הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

טיפול תוך-ברובני עם בדיקות Resiniferatoxin וכאב בעכברים

8.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/57570

⸱

2 בספטמבר 2020

 ,  , 
1Laboratory of Clinical Pharmacy and Pharmacology, Musashino University, 2Research Institute of Pharmaceutical Sciences, Musashino University

במאמר זה

סיכום

קולטן ארעי פוטנציאל vanilloid סוג 1 (TRPV1) באזור העל-שדרתי הוצע לשחק כמה תפקידים בתפקוד המוח. מתואר כאן הוא פרוטוקול להזרקה intracerebroventricular של resiniferatoxin עבור desensitization TRPV1 על-שדרתי בעכברים. כמו כן, מוצגים הליכים לבדיקות כאב מסוימות.

תקציר

קולטן ארעי פוטנציאל vanilloid סוג 1 (TRPV1), ערוץ cation תרמוסיבי, ידוע לעורר כאב בעצבים ההיקפיים. בנוסף לתפקוד ההיקפי שלה, מעורבותה בתפקודי המוח הוצעה גם. Resiniferatoxin (RTX), אגוניסט TRPV1 אולטרהpotent, כבר ידוע לגרום לדה-רגישות לטווח ארוך של TRPV1, וdesensitization זה כבר גישה חלופית לחקירת הרלוונטיות הפיזיולוגית של תאים המביעים TRPV1. כאן אנו מתארים פרוטוקול לטיפול תוך-ברוונטרי (i.c.v. ) עם RTX בעכברים. הליכים מתוארים לבדיקת nociception לגירוי TRPV1 היקפי (בדיקת RTX) וגירוי מכני (בדיקת לחץ זנב) ולאחר מכן בצע. למרות התגובות nociceptive של עכברים שניתנו RTX i.c.v. היו דומים לאלה של קבוצות הבקרה, RTX-i.c.v.-מנוהל עכברים היו רגישים לאפקט משכך כאבים של פרצטמול, מציע כי טיפול RTX i.c.v. יכול לגרום לדה-רגישות TRPV1 סלקטיבית על-טבעית. מודל עכבר זה יכול לשמש כמערכת ניסיונית נוחה ללימוד התפקיד של TRPV1 בתפקוד המוח/על-שדרתי. טכניקות אלה ניתן להחיל גם על מחקרים של הפעולות המרכזיות של תרופות אחרות.

מבוא

בעלי חיים מקבלים גירויים פיזיים וכימיים שונים מהסביבה שלהם באמצעות חיישנים על העצבים ההיקפיים. קולטן ארעי פוטנציאל vanilloid סוג 1 (TRPV1) הוא אחד התרמוזים, לא בחירה cation ערוצים הפועלים כמו חיישניחום 1,2, והפעלה ו / או אפנון של TRPV1 ידוע להיות צעד מפתח עבור nociception בהקשרים נורמליים ודלקתיים3. למרות דפוס הביטוי הכולל הוא שנוי במחלוקת, ביטוי של TRPV1 הוצע גם באזורים על-שדרתיים, להיות מעורב בפעילויות מוח שונות (כולל nociception4, thermoregulation5,חרדה 6, הפרעת קשבוריכוז 7, ואפילפסיה8). יתר על כן, לאחרונה הוצע כי פרצטמול, משכך כאבים בשימוש נרחב, מתווכת את ההפעלה של TRPV1 המרכזי כדי לעורר את פעולת משכךהכאבים שלה 9,10.

ניהול עודף TRPV1 אגוניסט כולל קפסאיצין ו resiniferatoxin (RTX) לבעלי חיים מוביל למותם של נוירונים TRPV1 חיובי ו desensitization לטווח ארוך אנטגוניסטים TRPV111,12. בשילוב עם היישום המקומי(תוך-תקל 13,,14,תוך-15,,16,,17ו-intraganglional18),גישה זו של אבלציה כימית סיפקה דרך חלופית לחקור את הפונקציות הפיזיולוגיות של TRPV1. לאחרונה דיווחנו כי הזרקת intracerebroventricular (i.c.v.) של RTX מעכב את ההשפעה משכך כאבים של פרצטמול בעכברים, מציע supraspinal סלקטיבי TRPV1 desensitization19. בכתב היד הזה, אנו מציגים את הפרוטוקול המדויק להזרקת I.C.V. ובדיקות כאב עוקבות.

הזרקה ישירה של תרופות לחדרי המוח מאפשרת ללמוד את ההשפעות המרכזיות שלהם תוך מינימליזציה של כל השפעות היקפיות. הליך ההזרקה i.c.v. המוצג כאן הוא שינוי של השיטה שדווחה על ידי היילי ומקקורמיק20. שיטה זו היא פשוטה הכרוכה החדרה של מחט הזרקה לתוך החדרים לחוץ דרך תפר הקורונה ואינה דורשת כל ציוד מיוחד או הליכים כירורגיים עבור קנטוריה.

יישום מקומי היקפי של אגוניסטים TRPV1 מעורר תחושת כאב בוער ודלקת נוירוגנית. עכברים שטופלו באופן שיטתי בעכברי RTX ו- TRPV1-KO אינם רגישים לגירוי זה13. ביצענו הזרקת תוך פלנטר של RTX (בדיקת RTX) כדי לאשר את השימור של TRPV1 היקפי ב RTX-i.c.v. עכברים . שיטה זו היא שינוי של מבחן פורמלין קונבנציונלי21.

דווח כי עכברים שטופלו באופן שיטתי בעכברי RTX ו- TRPV1-KO מראים סף רגיללגירוייםמכניים 11,13,22. כאן אנו מציגים הליך לבדיקת לחץ הזנב לבדיקת שינויים באפקט משכך כאבים של פרצטמול.

כל ההליכים הללו הם אורתודוקסיים ורב-תכליתיים, ותוכלים ליישם אותם במחקרים של תרופות אחרות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל הפרוטוקולים הניסיוניים המשמשים כאן אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים ושימוש של אוניברסיטת Musashino. עכברי ddY זכר (SLC, Shizuoka, יפן) הוחזקו לפחות 7 ימים תחת מחזור אור / כהה 12 שעות לפני ניסויים עם מים ומזון אד libitum. עכברים בני 5 או 6 שבועות שימשו לניסויים.

1. הכנת סמים

  1. RTX מחזירה את תחביר ה
    הערה: פתרון RTX אלכוהולי עלול לגרום לכוויות חמורות בעור ולנזק לעיניים. הקפד להשתמש בכפפות גומי ומשקפיים להגנה בעת הטיפול. ניתן להשתמש בפתרון מניות זה במשך 6 חודשים.
    1. להוסיף 500 μL של אתנול 1 מ"ג של RTX.
    2. להוסיף 500 μL של פוליאוקסיאתילן (20) מונוולט סורביטן לפתרון לעיל ומערבולת גם.
    3. מוסיפים 4 מ"ל של תמיסת מלח פיזיולוגית לתערובת ומערבלת היטב.
    4. Aliquot 40 μL של הפתרון לתוך צינורות 1.5 מ"ל מכסה בורג, ולאחסן אותם ב -40 °C.
  2. פרצטמול (אצטמול)
    1. להוסיף 20% w / v פרופילןגליקול פתרון פרצטמול בריכוז של 30 מ"ג / מ"ל, ולהמיס עם sonicator. מאז פרצטמול עשוי לזרז בטמפרטורת החדר כמה שעות לאחר הפירוק, להכין ממש לפני השימוש או לשמור על הפתרון חם עד השימוש.

2. הזרקת תת עורית או תוך-עורית של RTX

  1. להפשיר את הפתרון מצויד מוכן ב 1.1. מעל ולדלל אותו ל 20 μg / מ"ל בנוזל מוחי שדרתי תמיסת מלח או מלאכותי (ACSF) המורכב (ב mM): 119 NaCl, 2.5 KCl, 1 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 11 גלוקוז, 1.3 MgSO4, 2.5 CaCl2 שווה עם 95% O2 ו 5% CO2 (pH 7.2).
  2. להרדמה עכברים עם מלח נתרן פנטוברביטל (60 מ"ג/ק"ג, תוך-זמנית), ולבדוק אם יש אובדן הרפלקס הנכון.
  3. לטיפול S.C., להזריק RTX (20 μg / מ"ל) לתוך החלק האחורי של הצוואר בנפח של 0.1 מ"ל / 10 גרם משקל גוף. עבור קבוצת הביקורת, להזריק את הרכב (10% אתנול, 10% פוליאוקסיאתילן (20) מונוולט סורביטן ו 80% תמיסת מלח) באותו אופן.
  4. לטיפול i.c.v. , להזריק 5 μL של RTX (20 μg / מ"ל) לתוך החדר הימני לכיוון. עבור קבוצת הביקורת, להזריק את הרכב (10% אתנול, 10% פוליאוקסיאתילן (20) מונוולט סורביטן ו 80% ACSF) באותו אופן.
    1. להעביר מחט חד פעמית 27-G דרך צינור מתכת (0.8 מ"מ I.D. ) כדי לחשוף את קצה 3.0-3.5 מ"מ של המחט(איור 1A).
    2. חיטו את ראש העכבר עם 70% אלכוהול, והחזיקו את עצמות העכבר בחוזקה עם האצבעות(איור 1B).
      הערה: שים לב לתנוחות של בלטים סקוומוסליים, מאז בלטים אלה ישמשו ציוני דרך להזרקה.
    3. להזיז את המחט לרוחב על הקרקפת, ולמצוא את התפר sagittal כמו קצה המחט הוא מכור על התפר.
    4. מעבירים את הקצה כ-1 מ"מ ימינה, ואז מזיזים את הקצה בכיוון ה-rostrally, ומצאו את תפר הקורונה עם 2.4.3. (איור1B).
    5. הכנס את המחט לאט ובמאונך, הזרק את פתרון RTX תוך כ-10 שניות והחזק אותה למשך כ-10 שניות.
    6. משוך את המחט לאט, ולהחזיר את העכבר לכלוב הבית שלה. דימום הוא בדרך כלל מינימלי או נעדר. אם מתרחש דימום גדול, יש לשקול שימוש בעכבר אחר.
  5. הקצה את העכברים שטופלו מראש כנבדקים למבחן RTX או למבחן לחץ הזנב (שלב 3 ו- 4, בהתאמה).

3. מבחן RTX

הערה: הבדיקה מתבצעת בין השעות 10:00-17:00. חדר הבדיקות מתוחזק ב-200 לוקס ו-24-26 מעלות צלזיוס.

  1. שבוע לאחר טיפולים מוקדמים עם RTX (שלב 2.), להעביר עכברים לחדר הבדיקה לפחות 60 דקות לפני תחילת הבדיקה.
  2. לשקול ולמקם כל עכבר בנפרד בכלוב פרספקס (29.5 × 17.5 × 13.5ס"מ 3 גובה) לפחות 30 דקות לפני תחילת הבדיקה כדי לאפשר לו להסתגל לסביבה.
    הערה: יש לאזן את סדר הבדיקות בין קבוצות טיפול מקדים.
  3. לתת פרצטמול (300 מ"ג/ק"ג) לעכבר תוך-אפילוניאלי 20 דקות לפני הבדיקה.
  4. החזק את העכבר בחופשיות בשקית בד קטנה, והכנס מחט 30-מד לתוך העקב של כף הרגל האחורית הימנית. לקדם את המחט תת עורית ליד רפידות הליכה, ולהזריק 20 μL של פתרון RTX (0.05 μg / מ"ל).
  5. למדוד את התקופה של ליקוק / נשך התנהגות באזורglabrous של כף הרגל המושפעת בכל בלוק 5 דקות.

4. בדיקת לחץ זנב

הערה: מד לחץ מסוג רנדל-סליטו משמש להערכת הסף עבור nociception מכני חריפה. הבדיקה מתבצעת בין השעות 10:00-17:00. חדר הבדיקות מתוחזק ב-200 לוקס ו-24-26 מעלות צלזיוס.

  1. שבוע לאחר טיפולים מוקדמים עם RTX (שלב 2.), להעביר עכברים לחדר הבדיקה, ולשקול ולמקם כל עכבר בנפרד בכלוב פרספקס.
  2. סמן את הנקודות ב- 1.5 ו- 2.5 ס"מ מבסיס הזנב.
  3. החזיקו את העכבר בחופשיות בשקית בד קטנה, והפעילו לחץ על הכתמים באמצעות בדיקה קהה.
    הערה: לחץ ניתק של 250 גרם מוטל כדי למנוע נזק לרקמות.
  4. לקבוע את הלחץ הדרוש כדי לעורר התנהגות בריחה (זנב מקציף, פיתול, ו חריקה), ולחשב את הסף nociceptive על ידי ממוצע הלחץ שנקבע בשני הנקודות.
  5. חזור על שלבים 4.3. ל-4.4. כל 15 דקות.
  6. לאחר קבלת הבסיס, לתת פרצטמול (300 מ"ג/ק"ג) לעכבר תוך-אפילוניאלי. לאחר הניהול, חזור על שלבים 4.3. ו 4.4 כל 15 דקות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

העכברים שטופלו ב-i.c.v. לא מראים חריגות ניכרות במראה שלהם, פעילויות ספונטניות,משקל גוף 19 וטמפרטורת גוף ליבה (קבוצת רכב מטופל, 38.4 ± 0.3 ° C, n = 6; קבוצת RTX שטופלה, 38.7 ± 0.2 °C, n = 6).

איור 2A-B מראה את ההיענות של עכברים שטופלו ב-S.C., או i.c.v. להזרקת תוך-פלנטר של RTX. התנהגות ליקוק / נשנשך של עכברים שטופלו ברכב היה יוצא דופן ב 10 דקות

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הצעד הקריטי ביותר בניסויים אלה הוא ההצלחה של הזרקת I.C.V. טכניקת הזרקת I.c.v. בשימוש כאן הוא די פשוט אבל דורש קצת תרגול. לפני ניסויים, מומלץ להתאמן עם צבעים (למשל 0.5% טריפאן כחול בתמיסת מלח). אם הזריקה מבוצעת כראוי, סימן מחט צריך להיות ניכר על תפר הקורונה ואת הצבע המוזרק צריך להיות נוכח בחדר ההתפלה ההתפלה ובברום השלישי. יתר על כן, הכנסה בכפייה יש להימנע במהלך ההזרקה. אם קצה המחט מונח כראוי על תפר הקורונה, המחט צריכה לחדור את הגולגולת בצורה חלקה.

טכניקה זו i.c.v. ניתן להחיל גם על עכברים ערים, ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי אינטרסים להצהיר

תודות

אף לא אחד .

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
ResiniferatoxinLKT LaboratoriesR1774המשמש לטיפולים מקדימים של s.c./i.c.v ובדיקת RTX
אצטמינופןIWAKI SEIYAKUבמתנה מ-IWAKI SEIYAKU
מלח נתרן פנטוברביטלטוקיו תעשיה כימיתP0776המשמש להרדמה
אתנול (99.5)Wako Pure Chemical Industries057-00456המשמש להמסת RTX
פוליאוקסיאתילן(20) סורביטן מונואולאטWako Pure Chemical Industries161-21621המשמש להמסת RTX
25 & #956; L מיקרו-מזרקהמילטון1702LTהמשמש להזרקת i.c.v.
100 & #956; L מיקרו-מזרקהמילטון1710LTהמשמש להזרקה תוך-פלנטרית
26-מד מחט חד פעמיתTERUMONN-2613Sהמשמש להזרקת i.c.v.
מחט חד פעמית 30-מדNIPRO01134המשמש להזרקה תוך-פלנטרית
מד לחץUgo BasileAnalgesy-Meter סוג 7200המשמש לבדיקת לחץ זנב

מקורות

  1. Cavanaugh, D. J., Chesler, A. T., Braz, J. M., Shah, N. M., Julius, D., Basbaum, A. I. Restriction of transient receptor potential vanilloid-1 to the peptidergic subset of primary afferent neurons follows its developmental downregulation in nonpeptidergic neurons. J Neurosci. 31 (28), 10119-10127 (2011).
  2. Caterina, M. J., Schumacher, M. A., Tominaga, M., Rosen, T. A., Levine, J. D., Julius, D. The capsaicin receptor: a heat-activated ion channel in the pain pathway. Nature. 389 (6653), 816-824 (1997).
  3. Caterina, M. J., et al. Impaired nociception and pain sensation in mice lacking the capsaicin receptor. Science. 288 (5464), New York, N.Y. 306-313 (2000).
  4. Starowicz, K., et al. Tonic endovanilloid facilitation of glutamate release in brainstem descending antinociceptive pathways. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 27 (50), 13739-13749 (2007).
  5. Gavva, N. R., et al. The vanilloid receptor TRPV1 is tonically activated in vivo and involved in body temperature regulation. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 27 (13), 3366-3374 (2007).
  6. Marsch, R., et al. Reduced anxiety, conditioned fear, and hippocampal long-term potentiation in transient receptor potential vanilloid type 1 receptor-deficient mice. Journal of Neuroscience. 27 (4), 832-839 (2007).
  7. Tzavara, E. T., et al. Endocannabinoids activate transient receptor potential vanilloid 1 receptors to reduce hyperdopaminergia-related hyperactivity: Therapeutic implications. Biological Psychiatry. 59 (6), 508-515 (2006).
  8. Nazıroğlu, M., Övey, İS. Involvement of apoptosis and calcium accumulation through TRPV1 channels in neurobiology of epilepsy. Neuroscience. 293, 55-66 (2015).
  9. Mallet, C., et al. TRPV1 in brain is involved in acetaminophen-induced antinociception. PloS one. 5 (9), 1-11 (2010).
  10. Barrière, D. A., et al. Fatty acid amide hydrolase-dependent generation of antinociceptive drug metabolites acting on TRPV1 in the brain. PloS one. 8 (8), e70690(2013).
  11. Jancsó, G., Kiraly, E., Jancsó-Gábor, A. Pharmacologically induced selective degeneration of chemosensitive primary sensory neurones. Nature. 270 (5639), 741-743 (1977).
  12. Szallasi, A., Blumberg, P. M. Vanilloid receptor loss in rat sensory ganglia associated with long term desensitization to resiniferatoxin. Neuroscience Letters. 140 (1), 51-54 (1992).
  13. Cavanaugh, D. J., et al. Distinct subsets of unmyelinated primary sensory fibers mediate behavioral responses to noxious thermal and mechanical stimuli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (22), 9075-9080 (2009).
  14. Jeffry, J. A., Yu, S. Q., Sikand, P., Parihar, A., Evans, M. S., Premkumar, L. S. Selective targeting of TRPV1 expressing sensory nerve terminals in the spinal cord for long lasting analgesia. PLoS ONE. 4 (9), e7021(2009).
  15. Jancsó, G. Intracisternal capsaicin: selective degeneration of chemosensitive primary sensory afferents in the adult rat. Neuroscience letters. 27 (1), 41-45 (1981).
  16. Gamse, R., Saria, A., Lundberg, J. M., Theodorsson-Norheim, E. Behavioral and neurochemical changes after intracisternal capsaicin treatment of the guinea pig. Neuroscience Letters. 64 (3), 287-292 (1986).
  17. Neubert, J. K., et al. Characterization of mouse orofacial pain and the effects of lesioning TRPV1-expressing neurons on operant behavior. Molecular pain. 4, 43(2008).
  18. Karai, L., et al. Deletion of vanilloid receptor 1-expressing primary afferent neurons for pain control. The Journal of clinical investigation. 113 (9), 1344-1352 (2004).
  19. Fukushima, A., Mamada, K., Iimura, A., Ono, H. Supraspinal-selective TRPV1 desensitization induced by intracerebroventricular treatment with resiniferatoxin. Scientific reports. 7 (1), 12452(2017).
  20. Haley, T. J., McCormick, W. G. Pharmacological effects produced by intracerebral injection of drugs in the conscious mouse. British journal of pharmacology and chemotherapy. 12 (1), 12-15 (1957).
  21. Tjølsen, A., Berge, O. G., Hunskaar, S., Rosland, J. H., Hole, K. The formalin test: an evaluation of the method. Pain. 51 (1), 5-17 (1992).
  22. Ohsawa, M., Miyabe, Y., Katsu, H., Yamamoto, S., Ono, H. Identification of the sensory nerve fiber responsible for lysophosphatidic acid-induced allodynia in mice. Neuroscience. 247, 65-74 (2013).
  23. Tanabe, M., Tokuda, Y., Takasu, K., Ono, K., Honda, M., Ono, H. The synthetic TRH analogue taltirelin exerts modality-specific antinociceptive effects via distinct descending monoaminergic systems. British journal of pharmacology. 150 (4), 403-414 (2007).
  24. Ono, H., et al. Reduction in sympathetic nerve activity as a possible mechanism for the hypothermic effect of oseltamivir, an anti-influenza virus drug, in normal mice. Basic & clinical pharmacology & toxicology. 113 (1), 25-30 (2013).
  25. Kauer, J. A., Gibson, H. E. Hot flash: TRPV channels in the brain. Trends in neurosciences. 32 (4), 215-224 (2009).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

הזרקה תוך-חדרית מוחיתטיפול ברזיניפרטוקסיןדה-סנסיטיזציה של TRPV1מבחני כאב בעכבריםמבחן לחץ זנבמבחן נוציספציה RTXאנלגזיה של אצטמינופןסלקטיביות סופרא-ספינליתנוירופרמקולוגיה של עכבריםאגוניסט של TRPV1
טיפול תוך-ברובני עם בדיקות Resiniferatoxin וכאב בעכברים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.