מאמר שיטה

הכנה A11-חיוביות β-עמילואיד אוליגומר והערכה באמצעות נקודה סופג ניתוח

11.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/57592

⸱

22 במאי 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Ningbo Key Laboratory of Behavioral Neuroscience, Zhejiang Provincial Key Laboratory of Pathophysiology, School of Medicine, Ningbo University, 2Li Dak Sum Yip Yio Chin Kenneth Li Marine Biopharmaceutical Research Center, Ningbo University, 3School of Materials Science and Chemical Engineering, Ningbo University

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר כיצד להכין oligomers Aβ פפטיד סינתטי במבחנה וכן להעריך כמויות יחסיות של אוליגומר Aβ על ידי נקודה סופג ניתוח.

תקציר

Β-עמילואיד (Aβ) הוא פפטיד הידרופוביות עם נטייה מהותי בעצמם לתוך אגרגטים. בין אגרגטים שונים, Aβ אוליגומר מקובל כמו עצבי מוביל בההתקדמות של מחלת אלצהיימר (AD), נחשבת לאירוע מכריע בפתוגנזה של המודעה. לכן, Aβ אוליגומר מעכבי יכול למנוע הקשורים ניוון מוחיים ו יש את הפוטנציאל להיות מפותח כמו מחלות שינוי טיפולי של AD. עם זאת, צורה שונה הפרוטוקולים של Aβ אוליגומר עלול להוביל oligomers עם מאפיינים שונים. יתר על כן, אין שיטות רבות מעכבי אוליגומר מסך ביעילות1-42 Aβ. נוגדן A11 יכולה להגיב עם ערכת משנה של רעילים אוליגומר1-42 Aβ במבנים β-גיליון אנטי-מקביל. ב פרוטוקול זה, אנו מסבירים כיצד להכין דוגמה אוליגומר עשיר A11-חיוביות Aβ1-42 סינתטי Aβ1-42 פפטיד במבחנה וכן להעריך כמויות יחסיות של A11-חיוביות Aβ1-42 אוליגומר בדגימות מאת סופג נקודה ניתוח באמצעות A11 ו Aβ1-42-נוגדנים ספציפיים 6E10. באמצעות פרוטוקול זה, מעכבי של A11-חיוביות Aβ1-42 אוליגומר יכולים גם להיות מוקרן מתוצאות הניסוי הכמותיים למחצה.

מבוא

מחלת אלצהיימר (AD) היא אחת ממחלות ניווניות החשוב ביותר המשפיעים על קשישים ברחבי העולם1. מקובל כי הצבירה חריגה של β-עמילואיד (Aβ) עשוי להיות הגורם המוביל פתולוגי של AD. Aβ אגרגטים הם המרכיבים העיקריים של הפלאק סנילי, אחד סמנים ביולוגיים במוחם של חולי אלצהיימר. יתר על כן, אגרגטים Aβ, כולל oligomers בפרט, לייצר neurotoxicity חזק, אשר עשוי להיות הגורם למוות עצביים התקדמות לספירה. לכן, עיכוב של היווצרות אוליגומר Aβ עשוי למנוע הקשורים ניוון מוחיים, Aβ אוליגומר מעכבי יכול להתפתח כמו מחלות שינוי טיפולי של AD. מחקרים רבים השתמשו פפטיד Aβ סינתטי כדי ליצור oligomers חוץ גופית בתוך, מורפולוגיות ו מבנים של oligomers Aβ מלאכותיים, ולחקור את מעכבי של Aβ אוליגומר באמצעות במבחנה מודלים2,3 , 4. עם זאת, שונה במבחנה היווצרות הפרוטוקולים של Aβ אוליגומר עלול להוביל אוליגומר עם מאפיינים מורפולוגיים שונים, אשר עלול לגרום התוצאות למחפשי בקרב קבוצות מחקר שונות. לכן, עבור Aβ אוליגומר פרוטוקול סטנדרטי היווצרות דרוש בדחיפות.

עד עכשיו, שיטות רבות לא דווחו ישירות לאתר Aβ oligomers. שידור מיקרוסקופיה אלקטרונית (TEM) שאינם denaturing בג'ל, מקושרים-אנזים immunosorbent assay (אליסה), נקודה סופג ניתוח יכול לשמש כדי לבחון את כמות ו/או המורפולוגיה של Aβ אוליגומר במבחנה5, 6. לדוגמה, המורפולוגיה ואת המבנה של Aβ אוליגומר יכול להיות שנצפו ב- TEM. כמויות יחסיות והגודל המולקולרי של הסיכומים Aβ יכול להימדד על-ידי-denaturing בג'ל. אליסה יכול לשמש כדי לקבוע Aβ אוליגומר סרום, פלזמה, תמציות של רקמת המוח. לבסוף, נקודה סופג ניתוח, טכניקה המשמשת לזיהוי, ניתוח וזיהוי של חלבונים, ניתן להשתמש כדי להעריך את הריכוז היחסי של Aβ אוליגומר בדגימות שונות בעזרת נוגדנים אוליגומר וספציפיות Aβ. יתר על כן, נקודה סופג assay מציעה חיסכון משמעותי בזמן, בג'ל וההליכים blotting ג'לים אינם נדרשים. לכן, assay זה משמש בדרך כלל כדי מסך פוטנציאלי Aβ אוליגומר מעכבי. המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לתאר שיטה יחסית פשוטה, אמינים ובעלי לשחזור להכין דוגמה אוליגומר עשיר1-42 . Aβ, כדי לנתח את הכמויות של Aβ1-42 אוליגומר על ידי dot סופג ניתוח, וכדי מסך Aβ אוליגומר מעכבי באמצעות תוצאות ניסויי למחצה כמותית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. פתרון הכנה

הערה: ראה טבלה של חומרים עבור ריאגנט מקורות.

  1. להכין פתרון 5% אלבומין שור (BSA) על-ידי הוספת 5 g של BSA 100 מ של מים מזוקק פעמיים. לערבב אותם לחלוטין על-ידי vortexing אותם. אחסן את הפתרון ב 4 ° C עד כחודש.
  2. להכין פתרון A11 נוגדן אנטי אוליגומר (1:1, 000) על-ידי הוספת 10 µL של פתרון מניות נוגדן 10 מ"ל של הפתרון BSA 5%. לערבב אותם לחלוטין על-ידי vortexing אותם. אחסן את הפתרון ב 4 ° C עד כחודש.
  3. להכין פתרון 6E10 נוגדן anti-Aβ (1:1, 000) על-ידי הוספת 10 µL של פתרון מניות נוגדן 10 מ"ל של 5% BSA פתרון. מערבבים אותם לחלוטין על-ידי vortexing. אחסן את הפתרון ב 4 ° C עד כחודש.
  4. להכין פתרון OC נוגדן anti-fibrillar אוליגומר (1:1, 000) על-ידי הוספת 10 µL של פתרון מניות נוגדן 10 מ"ל של 5% BSA פתרון. מערבבים אותם לחלוטין על-ידי vortexing. אחסן את הפתרון ב 4 ° C עד כחודש.
  5. להכין באגירה טריס מלוחים (TBS) מניות פתרון על-ידי הוספת 24 גרם של טריס בסיס ו- g 88 של NaCl 1,000 מיליליטר מים מזוקק פעמיים. להתאים את ה-pH ל 7.4. אחסן את הפתרון ב 4 ° C עד 3 חודשים.
  6. להכין תמיסת מלח באגירה טריס והפתרון Tween-20 (TBST) על-ידי הוספת 1 מ"ל של רצף-20 100 מ של TBS מניות פתרון ו- 900 מל מזוקק פעמיים מים.
  7. להכין פתרון נוגדנים משניים על-ידי הוספת 10 µL של חזרת peroxidase (HRP) העז נגד הארנב IgG (H + L) עד 10 מ"ל של פתרון TBST. לערבב אותם לחלוטין על-ידי vortexing אותם. אחסן את הפתרון ב 4 ° C עד כחודש.
  8. להמיס 3.68 g של כורכומין ב 1 מ"ל של דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד) כדי ליצור פתרון מניות כורכומין 10 מ מ.
  9. להמיס 5 מ"ג של Aβ סינתטי1-42 ב- 2 מ של 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-פרופנול (HFIP) כדי ליצור פתרון מונומר Aβ 2.5-מ"ג/מ"ל. מקום זה בטמפרטורת החדר (25 ° C) במשך 20 דקות להפוך 100 µL aliquots ולאחסן ב-20 ° C עד 6 חודשים.
    הערה: הליך זה אמורה לפעול מהר ככל האפשר. אמור לנתק את הטיפים פיפטה כדי להבטיח pipetting מדויק.
  10. להכנת נוזל electrochemiluminescence (ECL) על ידי ערבוב ECL נוזל A ו- B עם יחס נפח של 1:1. הפתרון צריך להיות מוכן רק לפני השימוש.

2. הכנת הדוגמא

הערה: בצע את הכנת הדוגמא 2 ימים לפני הנקודה סופג ניתוח.

  1. להוסיף µL 900 של מים מזוקק פעמיים שפופרת של Aβ1-42 מונומר פתרון; הריכוז של Aβ1-42 תהיה 0.25 מ"ג/מ"ל. מניחים את התערובת בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות.
  2. להתנדף הפתרון עם גז חנקן טוהר גבוהה עד הנפח שלה µL עם-850. הריכוז של הפתרון1-42 Aβ יהיה על 0.29 מ"ג/מ"ל.
    הערה: הפתרון צריך מנערים מפעם לפעם כדי להבטיח ש-HFIP הוא התאדה במלואו. בדרך כלל, לאחר 30 דקות של אידוי, אמצעי האחסון של הפתרון שיורית נמצא µL עם-850.
  3. את הפתרון מניות כורכומין הפתרון עובד כורכומין (0.2 ו- 2 מיקרומטר) מדולל עם מים מזוקק פעמיים. מערבבים את פתרון1-42Aβ וכורכומין עובד פתרון עם יחס נפח של 1:1. הריכוזים הסופי של כורכומין יהיה 0.1 1 מיקרומטר.
    הערה: מעכבי אוליגומר פוטנציאלי יכול להיות מעורב עם הפתרון1-42 Aβ כל יחס במידת הצורך.
  4. לנער את הפתרון באופן רציף ב מסית מגנטי (ראה טבלה של חומרים).
    1. לתקן תיבה מפריד פלסטיק התועמלן מגנטי. מניחים 2 מגנטי מערבבים ברים ב 2 פינות של תיבת ולמקם הצינורות מדגם במרכז תיבת.
    2. לנער את תיבת בטמפרטורת החדר (25 ° C) במשך 48 שעות.
      הערה: המהירות של התועמלן מגנטי הוא בסביבות 60 סל ד.
  5. Centrifuge הצינורות במשך 15 דקות ב 4 ° C ו- g x 18,000 לאסוף תגובת שיקוע.

3. נקודה סופג ניתוח

הערה: כל incubations המבוצעות מטרף אופקי.

  1. חתוך ניטרוצלולוזה ממברנה לרצועות רחב 1 ס"מ.
    הערה: הרוחב של קרום ניטרוצלולוזה ניתן להתאים בהתאם לצרכים ניסיוני.
  2. במקום 2-µL דגימות באופן שווה על 2 רצועות (רצועת 1 ו- 2) עם כל מרווח נקודת-0.5 ס מ.
  3. מניחים את הרצועות בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות עד ה-droplet על הלהקה יבש.
  4. דגירה את הרצועות עם פתרון BSA 5% למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
  5. יש לשטוף את הרצועות עם פתרון TBST עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  6. האחות הפתרון TBST. עבור h 1 בטמפרטורת החדר, דגירה רצועת 1 עם נוגדן אנטי אוליגומר A11 פתרון ולהפשיט 2 עם פתרון 6E10 של נוגדן anti-Aβ.
  7. לשטוף את הרצועות עם פתרון TBST שלוש פעמים, כל פעם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  8. האחות הפתרון TBST. דגירה את הרצועות עם פתרון נוגדנים משניים עבור 40 דקות בטמפרטורת החדר.
  9. לשטוף את הרצועות עם פתרון TBST שלוש פעמים, כל פעם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  10. באופן שווה להחיל את הנוזלים ECL מעורב השטח של הרצועות. לחשוף את הרצועות ב chemiluminescence אוטומטית מערכת הדמיה (ראה טבלה של חומרים).
    הערה: בדרך כלל, µL 300 של נוזל ECL מספיקה ממברנה אחת. הקרום חייב להישמר לח במהלך החשיפה. זמן החשיפה מחושבת באופן אוטומטי על ידי מערכת הדמיה.
  11. לעשות ניתוח גווני אפור באמצעות ImageJ (המכון הלאומי לבריאות) או תוכנות עיבוד תמונה אחרת כדי להשיג תוצאות כמותיות למחצה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כדי לבדוק אם מונומר1-42 Aβ יכול ליצור אוליגומר1-42 של Aβ לאחר הכנה, שימש ניתוח TEM. אין אגרגטים גלוי נצפו במדגם מומס HFIP Aβ1-42 מונומר (איור 1א'). יתר על כן, אגרגטים בעיקר הכדוריים בקוטר של סביב 10-80 ננומטר נצפו במדגם1-42 Aβ לאחר 48 שעות של טלטולים, רומז כי Aβ1-42 טפסים oligomers לאחר הכנה (איור 1B).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

פרוטוקול זה, אנחנו דיווחו שיטה להכין דגימות המכיל Aβ1-42 אוליגומר, וכדי לנתח כמויות A11-חיוביות Aβ1-42 אוליגומר ידי נקודה סופג ניתוח. למרות השיטות שלנו עבור הכנת Aβ1-42 אוליגומר עשיר דגימות די פשוטה, אמינים ובעלי לשחזור, ישנם עדיין כמה נקודות כדי שישימו לב אלינו. ראשית, HFIP משמש כדי להמיס את פפטיד1-42 Aβ סינתטי. פפטיד1-42 Aβ צבור יכול לפרק לתוך מונומר בפתרון HFIP. עם זאת, HFIP קל התנדפות, צמיגות של HFIP הוא נמוך מאוד. לכן, צריך להיות מומס פפטיד1-42 Aβ לתו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים הלאומי מדעי הטבע קרן של סין (U1503223, 81673407, 21475131), פרויקט המחקר מיושם על טכנולוגיה ללא מטרות רווח של פרובינציית Zhejiang (2016C 37110), Ningbo הבינלאומי המדע והטכנולוגיה פרויקט (2014D 10019), הקבוצה חדשנות עירונית Ningbo של מדעי החיים ואת הבריאות (2015C 110026), Ningbo Sci & טק לפרויקט משותף עושר (ג 2017 50042), Li Dak סכום ייפ Yio הסנטר קנת Li ימית ביולוגיות פיתוח הקרן, וקרן ק ג וונג מגנה באוניברסיטת Ningbo.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
A11 (ab126892 Rb pAb לאוליגומרים עמילואידים)AbcamGR91739-58
6E10 (בטא-עמילואיד ארנב Ab)תא  טכנולוגיית איתות2454S
OC (נוגדן אנטי-עמילואיד סיבים OC)MilliporeAB2286
חזרת פרוקסידאז (HRP) סמן עז נגד ארנב IgG (H+L) BeyotimeA0208
Aβ 1-42GL Biochem52487
1,1,1,3,3,3-Hexafiuoro-2-propanolAladdinI1523078
CurcuminSigmaC1386
Albumin Bovine VSolarbioA8020
נתרן כלוריSangon BiotechD920BA0003
נתרן דודציל סולפטSCR30166428
TRISSolarbioT8060
גליציןSolarbioG8200
  דימתיל סולפוקסידSolarbioD8370
5 פעמים; ג'ל ללא דנטורציה PAGE סמן חלבוןBeyotimeP0016
Genshare CFAS anyKD PAGEGenshareJC-PE022
ניטרוצלולוז טהור ממברנהPall CorporationT50189
מתנולSCR10014118
אתנולSCR10009218
טווח נמוך במיוחד  סמן חלבוןSolarbioPR1300
ממברנות העברהImmobilon-PSQISEQ00010
BeyoECL StarBeyotimeP0018A
Commassie Blue פתרון צביעה מהירBeyotimeP0017
הכל - מערכת הדמיה כימילומינסנציה אוטומטיתTanonTanon 5200
Image JNational מכוני בריאות
תוכנה לעיבוד תמונהAdobePhotoshop CS6
מערבל מגנטישנחאי Huxi

מקורות

  1. Lauren, J. Cellular prion protein as a therapeutic target in Alzheimer's disease. Journal of Alzheimer's Disease. 38 (2), 227-244 (2014).
  2. De Maio, A., Rivera, I., Cauvi, D. M., Arispe, N. Modulation of amyloid peptide oligomerization and toxicity by extracellular Hsp70. Biophysical Journal. 112 (3), 444(2017).
  3. Di Scala, C., Chahinian, H., Yahi, N., Garmy, N., Fantini, J. Interaction of Alzheimer's beta-amyloid peptides with cholesterol: mechanistic insights into amyloid pore formation. Biochemistry. 53 (28), 4489-4502 (2014).
  4. Xiang, S. Y., et al. Fucoxanthin inhibits beta-amyloid assembly and attenuates beta-amyloid oligomer-induced cognitive impairments. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65 (20), 4092-4102 (2017).
  5. Chang, L., et al. Protection against beta-amyloid-induced synaptic and memory impairments via altering beta-amyloid assembly by bis(heptyl)-cognitin. Scientific Reports. 5, 10256(2015).
  6. Yam, G. H. F., et al. In vitro amyloid aggregate forming ability of TGFBI mutants that cause corneal dystrophies. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (9), 5890-5898 (2012).
  7. Tomaselli, S., et al. The alpha-to-beta conformational transition of Alzheimer's A beta-(1-42) peptide in aqueous media is reversible: A step by step conformational analysis suggests the location of beta conformation seeding. ChemBioChem. 7 (2), 257-267 (2006).
  8. Shigemitsu, Y., et al. Nuclear magnetic resonance evidence for the dimer formation of beta amyloid peptide 1-42 in 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol. Analytical Biochemistry. 498, 59-67 (2016).
  9. Khan, M. V., Rabbani, G., Ahmad, E., Khan, R. H. Fluoroalcohols-induced modulation and amyloid formation in conalbumin. International Journal of Biological Macromolecules. 70, 606-614 (2014).
  10. Fang, F., et al. 5-hydroxycyclopenicillone, a new beta-amyloid fibrillization inhibitor from a sponge-derived fungus trichoderma sp HPQJ-34. Marine Drugs. 15 (8), 260(2017).
  11. Shiao, Y. J., Su, M. H., Lin, H. C., Wu, C. R. Echinacoside ameliorates the memory impairment and cholinergic deficit induced by amyloid beta peptides via the inhibition of amyloid deposition and toxicology. Food & Function. 8 (6), 2283-2294 (2017).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

A11TEMTBST

מאמרים קשורים