המטרה של פרוטוקול זה היא לפקח spectrophotometrically טרנס-פלזמה ממברנה אלקטרון תחבורה ניצול אלקטרון חוץ-תאית acceptors לנתח אנזימטי אינטראקציות העלולות להתעורר עם אלה acceptors אלקטרון חוץ-תאית.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
מדידת הטרנס-פלזמה ממברנה אלקטרון תעבורה על-ידי C2C12 Myotubes
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
טרנס-פלזמה ממברנה אלקטרון תחבורה (tPMET) ממלא תפקיד הגנה על תאים מלחץ חותכות תאיים, כמו גם הגנה מפני נזק על ידי חמצון חוץ-תאית. תהליך זה של העברת אלקטרונים תאיים reductants כדי חמצון חוץ-תאית אינה מוגדרת היטב. כאן אנו מציגים מבחני spectrophotometric על ידי C2C12 myotubes לעקוב אחר tPMET ניצול acceptors את האלקטרונים חוץ-תאית: tetrazolium מסיסים במים מלח-1 (WST-1) ו- 2, 6-דיכלורופנול אינדופנול (DPIP או DCIP). באמצעות הפחתה של acceptors אלקטרונים אלה, אנו מסוגלים לעקוב אחר התהליך בניתוח בזמן אמת. עם התוספת של אנזימים כגון ascorbate אוקסידאז (AO), סופראוקסיד דיסמוטאז (SOD) מבחני, אנחנו ניתן לקבוע איזה חלק של tPMET עקב ייצור ייצוא או סופראוקסיד ascorbate, בהתאמה. בעוד WST-1 הוצגה כדי להפיק תוצאות יציב עם רקע נמוך, DPIP היה יכול להיות מחומצן מחדש לאחר התוספת של אאו, עשב, אשר הודגם עם ניתוח spectrophotometric. שיטה זו ממחישה assay spectrophotometric בזמן אמת, רב טוב, מהיר, עם יתרונות על פני שיטות אחרות ששימשו לעקוב אחר tPMET, כגון ferricyanide (FeCN) וצמצום c ferricytochrome.
מבוא
היכולת של ממברנות פלזמה מטוהרים להפחית אלקטרון acceptors הוביל התצוגה כי קרום פלזמה יש קיבולת של חמצון-חיזור הגלום1. ראיתי בעבר פטריות, צמחים, בעלי חיים, tPMET הוא תהליך משותף ל4,3,2,אורגניזמים מספר5. באופן ספציפי, תהליך זה הוכח שמר האפייה, בתאים הגזר, אריתרוציטים, לימפוציטים, אוסטאוסרקומה, מלנומה, מקרופאגים, שרירי השלד ו נויטרופילים2,3, 4 , 5 , 6 ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הערה: ראה איור 1 סקירה סכמטי של השלבים החשובים.
1. WST-1 צמצום Assay
- לגדול, להבדיל C2C12 תאים חסיד באמצעות תא סטנדרטי לתרבות הליכים7 בצלחת 96-ובכן ניצול שורות A-F.
- השתמש מדיום בידול בהיקף בינוני (DMEM ששינה הנשר של Dulbecco) בתוספת 2% הסוס סרום, פניצילין U/mL 100 ו- 0.1 מ"ג/מ"ל סטרפטומיצין. דגירה התאים ב 37 ° C עם 5% CO2.
- בעת פיקוח על ascorbate מעורבות tPMET, תוספת בידול מדיה בחומצה אסקורבית 100 מיקרומטר. לאפשר לתאים דגירה בתקשורת בידול עבור ~ 24-48 שעות.
- להכין מלאי פתרונות WST-1 ו- PMS.
- כדי להפוך את מלאי 10 מ מ של WS....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
סטטיסטיקה בוצעו עם ANOVA באמצעים חוזרות באמצעות תוכנה סטטיסטית RStudio25. גודל מדגם הם הצביעו על האגדות איור.
כדי לפקח על tPMET, C2C12 myotubes נוצלו יחד עם acceptors אלקטרון חוץ-תאית, WST-1 ו- DPIP. אאו שימש כדי לקבוע איזה חלק של WST-1 ו DPIP הפחתת נבע ascorbate בזרימת SOD שימש כדי לקבוע איזה חלק של הפחתת WST-1 היה עקב שחרור סופראוקסיד חוץ-תאית. כפי שמוצג באיור2, C2C12 myotu.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הוצגו שתי שיטות ניצול אלקטרון חוץ-תאית acceptors, WST-1 ו- DPIP, במבחני spectrophotometric לעקוב אחר tPMET, C2C12 myotubes. עם הצמיחה של שורות תאים בהליכים תרבות רגיל, קורא צלחת ספקטרופוטומטרים, אפשרי לעקוב אחר tPMET עם אלה acceptors אלקטרונים ב וזמינותו microplate פשוט. צמצום WST-1 הוא לשחזור מכל טוב-כדי-טוב בתוך וזמינותו, אבל יש השתנות היומיומית. המקדם היומיומית של וריאציה (CV) ניצול PBS כמו המאגר הוא 0.18 את קורות חיים ניצול HBS כמו המאגר הוא 0.23.
מן הספרות הקודם mPMS וחומר WST-1, אנחנו שש.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים אין לחשוף.
תודות
ברצוננו להודות תומס בל, לין Mattathil, מארק Mannino, Neej פאטל לתמיכה טכנית שלהם. עבודה זו נתמכה על ידי שירות בריאות הציבור של ארצות הברית פרס R15DK102122 במכון הלאומי של סוכרת, העיכול, מחלות כליה (NIDDK) ג'ונתן פישר. תוכן כתב היד הוא אך ורק באחריות המחברים, ואינם מייצגים בהכרח את נופי הרשמי של NIDDK או מכוני הבריאות הלאומיים.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| C2C12 myoblasts | אוסף תרבות מסוג אמריקאי | CRL-1772 | |
| מדיום הנשר המותאם של Dulbecco - דל גלוקוז | Sigma | D6046 | |
| קומפלקס סרום לבעלי חיים Fetal Plex | Gemini Bio-Products | 100-602 | |
| פניצילין-סטרפטומיצין | סיגמא | 516106 | |
| סרום סוסים | Gibco Technologies | 16050-130 | |
| Dulbecco's phosphate buffered | salt Sigma | D8537 | |
| trypsin-EDTA | Sigma | T4049 | |
| 15 ס"מ כלי תרבית | TPP | 93150 | |
| 96 צלחות תרבית באר | TPP | 92096 | |
| 2-(4-יודופניל)-3-(4-ניטרופניל)-5-(2,4-דיסולפופניל)-2H-טטרזוליום מלח נתרן (WST-1) | Accela ChemBio Inc | SY016315 | |
| פנאזין מתוסולפט | Sigma | P9625 | |
| חומצה L-אסקורבית | Sigma | A5960 | |
| אסקורבט אוקסידאז | סיגמא | A0157 | |
| סופראוקסיד דיסמוטאז | Sigma | S5395 | |
| 2,6-דיכלורואינדופנול מלח נתרן | ICN Biomedicals | 215011825 | |
| D-(+)-גלוקוז | Sigma | G7528 | |
| HEPES מלח נתרן | Sigma | H3784 | |
| נתרן כלורי | Sigma | S7653 | |
| אשלגן כלורי | Fisher Scientific | BP366 | |
| מגנזיום גופרתי הפטהידרט | סיגמא | M5921 | |
| סידן כלוריד דיהידרט | סיגמא | C7902 | |
| אשלגן פוספט | פישר סיינטיפיק | BP363 | |
| Pierce BCA ערכת בדיקת חלבון | Thermo Scientific | 23225 | |
| ספקטרופוטומטר Powerwave X-I | Biotek Insturments | הופסק | |
| Spectronic Genesys 5 ספקטרופוטומטר | Thermo Scientific | 336001 | |
| PureGrade 96-well microplate, F-bottom, שקוף, לא מטופל, לא סטרילי | MidSci | 781602 | |
| ברזל (II) כלוריד טטרהידראט | סיגמא | 220299 | |
| ברזל (II) סולפט הפטהידראט | סיגמא | 215422 | |
| היפוקסנטין | סיגמא | H9636 | |
| קסנטין אוקסידאז | סיגמא | X4500 | |
| Excel | Microsoft | ||
| R Studio | Rstudio | https://www.rstudio.com/products/rstudio/ | |
| KC4 | Biotek Insturments | הופסק |
מקורות
- Kilberg, M. S., Christensen, H. N. Electron-transferring enzymes in the plasma membrane of the Ehrlich ascites tumor cell. Biochemistry. 18 (8), 1525-1530 (1979).
- Crane, F. L., Roberts, H., Linnane, A. W., Low, H. Transmembrane ferricyanide ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
