מאמר שיטה

דור של אינסולין נטולת לגרדום, תלת מימדי לבטא Pancreatoids העכבר אבות הלבלב במבחנה

DOI:

10.3791/57599

⸱

2 ביוני 2018

 ,  ,  , 
1Program in Developmental Biology, Baylor College of Medicine, 2Center for Cell and Gene Therapy, Texas Children's Hospital, and Houston Methodist Hospital, Baylor College of Medicine, 3Molecular and Cellular Biology Department, Baylor College of Medicine, 4Stem Cell and Regenerative Medicine Center, Baylor College of Medicine, 5McNair Medical Institute, Baylor College of Medicine

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לייצר אינסולין לבטא 3D מאתר pancreatoids בין לתרשים e10.5 הפומבית אבות הלבלב מזנכימה המשויך את...

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הלבלב הוא שאיבר מורכב מורכב רבים לסוגי תאים שונים לעבוד יחד כדי לווסת הומאוסטזיס הגלוקוז הדם והעיכול. סוגי תאים אלה כוללים מפריש אנזימים תאים acinar, מערכת ductal arborized אחראי להובלה של אנזימי התאים האנדוקריניים במעיים, הורמונים.

בטא-תאים אנדוקריני הם סוג התא היחיד בגוף המייצרים אינסולין כדי להוריד את רמות הגלוקוז בדם. סוכרת, מחלה המאופיינת על ידי לאובדן או את תפקוד תאי בטא-מגיע לממדים של מגיפה. לכן חיוני להקים פרוטוקולים כדי לחקור את התפתחות תאי בטא יכול לשמש לסינון למטרות להפיק את התרופה ואת מבוססת תא הרפוי. בעוד חקירה ניסויית של פיתוח העכבר הוא חיוני, אין ויוו מחקרים הם מפרך ולגזול. תאים בתרבית מספקים פלטפורמה נוחה יותר להקרנה; עם זאת, הם אינם מסוגלים לשמור על גיוון הסלולר, ארגון אדריכלי, אינטראקציות סלולרי נמצאו ויוו. לכן חיוני לפתח כלים חדשים לחקור organogenesis הלבלב ופיזיולוגיה.

תאים אפיתל הלבלב לפתח בשיתוף הדוק עם מזנכימה מראשית organogenesis תאים לארגן, להבדיל לתוך האיבר למבוגרים מורכבות, כשיר מבחינה פיזיולוגית. הלבלב מזנכימה מספק אותות חשוב לפיתוח האנדוקרינית, שרבים מהם אינם מובנים היטב, ולכן קשה לסכם במהלך התרבות במבחנה . כאן, אנו מתארים את פרוטוקול organoids תלת מימדי, תאי עכבר מורכבים תרבות לשמור מזנכימה, הנקרא pancreatoids. ניצן הלבלב מאתר e10.5 גזור, חלופה מועדפת, תרבותי בסביבה נטולת לגרדום. אלו צפים תאים בעצמם עם מזנכימה עוטף את pancreatoid המתפתח ומספר תאי הבטא האנדוקרינית לפתח את acinar, את התאים צינור חזקים. מערכת זו ניתן ללמוד את האינטראקציות תא-תא תא גורל נחישות הארגון מבניים, מורפוגנזה, במהלך organogenesis, או על סמים, מולקולה קטנה, או בדיקה גנטית.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המופקע על מנגנוני להתפתחות תקינה של הפיזיולוגיה הוא בעל חשיבות עליונה להבין מחלה אטיולוגיה ולטפח בסופו של דבר שיטות טיפול. בעוד culturing, המבדילים תאי גזע מאפשר ניתוח תפוקה גבוהה ומהירה של פיתוח, הוא מוגבל על ידי הגוף קיים הידע בנושא מנגנוני ויסות גורל, באופן מלאכותי recapitulates פיתוח יחסית מדינה הומוגנית, מימדי1,2. לא רק ויוו פיתוח מושפע השפעות חיצוני, עם סוגי תאים שונים נישה, וחשש מספקת paracrine אותות ותמיכה ארגונית כדי להנחות organogenesis, אלא הפונקציה של תאים אלה מסתמך גם על שלהם הסביבה עבור הדרכה3,4,5. לאור החשיבות של אלה סימנים חיצוניים, המגבלות של בידול פרוטוקולים, מהות מפרך ויוו העכבר מודלים, מערכות חדשות נדרשים לחקור השפעול של תהליכים התפתחותיים בסיסיים ופיזיולוגיה.

הופעתה של פרוטוקולים ליצירת תלת מימדי, מורכבים organoids מספק מערכת קונגרואנטי ונוח ללמוד organogenesis, פיזיולוגיה, יעילות התרופה ו פתוגנזה אפילו. הקמת organoids מאתר עבור מערכות שונות כגון הקיבה6 ו המעי7 הרחיבו את ההבנה שלנו של organogenesis, מתן כלי ללמוד המורכבות התפתחותית עם מגבלות מועטות יותר מאשר ויוו ומודלים במבחנה . עקב ההתפתחויות הללו בתוך תא צורב מאתר היווצרות, כניסתו של אדם pluripotent גזע תאים אנושיים מעיים8, רשתית9, כליות10,11, מוחי12 organoids הופקו, ואת זה רפרטואר מוגבל רק על-ידי הידע הקיים לגבי מנגנוני התפתחות.

עניין מיוחד הוא הדור של הלבלב organoids, כמו מספר עצום של מחלות המכות סוגי התאים בלבלב, כולל תאים acinar וצינורות אי ספיקה הלבלב אקסוקרינית13, acinar תאי לבלב14ו תאי ביתא סוכרת15. רכישת ידע לגבי הפיתוח של סוגי התאים הללו יכול לסייע להבנת הפתולוגיה שלהם, גם, משמשים כפלטפורמה אישית והתרופות הקרנה או השתלת. בעבר, Greggio. ואח פיתח שיטה ליצירת organoids הלבלב מאתר זה מסכם את הדברים ויוו מורפוגנזה ולפתח מבנים מאורגנים, תלת מימדי, מתחם המורכב וכל השברים תא אפיתל הלבלב סוגי16,17. זהו צעד חשוב בשטח הלבלב, במיוחד כמו עשיית תאים במבחנה ניתן לאפשר חקירה הביולוגי של התפתחות תאי בטא. עם זאת, המחסור תאים אנדוקריני שהוקמה ב פרוטוקול זה אלא אם כן organoids היו מושתלים לתוך רקמות, איפה הנישה יכול אינטראקציה ולספק רמזים הדרכה17. מזנכימה מהווה את החלק הגדול ביותר של הגומחה, בכבדות כעוטפת האפיתל מתפתח מן בשלבים המוקדמים של organogenesis כדי בשלבים מאוחרים יותר, כולל delamination האנדוקרינית ובידול3,4, 18. האינטראקציה של מזנכימה הקל המתפתח עדיין דוגמה נוספת של איתות חיצוני ואת החשיבות של שמירה על ויוו המורכבות הסלולר ללמוד organogenesis.

כאן, אנו נתאר כיצד לייצר organoids הלבלב תלת מימדי, הנקרא pancreatoids, מ e10.5 הפומבית מאתר אבות הלבלב. Pancreatoids אלה שומרים על מזנכימה מקורית, בעצמם בתנאים לתרשים ולהפיק כל סוגי תאי הלבלב העיקריים, כולל מספר חזקים של תאי הבטא האנדוקרינית19. גישה זו היא המתאימה ביותר עבור הניתוח של פיתוח האנדוקרינית, כמו פרוטוקולים הקודמים חוסר בידול האנדוקרינית חזקים. עם זאת, המשתמשים בפרוטוקול עבור organoids הלבלב כפי שתואר על ידי Greggio et al. מתאים יותר לניתוח של הסתעפות אפיתל הלבלב, מורפוגנזה, בתור הסתעפות יותר מוגבל ב- pancreatoids.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הניסויים המתוארים בשיטה זו אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה של ביילור לרפואה.

1. הכנת העכבר מתחלקים היום 10.5 אבות הלבלב

הערה: פרוטוקול זה לא צריך להיות בעקבות בתנאים סטריליים עד שלב 2, אולם זה אופטימלי לחטא כלי ניתוח, לרסס עם אתנול 70% לפני השימוש.

  1. כדי להגדיר עבור ניתוח, למלא דלי קרח ומניחים מכולה של פוספט buffered תמיסת מלח (PBS) בתוך הקרח. נקה שני שקצהו בסדר. מלקחיים ומספריים הקרע עם 70% אתנול. מיכל עם פחות שלושה בורוסיליקט נימי שוכן בסמוך לאזור לנתיחה, צינורות, על פיפטה בפה, מצית, ומסונן 1,000 טיפים פיפטה µL.
    1. להכין לפחות 1 מ"ל של 1.25 מ"ג/מ"ל dispase קר סטיריליים למהול במים ולשתות, מקום הבאר השנייה של צלחת טוב 12 על קרח. להכניס PBS הראשונה, השלישית, הרביעית בארות 12 טוב צלחת. מקום 1 מ"ל של 0.05% טריפסין ב mL 1.5 צינור על קרח. לחמם של חממה חזק כדי 37 oC.
  2. המתת חסד e10.5 עכברים בהריון-מתוזמן בהתאם להנחיות IACUC. לרסס את הבטן עם 70% אתנול כדי לנקות את האזור לפני ביצוע בצורת V חתך באזור איברי המין של העכבר באמצעות מלקחיים ומספריים ולהמשיך אותו עד הסרעפת.
    הערה: הופעת פקק בנרתיק בתוך פרוטוקול זה מציינת היום 0.5. באמצעות 5 - 6 בת עכברים, עלייה במשקל של יותר מ 2 g פועלת כאמצעי משני של הספגה מוצלחת.
    1. בזהירות לסלק את הרחם על ידי ביצוע חתך על החלקים לרוחב מעייניו של הרחם, מושך את האיבר כלפי מעלה מן העכבר, ובעקבות החתך עד באזור איבר המין לפני חוזר בצד הנגדי. מקום זה 10 ס מ צלחת פטרי עם PBS קר.
      הערה: זה אפשרי להשיג organoids של תאים e11.5 הפומבית, אולם בניגוד pancreatoids e10.5, organoids אלה עדיין לא מאופיינים ובכך עשויים לא לשמור את היכולת להבדיל לתוך כל שלוש שושלות הלבלב הגדולות.
  3. תחת מיקרוסקופ אור לנתיחה, מניחים על צלחת פטרי ופתח בזהירות את רקמת הרחם על ידי הצבת שני מלקחיים בין כל העובר קילוף רקמות מן שק החלמון. העברת העוברים על ידי האוחז שק החלמון בעדינות עם מלקחיים, במקום 10 ס מ פטרי טריים PBS קר. מניחים על צלחת פטרי על קרח.
    הערה: חשוב heedfully להסיר את העוברים, רצוי ויתוחזקו שק החלמון, כמו הסרת כוחני יכול למשוך את חבל הטבור, לקרוע טישו של העובר ולחשוף את השלמות. המבנית.
  4. במקום מספר PBS טיפות על מכסה פטרי 10 ס מ. להשתמש אלה טיפות להעביר את העובר במהלך ניתוח כמו רקמות extraembryonic יוסרו כדי להבטיח ניראות. להעביר את העובר טיפה PBS ולהסיר בעדינות שק החלמון באמצעות מלקחיים, בעוד העוברים הנותרים נשאר PBS על קרח (איור 1א'). הסר את הראש לפני העברת העובר טיפה PBS חדש באמצעות מלקחיים להגיש בקלות ראש העובר, לא נזק לרקמת (איור 1B).
    הערה: הרקמה ייתכן שתצטרך להעביר בתדירות גבוהה יותר טיפות PBS צח מזו המתוארת כאן, בהתאם לאטימות של הנוזל.
    1. בטיפה PBS חדשים, להסיר בלוטות forelimb באמצעות מלקחיים (איור 1B). להכניס מלקחיים בתוך הפתח שבו האיבר באד היה נוכח ונפרק בעדינות רק הרקמה החיצוני ביותר anteriorly (איור 1B). סיבוב העובר וחזור לכיוון אחורי, ועוצרים ניצן hindlimb. בשלב זה, מערכת העיכול צריך להיות גלוי (איור 1B).
    2. האזור האחורי של מערכת העיכול יש עיקול קטן (איור 1F). הכנס מלקחיים מאחורי העיקול הזה הפתח בין האזור בעמוד השדרה של קיר הגוף של מערכת העיכול. ניתוק של מערכת העיכול, עובד לאט כלפי מעלה עד האזור הקדמי ביותר איפה אזור הלב מתחבר (איור 1B-E).
      אופציונלי: להסיר את הלב הקדמוני ניצנים כבד מהאזורים הגחון של מערכת העיכול, להשאיר רק את הצינור בטן רציף. בפעמים הראשונות פרוטוקול זה מבוצע שיהיה קל יותר לעזוב את הלב והכבד כמו ציוני הגחון עד המורפולוגיה של מערכת העיכול ואת ניצן הלבלב הגבי הם יותר מוכר (איור 1C ו- D ).
    3. העברה של מערכת העיכול ה-droplet PBS טריים.
    4. לקחת מלקחיים בעדינות לצבוט את הרקמה מתחת באיבו בולטות המעי, להרים מעט את הרקמה החיצונית את (איור 1D-F).
      הערה: ניצן הלבלב הגבי ממוקם בין הקיבה והמעי (איור 1C-G). ניצן הלבלב מתחת צריך להיראות כמו מבנה עגול, הכפתוריים (איור 1G).
    5. במקום מלקחיים איפה הניצן מתחבר המעי, קמצוץ כלפי מעלה כדי לשחרר את הניצן (איור 1G). רחץ פעם אחת בתוך בועה PBS חדש לפני העברת הניצן לתוך הבאר הראשונה של צלחת טוב 12 ב- PBS קר על קרח. חזור עד ניצנים כל שנאסף עוברי והניח בתוך הבאר הראשונה של צלחת טוב 12.
  5. המקום ה-12 מגישים גם במיקרוסקופ אור לנתיחה. לספור את מספר בלוטות הלבלב בהצלחה גזור מאוחר יותר לחשב את יחס פיצול.
    1. המקום מסוננים 1,000 µL פיפטה עצה לתוך פיפטה בפה עם צינור קפילרי מצורף. להבה לעקר את צינור קפילרי וליצור עיקול בצינור כדי להקל על השימוש. להשתמש את נימי כדי להעביר ניצנים הפתרון השני dispase קר טוב המכיל למשך 2 דקות לפני העברת הבאר השלישית תסיים נקי (איור 1G).
      הערה: בעת העברת ניצנים dispase PBS, להימנע מלגעת הרקמה עד הקצה של הצינור נימי. אם הרקמה נתקע על קצה הצינור, פיפטה למעלה ולמטה או לנער בפתרון PBS נקי עד השתחררו.
    2. פיפטה ניצנים למעלה ולמטה, ולהעביר אל הבאר הרביעית עם PBS נקי. לבסוף, באמצעות העברת המכשיר נימי ניצנים כדי ברכבת התחתית 1.5 mL עם 0.05% טריפסין. למקם את הצינור שייקר 37 oC מראש ומחוממת ומנערים במהירות של 1,500 סל ד במשך 4 דקות.
    3. מערבולת במשך כ 10 s ואז מיד למקם את הצינור צנטריפוגה ספין בשביל 5 דקות ב- 200 g. להסיר את הכל אלא כ 50 µL של פתרון בזהירות כדי לא להפריע את התאים centrifuged (איור 1G).

2. חלופה מועדפת אבות כדי ליצור Pancreatoids culturing

הערה: הבאות צריכה להתבצע באווירה סטרילית בשכונה תרביות רקמה רגיל, באמצעות הליכים סטנדרטיים סטרילי.

  1. עבור כל ניצן אסף, להוסיף 400 µL organogenesis מדיה16,17 (טבלה 1) התאים centrifuged. דופק מערבולת שלוש פעמים, µL צלחת 100 לכל טוב של קובץ מצורף נמוך 96 טוב צלחת, פיצול ניצנים ביחס של 1:4 (איור 1G).
  2. בדוק תחת המיקרוסקופ לדמיין חלופה מועדפת תאים באופן חופשי צף (איור 1H). מקם את המנה תרבות חממה 37 oC עם 5% CO2 על כיסא נדנדה במהירות בינונית.
  3. עקוב אחר ההתקדמות של pancreatoids מדי יום. להחליף 100 µL של מדיה טריים כל 3 ימים, מדיה pipetting בקפידה תחת בקרה מיקרוסקופית בשכונה כדי להסיר תוך השארת pancreatoid הבאר. לחלופין, טרי 100 µL של התקשורת ניתן להוסיף באר חדשה ו pancreatoid מועברים באמצעות בורוסיליקט קפילר המצורפת פיפטה בפה, 1000 µL מסונן פיפטה עצה.

3. עיבוד Pancreatoids עבור הדמיה Immunofluorescent

  1. כדי לעבד pancreatoids לתמונות immunofluorescent, יש להכין תחילה 4% paraformaldehyde/PBS, pH7.4 (PFA) פתרון. במקום 50 µL של 4% PFA בבארות של 96 ובכן צלחת.
    1. באמצעות צינורות קפילר בורוסיליקט פיפטה בפה עם קצה פיפטה המסוננות 1,000 µL, להעביר pancreatoids בינוני תרבות לוקח מדיה קטנה ככל האפשר לתוך הבאר טריים עם 4% מחברים. ממוקם על הנדנדה בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.
    2. להעביר pancreatoids מ- 4% PFA לבאר עם µL 100 ל- PBS טריים, רוק בטמפרטורת החדר במשך 5-10 דק חוזר עבור סכום של שלושה שוטף PBS טריים.
      הערה: הפרוטוקול ניתן להשהות כאן, עם pancreatoids המאוחסן µL 100 ל- PBS ב 4 oC עד לשבוע אחד.
  2. עבור הדמיה wholemount (מומלץ אם הם מתאימים, חלופית הגישה בסעיף 3.3. ואת מיקרוסקופ ב- 3.4.), להעביר מהערוץ סרום חמור 5% µL 50 ב- PBS 1 x עם חומר ניקוי nonionic 0.1% (PBST) כדי לחסום. סלע בן לילה בבית 4 oC או לחילופין במשך 4 שעות בטמפרטורת החדר.
    1. להעביר pancreatoids באר חדשה המכילה נוגדנים העיקרי מעורבבת עם µL 50 של נסיוב חמור 5% 1 x PBST. הסלע בצורה אופטימלית, 24 שעות בבית 4 oC (לפחות 12 שעות אבל עד 36 שעות).
      הערה: נוגדנים המופיעים בטבלה של חומרים נגד Chga (1: 100), DBA (1:400), Vim (1:400), Pdx1 (1: 100) מתאימים wholemount מכתימה; נוגדנים אחרים עשויים לדרוש אופטימיזציה.
    2. העברת pancreatoids לבאר, המכיל 100 µL של PBST טריים לשטוף את סלע במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. חזור על שלב זה עבור סכום כולל של שלושה שוטף PBST טריים.
    3. להעביר pancreatoids באר חדשה המכילה נוגדנים משניים מעורבבת עם µL 50 של נסיוב חמור 5% 1 x PBST. להגן על הבסיס מפני האור ולמקם 4 oC, נדנדה עבור בצורה אופטימלית 24 שעות (לפחות 12 שעות אבל עד 36 שעות).
      הערה: כל נוגדנים משניים המופיעים counterstain גרעיני הטבלה של חומרים , דאפי מתאימים wholemount מכתים.
    4. להעביר pancreatoids באר חדשה המכילה 100 µL 1 x PBST ורוק בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות חוזר עבור סכום של שלושה שוטף 1 x PBST. בכביסה השלישי והאחרון, להוסיף 300 ננומטר דאפי.
    5. לבסוף, למקם את µL 100 של PBS ונקייה בחנות 4 oC מוגן מפני אור במשך שבוע לפני הדמיה על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית, למרות התוצאות הטובות ביותר של הדמיה מיד לאחר מכתים. כדי למנוע תנועה של pancreatoids במהלך דימות אך למנוע ייבוש, למקם את כל pancreatoid droplet 20 µL ל- PBS. אם pancreatoids אינם נשארים עדיין, להפחית את נפח PBS.
  3. עבור מקטעים קפוא, להעביר pancreatoids מהערוץ בתוך 30% תמיסת סוכרוז למשך הלילה בבית 4 oC.
    1. הוסף מדיה ההטבעה בבועה תחת מיקרוסקופ לנתיחה. בעזרת מלקחיים תחת בקרה מיקרוסקופית, משרים pancreatoids בדחיפה בעדינות דרך התקשורת ההטבעה מספר פעמים כדי להסיר שאריות סוכרוז לפני העברת גוש רקמה עם מדיה ההטבעה קפוא.
    2. מניחים את רקמת בלוק על קרח יבש עד קפואים והמקטע על cryostat ב 8 מיקרומטר.
      הערה: סעיפים שניתן לאחסן ב-80 oC או immunostained מיד.
    3. מאפשר מקטעים מ-80 oC להפשיר בטמפרטורת החדר במשך כ 5 דקות עד יבש. לצייר מחסום הידרופובי באמצעות העט pap הידרופובי סביב הרקמה ולחסום את השימוש סרום חמור 5% בדילול 1 x PBST למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
    4. להסיר מדיה ולהחליף מיד עם נוגדנים העיקרי מדולל 5% חמור בסרום מדולל ב- x 1 PBST לילה בבית 4 oC.
    5. הסר את הפתרון העיקרי ולשטוף רקמות שלוש פעמים עם 1 x PBST 10 דקות כל אחד. בעקבות זאת, הוספת נוגדנים משניים פתרון מדולל בנסיוב חמור 5% בדילול 1 x PBST לשעה בטמפרטורת החדר להגן על שקופיות מפני אור.
    6. הסר את הפתרון המשני ולשטוף שקופיות שלוש פעמים ב 1 x PBST 10 דקות כל אחד. בכביסה הסופי, להוסיף 300 ננומטר דאפי.
    7. להסיר מדיה ולהוסיף מדיה הרכבה של coverslip. חנות שקופיות מן האור 4 oC עד מוכן תמונה.

4. בידוד של RNA מ Pancreatoids לניתוח התעתיק

  1. לאסוף את pancreatoids באמצעות נימי בורוסיליקט המצורפת פיפטה בפה עם מסוננים 1,000 µL פיפטה עצה בשביל בעקרות ומקום לתוך µL 500 של חומצה guanidinium thiocyanate-פנול-כלורופורם פתרון צינור 1.5 מ. ב-80 oC או פנה/י מיד לבידוד RNA.
  2. לבידוד RNA, להפשיר דוגמאות על קרח במידת הצורך, להוסיף 100 µL של כלורופורם. מערבולת טוב והמקום ב 4 oC במשך 15 דקות מראש מגניב צנטריפוגה כדי 4 oC.
    1. מניחים צינורות לתוך צנטריפוגה, ספין בשביל 20 דקות ב g 12,000 בבית 4 oC.
    2. הסר בזהירות את צינורות כדי לא להפריע ההפרדה של שכבות. באמצעות פיפטה 200 µL, לאסוף את הפתרון ברור מימית ולמקם לתוך צינור 1.5 mL החדש, משאיר מאחור כמות קטנה אל מאגר חלבון לבן שכבה, שכבת ה-DNA ורוד. לא לגעת בקצה פיפטה לכל דבר בתהליך זה, אל תיגע דפנות הצינור 1.5 mL.
    3. להוסיף 500 µL של 100% אלכוהול איזופרופיל הצינור החדש המכילות את שכבה מימית ואת מערבולת. בסדר בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות, עוד על הקרח, או עבור מרבית המשקעים להשאיר למשך הלילה ב-20 oC.
    4. צנטריפוגה ב 12,000 g למשך 15 דקות בבית 4 oC כדי הצניפה את הרנ א. הסר את אלכוהול איזופרופיל מבלי להפריע בגדר.
      הערה: כמו pancreatoids הם קטנים, סביר שבגדר לא יהיו גלויים.
    5. הוסף קר, 75% אתנול, היפוך ברכבת התחתית מספר פעמים. מקום בצנטריפוגה, ספין ב 9,000 g x 10 דקות בבית 4 oC. הסר את אתנול וביו -ספין למשך 2 דקות ב 9,000 x g.
    6. להשתמש על פיפטה 200 µL כדי להסיר כל אתנול שנותרו בצינור, ללא פנייה אל האזור שבגדר שוכן. להשאיר את הכיפה פתוח על המסך למשך 5-10 דקות בטמפרטורת החדר, כדי להבטיח אידוי של אתנול שיורית.
    7. Resuspend צנפה על ידי vortexing ב 20 µL של מים נקיים, ללא נוקלאז.
      אופציונלי: חום הרנ א-65 oC למשך 3 דקות ומיד להחזיר הקרח. RNA יכול להיות מאוחסן ב-80 oC או השתמשו מיד שעתוק במהופך, qPCR.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניתוח זהיר של העכבר עוברי-e10.5 מן הקרן הרחם אמור להניב העוברים תקינים ב- PBS עבור ניתוח נוסף (איור 1א'). מערכת העיכול ניתן להסיר ביעילות של העובר (איור 1B), המתיר הבחנה של ניצן הלבלב הגבי בצומת של המעי, הקיבה (איור 1C-F). ניצן הלבלב e10.5 בעבר מאפיין; אבות צריך לבטא Pdx1, Sox9, Ptf1a, ו Hes120,

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ההתקדמות של מודלים התרבות התא חיוני כראוי מודל פיתוח, לייצר סוגי תאים הרלוונטית קלינית, בדיקת תרופות יעילות או אפילו להשתלת לחולים. עם זאת, באופן מלאכותי recapitulating פיתוח בקערה הוא מאתגר כמו שאנחנו עדיין רחוק מלהיות הבנת המנגנונים של organogenesis, פיזיולוגיה ויוו. כך הם במבחנה התאים שנוצר באופן לא יעיל, לא מתפקדת במלואה, מצליח להישמר במשך פרקי זמן ארוכים, או הנמל מומים אחרים מתאי דומה בגוף. זה בגלל סוגי תאים שונים רבים אינטראקציה בזמן מתרחשים שינויים morphogenetic מורכבים כדי להשפיע על התפתחות ופיז...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים Jolanta Chmielowiec לדיון מועיל לגבי פרוטוקול ו כתב היד. אנו מודים גם בנג'מין Arenkiel לגישה מיקרוסקופ קונפוקלי. עבודה זו נתמכה על ידי NIH (P30-DK079638 ל מ ב) ו- T32HL092332-13 M.A.S. ו מ ב מקנייר רפואי לקרן (מ ב), ליבת קונאפוקלית רוחני BCM, מרכז מחקר התפתחותיות (NIH U54 HD083092 מ יוניס קנדי שרייבר המכון הלאומי של הילד בריאות והתפתחות האדם).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
2-MercaptoethanolSigma-AldrichM6250
מכלולי צינור שואב עבור פיפטות מיקרו-נימיות מכוילותSigma-AldrichA5177
BarnStead NanoPure מים ללא נוקלאזThermoFisherD119
בורוסיליקט צינורות נימייםסאטרGB1007515OD 1 מ"מ, תעודת זהות 0.75 מ"מ, אורך
1.5 ס"מCaCl2Sigma-AldrichC5080
דוחה תאים 96 בארות מיקרופלייטגריינר Bio-One650970U-bottom
צנטריפוגה 5424 REppendorf5401000013
כלורופורםסיגמא-אולדריץ'233306
נוגדן כרומוגנין-AAbcamab15160
קומפקטי, מיקרוסקופ סטריאו מודולרי M60Leica
Countess מונה תאים אוטומטיInvitrogenC10310
שקופיות מונה תאיםרוזנת InvitrogenC10312
CryoStar NX70ThermoFisher957000L
D-(+)-גלוקוזסיגמא-אולדריץ'G7528
DAPI (4',6-דיאמידין-2'-פנילינדול-דיהידרוכלוריד)רוש10 236 276 001אבקת
נוגדן DBAוקטור מעבדהRL-1032
Dispase II, אבקתGibco17105041
DMEM/F-12, HEPESGibco11330032
Dnase IInvitrogen18068-015
Dumont #5 מלקחייםFine Science Tools11251-100.05 x 0.02 מ"מ; טיטניום; טיפ ביולוגיה
EGF (גורם גדילה אפידרמלי)Sigma-AldrichE9644
אתנול, 200 הוכחהDecon Laboratories2716
Forma Steri Cycle CO2 IncubatorsThermoFisher370
Fluoromount-GSouthern BiotechOB10001
מלח נתרן הפרין מרירית המעי של חזירSigma-AldrichH3149-10KU
INSM1 נוגדןסנטה קרוז ביוטכנולוגיהsc-271408עכבר פוליקלונלי
IgG איזופרופנולפישרa4164
איזותזיה איזופלורן, USPהנרי שיין11695-6776-2
נוגדן אינסוליןDakoA056401חזיר ניסיונות פוליקלונלי
KAPA SYBR FAST אוניברסליKAPA BiosystemsKK4618
KClKaryoMax10575090
KnockOut החלפת סרוםInvitrogen10828028
Leica TCS SPE ברזולוציה גבוהה ספקטרלי קונפוקליLeica
MgCl2Sigma-Aldrich442615
עכבר C-Peptide ELISAALPCO80-CPTMS-E01
עכבר רגיש במיוחד אינסולין ELISAALPCO80-INSMSU-E01
MX35 להבי מיקרוטוםThermoFisher3052835
NaClSigma-AldrichS7653
NaHCO3Sigma-AldrichS3817
NaH2PO4Sigma-Aldrich
סרום חמור רגילג'קסון מחקר חיסוני017-000-121
ParaformaldehydeSigma-Aldrich158127
PBS 1XCorning21-040-CV
Pdx1 נוגדןDSHBF6A11עכבר חד שבטי MIgG1
Peel-A-Way תבניות הטבעה חד פעמיותVWR15160-157
תמיסת פניצילין-סטרפטומיציןקורנינגMT30002CI
PMA (Phorbol 12-Myristate 13- אצטט)Sigma-AldrichP1585
חלבון LoBind צינורות מיקרוצנטריפוגהEppendorf22431081קיבולת 1.5 מ"ל
רקומביננטי חלבון FGF-10 אנושיR& D Systems345-FG
רקומביננטי אנושי FGF-חומציפפרוטק100-17A
רקומביננטי אנושי R-Spondin I חלבוןR& D Systems4546-RS
BenchRocker 2DBenchmarkBR2000
סוכרוז 500 גרםסיגמא-אולדריץ'S0389
SuperFrost Plus מיקרוסקופ שקופיותפישר סיינטיפיק12-550-15
סופר פאפ עטאלקטרונים מיקרוסקופיה מדעי71310
תרמומיקסר REppendorf05-412-401
רקמות Tek O.C.T. תרכובתסאקורה4583
טריטון X-100סיגמא-אולדריץ'T8787
טריזול ריאגנטInvitrogen15596018
TrypLE ExpressInvitrogen12604039(1x), ללא פנול אדום
טריפן כתם כחולInvitrogen15250061לשקופיות ספירת תאים
טריפסין-EDTA (0.05% )קורנינג25-052-CI
טריפסין-EDTA (0.25%)Gibco25200072פנול אדום
חיבור נמוך במיוחד 24 בארותצלחת קורנינג3473
צלחת ספרואיד מצורפת נמוכה במיוחד 96 בארותקורנינג4520
נוגדן וימנטיןEMD MilliporeAB5733עוף פוליקלונלי IgY
מערבולת ג'יניBioExpresS-7350-1
Y-27632 דיהידרוכלורידמו"פ D Systems1254ידוע גם בשם מעכב ROCK
Zeiss 710 מיקרוסקופ קונפוקליZeiss
מכשירי

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  2. Akkerman, N., Defize, L. H. Dawn of the organoid era: 3D tissue and organ cultures revolutionize the study of development, disease, and regeneration. Bioessays. 39 (4), (2017).
  3. Guo, T., Landsman, L., Li, N., Hebrok, M. Factors expressed by murine embryonic pancreatic mesenchyme enhance generation of insulin-producing cells from hESCs. Diabetes. 62 (5), 1581-1592 (2013).
  4. Landsman, L., et al. Pancreatic mesenchyme regulates epithelial organogenesis throughout development. PLoS Biology. 9 (9), 1001143(2011).
  5. Lammert, E., Cleaver, O., Melton, D. Induction of pancreatic differentiation by signals from blood vessels. Science. 294 (5542), 564-567 (2001).
  6. Barker, N., et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).
  7. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  8. Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470 (7332), 105-109 (2011).
  9. Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).
  10. Xia, Y., et al. The generation of kidney organoids by differentiation of human pluripotent cells to ureteric bud progenitor-like cells. Nature Protocols. 9 (11), 2693-2704 (2014).
  11. Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
  12. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  13. Loftus, S. K., et al. Acinar cell apoptosis in Serpini2-deficient mice models pancreatic insufficiency. PLoS Genetics. 1 (3), 38(2005).
  14. Kleeff, J., et al. Chronic pancreatitis. Nat Rev Dis Primers. 3, 17060(2017).
  15. Murtaugh, L. C., Melton, D. A. Genes, signals, and lineages in pancreas development. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 19, 71-89 (2003).
  16. Greggio, C., De Franceschi, F., Figueiredo-Larsen, M., Grapin-Botton, A. In vitro pancreas organogenesis from dispersed mouse embryonic progenitors. Journal of Visualized Experiments. (89), 51725(2014).
  17. Greggio, C., et al. Artificial three-dimensional niches deconstruct pancreas development in vitro. Development. 140 (21), 4452-4462 (2013).
  18. Sneddon, J. B., Borowiak, M., Melton, D. A. Self-renewal of embryonic-stem-cell-derived progenitors by organ-matched mesenchyme. Nature. 491 (7426), 765-768 (2012).
  19. Scavuzzo, M. A., Yang, D., Borowiak, M. Organotypic pancreatoids with native mesenchyme develop Insulin producing endocrine cells. Scientific Reports. 7 (1), 10810(2017).
  20. Murtaugh, L. C., Stanger, B. Z., Kwan, K. M., Melton, D. A. Notch signaling controls multiple steps of pancreatic differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (25), 14920-14925 (2003).
  21. Nelson, S. B., Schaffer, A. E., Sander, M. The transcription factors Nkx6.1 and Nkx6.2 possess equivalent activities in promoting beta-cell fate specification in Pdx1+ pancreatic progenitor cells. Development. 134 (13), 2491-2500 (2007).
  22. Seymour, P. A., et al. SOX9 is required for maintenance of the pancreatic progenitor cell pool. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (6), 1865-1870 (2007).
  23. Kawaguchi, Y., et al. The role of the transcriptional regulator Ptf1a in converting intestinal to pancreatic progenitors. Nature Genetics. 32 (1), 128-134 (2002).
  24. Hara, M., et al. Transgenic mice with green fluorescent protein-labeled pancreatic beta -cells. American Journal of Physiology: Endocrinology and Metabolism. 284 (1), 177-183 (2003).
  25. Holthofer, H., Schulte, B. A., Spicer, S. S. Expression of binding sites for Dolichos biflorus agglutinin at the apical aspect of collecting duct cells in rat kidney. Cell and Tissue Research. 249 (3), 481-485 (1987).
  26. Reichert, M., et al. Isolation, culture and genetic manipulation of mouse pancreatic ductal cells. Nature Protocols. 8 (7), 1354-1365 (2013).
  27. Winkler, H., Fischer-Colbrie, R. The chromogranins A and B: the first 25 years and future perspectives. Neuroscience. 49 (3), 497-528 (1992).
  28. Burcelin, R., Knauf, C., Cani, P. D. Pancreatic alpha-cell dysfunction in diabetes. Diabetes and Metabolism. 34, Suppl 2 49-55 (2008).
  29. Del Prato, S., Marchetti, P. Beta- and alpha-cell dysfunction in type 2 diabetes. Hormone and Metabolic Research. 36 (11-12), 775-781 (2004).
  30. Piciucchi, M., et al. Exocrine pancreatic insufficiency in diabetic patients: prevalence, mechanisms, and treatment. International Journal of Endocrinology. 2015, 595649(2015).
  31. Campbell-Thompson, M., Rodriguez-Calvo, T., Battaglia, M. Abnormalities of the Exocrine Pancreas in Type 1 Diabetes. Current Diabetes Reports. 15 (10), 79(2015).
  32. Shivaprasad, C., Pulikkal, A. A., Kumar, K. M. Pancreatic exocrine insufficiency in type 1 and type 2 diabetics of Indian origin. Pancreatology. 15 (6), 616-619 (2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

PCR

מאמרים קשורים