |
| מערכת טיהור מים אולטרה-טהורה Milli-Q | Millipore Sigma | SYNS0R0WW | |
| מיני צנטריפוגה | Eppendorf | 5404000014 | |
| מים בדרגה מולקולרית | Thermo Fisher Scientific | 4387937 | יכול להחליף במקביל מספקים אחרים. |
| מרגמות | VWR International LLC | 89038-150 | יכול להחליף במקביל מספקים אחרים. |
| כפפות ניטריל | Thermo Fisher Scientific | 19167032B | יכול להחליף במקביל מספקים אחרים. |
| מגבות נייר | VWR International LLC | BWK6212 | יכול להחליף במקביל מספקים אחרים. |
| סרט איטום צלחת PCR | Thermo Fisher Scientific | NC9684493 | |
| צינורות רצועת PCR | USA Scientific | 1402-2700 | |
| Pestles | VWR International LLC | 89038-166 | יכול להחליף במקביל מספקים אחרים. |
| מרית פלסטיק | LevGo, Inc. | 17211 | |
| פלטינום Hot Start PCR Master Mix (2x) | Thermo Fisher Scientific | 13000014 | |
| PNAs - כלורופלסט ומיטוכונדריה | PNA Bio | NA | הקפד לאמת את הרצף מבחינה ביואינפורמטית |
| משקפי מגן | Millipore Sigma | Z759015 | יכול להחליף במקביל מספקים אחרים. |
| קיוביט 3.0 פלואורומטר | תרמו פישר סיינטיפיק | Q33216 | |
| קיוביט dsDNA HS ערכת בדיקה | תרמו פישר סיינטיפיק | Q32854 | |
| פטיש גומי (אופציונלי) | Ace Hardware | 2258622 | יכול להחליף במקביל מספקים אחרים. |
| מספריים או מספריים | VWR International LLC | 89259-936 | יכול להחליף במקביל מספקים אחרים. |
| את חפירה | הום דיפו | 2597400 | יכול להחליף במקביל מספקים אחרים. |
| אספן ליבת קרקע (קוטר קטן: < 1 אינץ') | Ben Meadows | 221700 | יכול להחליף במקביל מספקים אחרים. |
| בקבוקי ריסוס | Santa Cruz Biotechnology | sc-395278 | יכולים להחליף במקביל מספקים אחרים. |
| פריימרים ברקודים מותפלים סטנדרטיים (10 ומיקרו; M) (טבלה 1) | IDT | NA | 4 nmole Ultramer DNA Oligo עם התפלה סטנדרטית. מתאם NGS ופריימר ריצוף (טבלה 1) מיועדים לשימוש עם Illumina MiSeq באמצעות כימיה v3. |
| Thermocycler | Thermo Fisher Scientific | E950040015 | יכול להחליף במקביל מספקים אחרים. |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | יכול להחליף במקביל מספקים אחרים. |
| שקילת סירות | ספקטרום כימיקלים | B6001W | יכול להחליף במקביל מספקים אחרים. |
מקורות
- Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. R. Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies. Nat Rev Genet. 17 (6), 333-351 (2016).
- Soergel, D. A. W., Dey, N., Knight, R., Brenner, S. E. Selection of primers for optimal taxonomic cl....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
