ג'ין המועמד בדיקות במחקרים קליניים עוקבה ועם Genotyping מרובבת ספקטרומטר מסה

סיכום

זיהוי של וריאציות גנטיות לתרום מחלות אנושיות מורכבות מאפשר לנו לזהות מנגנונים חדשניים. . הנה, נדגים הגישה מולטיפלקס genotyping של המועמד גנים או מסלול מפענוח ממקסם את הכיסוי במחיר נמוך, הוא נוטה מחקרי עוקבה מבוסס.

תקציר

מחלות מורכבות הן לעיתים קרובות ביסודה על ידי מספר גרסאות גנטי נפוץ שתורמים הרגישות למחלה. כאן, אנו מתארים גישה פולימורפיזם (הסנ פ) נוקלאוטיד יחיד של תג חסכונית באמצעות assay מרובבת genotyping של ספקטרומטר מסה, לחקור את הגן שיוכי מסלול קליני גדודים. אנחנו חוקרים את לוקוס המועמד אלרגיה למזון Interleukin13 (IL13) כדוגמה. שיטה זו הגדלת ביעילות את הכיסוי על-ידי ניצול משותף תאחיזה לא שוויונית (LD) בתוך אזור. SNPs LD הנבחר ואז נועדו לתוך מרובבת assay, המאפשרים עד 40 SNPs שונים להיות מנותח בו זמנית, לחיזוק משתלמת. תגובת שרשרת פולימראזית (PCR) משמש כדי להגביר את לוקוסים היעד, ואחריהם סיומת נוקלאוטיד יחיד, ואת amplicons ואז נמדדים באמצעות לייזר בסיוע מטריקס desorption/יינון-שעה של ספקטרומטר מסה flight(MALDI-TOF). הפלט גולמי ניתוח עם גנוטיפ מתקשר התוכנה, באמצעות חתך-offs, והגדרות בקרת איכות מחמירים, סבירות גבוהה אחרים ובאים פלט עבור ניתוח נתונים.

מבוא

מחלות אנושיות מורכבות, וריאציות גנטיות לתרום רגישות למחלות, לכימות גרסאות אלה עשויה להיות שימושית עבור פתוגנזה הבנה, זיהוי קבוצות מטופלים בסיכון גבוה, המגיבים לטיפול. אכן, ההבטחה של דיוק רפואה הוא תלוי ניצול מידע גנטי כדי לזהות קבוצות המטופל¹. לרוע המזל, בתוך החלל ביולוגיה מחלה מורכבת, שבו המחלה פנוטיפים הם ביסודה על ידי ניכר הטרוגניות גנטית, penetrance נמוך, אקספרסיביות משתנה, עוקבה גודל דרישות עבור גישות הגנום כולו לזהות את הרומן המועמדים הם לעתים קרובות מדי גדול². לחלופין, בגישה ג'ין המועמד יישוב מתחיל השערה אפריורי על גנים ספציפיים/מסלולים המחלה אטיולוגיה³. כלי ניתוח מסלול משמשות כדי לחקור הפתופיזיולוגיה של לוקוסים היעד מזוהה, יצירת מסלולים רבים המועמד כדי להבטיח את הזמנתכם. נדגים כאן בגישה genotyping מרובבת ומאפשר החקירה של עשרות למאות SNPs עם אחד assay, מתאים מחקרי עוקבה האנושי⁴. גישה זו היא גבוהה יחסית דרך-put, המתיר מאות אלפי דגימות די אן איי להיות genotyped ללימודי הרומן גילוי, חקירה של מסלולים ספציפיים. השיטות המתוארות כאן שימושיים עבור מזהה סיכון אללים ואגודות שלהם עם תכונות קליני באופן מהיר וזול יחסית. פלטפורמה זו היה מועיל מאוד סינון ואבחון למטרות^5,6, ועוד לאחרונה, זיהום מיקרוביאלי⁷ ו וירוס הפפילומה האנושי⁸.

פרוטוקול זה מתחיל עם מבחר של קבוצת גנים לחקירה, כלומר., אזורי היעד, נקבע בדרך כלל דרך חיפוש ספרות, או אפריורי השערות על מעורבות תהליך המחלה; . או אולי מסומנת לצורך שכפול כמו אגודות מחקר הגנום כולו האגודה (GWA) גילוי המוביל. מקבוצת ג'ין, החוקר יבחר רשימה מעודן של תג SNPs. כלומר, תאחיזה לא שוויונית (LD), או קורלציה, בין גרסאות באזור משמש לזיהוי נציג 'תג הסנ פ' עבור חבורה של SNPs ב LD גבוהה, המכונה haplotype. תעודת הזהות גבוהה של האזור אומר כי SNPs לעיתים קרובות יורשים ביחד כך genotyping הסנ פ אחת מספיקה לייצג את הווריאציה-SNPs כל ב- haplotype. לחלופין, אם עוקב אחרי רשימה סופית של SNPs מאזורים רבים, למשל., שכפול למחקר GWA, תהליך זה עשוי להיות מיותרים. עבור מרובבת genotyping, וזמינותו ואז להיות מתוכננים סביב היעדים הללו כך תחל ההגברה של שונות המוני לאלה של תחל סיומת, מוצרים כדי לייצר interpretable המוני ספקטרה. פרמטרים אלה מיושמות בקלות על ידי כלי עיצוב genotyping מרובבת וזמינותו. תחל ואחורה של עיצוב זה ישמש כדי למקד את סמני עניין ומגבירים את רצף המכיל את הסנ פ. תחל סיומת לצרף proximal ישירות SNPs ומצורפת בסיס יחיד, מסה-לאחרונה, 'שליחות קטלנית' משלים הסנ פ. הבסיס המחסל מונע נוסף הרחבה של ה-DNA. המסה-השינוי של הבסיס מאפשר שברי שונות על ידי בסיס יחיד שהוא זוהה על ידי ספקטרומטר מסה. הצלחת המכיל את הכימיה genotyping ואז חלה על שבב למדידה על פלטפורמה ספקטרומטר מסה. לאחר החלת המתאים פקדים איכות השיחות raw genotyping שזוהה על-ידי המערכת, הנתונים יכול להיות ייצוא ולא המשמש לניתוח סטטיסטי כדי לבדוק את הקשר עם מחלת פנוטיפים.

פרוטוקול

החומר הגנטי הסעיפים אתית אושרה לשימוש על ידי המשרד עבור ילדים HREC (האדם מחקר ועדת האתיקה) (CDF/07/492), המחלקה HREC שירותי אנוש (10/07), חולים (RCH רויאל לילדים) HREC (27047).

1. עיצוב וזמינותו מרובבת

1. הכינו רשימה הסנ פ לעיצוב וזמינותו.
   1. קלט אזור היעד לתוך הפונקציה תג'ר של Haploview (https://www.broadinstitute.org/haploview/downloads). השתמש את תעודת הזהות (קורלציה, r²) בין SNPs המתפרסות על-פני אזור היעד כדי ליצור רשימה של SNPs, אשר מספק כיסוי מלא של האזור הרצוי עם המספר הנמוך ביותר של גרסאות הנדרש. ליצור רשימה של SNPs כזה כי כל אללים ללכידה נמצאים בקורלציה מעל לסף מסוים על-ידי המשתמש (למשל., r² ≥0.8).
2. זיהוי של רצפי מתאים לפנים לאחור, הארכת תחל
   1. הזן את רשימת SNPs שנוצר לתוך כלי העיצוב של בחירה וזמינותו.
      הערה: ההוראות הבאות חלות על כלי העיצוב assay המשמש ליצירת התוצאות נציג, כמפורט בטבלה של חומרים.
   2. לאחר הושק כלי העיצוב assay, לבחור עיצוב Genotyping חדש. הזן שם עבור העיצוב assay לתוך השדה שם עיצוב .
   3. לספק את הרשימה הסנ פ שנוצרה בשלב 1.1.1 על-ידי לחיצה על לחצן ערוך קלט טקסט המסומנת להוראות ר' או FASTA שבצד הלחצן.
      הערה: SNPs יכול להיות נכנסו כרשימת טקסט של הפניה (rs) הסנ פ מזהי הועלתה בפורמט FASTA או בתבנית קובץ קבוצה הסנ פ בשימוש בכלי. כדי להעלות קבצים בתבניות אלה, בחר בלחצן העלאת קובץ . הגבול העליון של משתנים זה ניתן לעצב לתוך assay יחיד, כינה 'ובכן,' הוא 40 SNPs. . זה ניתן לציין SNPs כי הם בראש סדר העדיפויות העיצוב לפני תחילת המרוץ; אלה יהיה תוכנן קודם. שליטה SNPs ניתן לציין: לדוגמה, נוספה הנועד לזהות מיגדרית במקרה של מדגם mix ups או פקד כדי לקבוע תבנית זו מספקת אם עובד עם איכות נמוך ועניים הדנ א. עם זאת, יש לציין כי באמצעות שליטה ועדיפות SNPs יכול להפחית את המספר של SNPs זה יכול להיות מעוצב יחיד טוב.
   4. מתפריט ' קביעה מוגדרת מראש ', בחר באפשרות iPLEX ריבוב גבוה מראש . מתפריט ' טהור ', בחר האורגניזם שממנו נובע ה-DNA כדי להיות genotyped. לקבלת תוצאות נציג המובאת כאן, זה היה האדם.
      הערה: העכבר ואורגניזמים שור תואמים גם הכלי. אחד יכול גם לבחור אחרים אם עובד עם אורגניזם אלטרנטיביות כגון צמח או חיידק; עם זאת, השלבים אוטומטית למציאת proximal SNPs ואזורי פריימר אופטימלי לא תהיה זמינה בשל היעדר התייחסות הגנום.
   5. בתפריט מסד נתונים , בחר build העדכני של הגנום, או של בניה אלטרנטיבית אם נדרש, ' מתפריט ' כימיה . בחר iPLEX והזן עבור השדה רמת מולטיפלקס , הרמה הגבוהה ביותר של ריבוב: 40. עכשיו בחר להתחיל לרוץ. "שלב 1" של הכלי תחל.
      הערה: במהלך שלב 1, הכלי מאחזר ומעצבת את רצפי הסנ פ. . הנה, שגיאות עשויות לכלול עיצוב של הקובץ FASTA בו במקרה שקובץ FASTA צריך להיות בדק, מחדש במידת הצורך. שגיאה נוספת היא הסנ פ ר' מספרים מוזגו עם עוד מספר ר', שבו צריך לחפש את התיק מספר ר' במסד נתונים הסנ פ כגון dbSNP של NCBI כדי לזהות את מספר ר' הסנ פ החדש. רצפים סביב הסנ פ הם חיפשו בכל SNPs proximal ידוע שעלולה להפריע העיצוב תחל. אפשריות פריימר PCR מושווים כנגד הגנום להימנע שאינם ספציפיים הגברה עקב מספר רב של להיטים הגנום.
   6. ממתינים השלמה של "שלב 2" של כלי העיצוב שבו יזוהו SNPs הפרוקסימלית.
      הערה: אם משתמש אורגניזם שאינו נתמך על-ידי שלב זה, להוסיף ביאורים של רצף באמצעות צינתור SNPs ב סיסטמטי ביאור אם מידע זה זמין. יש לעתים רחוקות שגיאות במהלך שלב זה; עם זאת, שגיאות עלולה להתרחש אם הפניה הלא אורגניזם או גנום נבחר, או אם cDNA רצפים הוזנו במקום הדנ א. כדי למטב את שלב 2, תחת הגדרות מתקדמות, זה אפשרי לסנן SNPs בהתבסס על אוכלוסיה אם עובד בתוך אוכלוסיה ספציפית. SNPs נדיר גם וניתן לסנן על ידי אלה עם תדירות מתחת 1%. לבסוף, SNPs אין מצב מאומתים או אין מידע אוכלוסייה יכול לא ייכללו גם אם רצונך בכך.
   7. ממתינים השלמה של אזורים "שלב 3" של כלי העיצוב שמזהה פריימר אופטימלית. אם העדיף פריימר מיקומים זוהו, או אם עובד עם אורגניזם שונים, באופן ידני קלט פריימר מיקומים על-ידי הוספת ביאורים על רצף הקלט (את קבצי קבוצת הסנ פ) עם האזורים המועדפת פריימר באותיות רישיות ושאר הרצף התחתון במקרה, בחר לשמר את התיק ' מתפריט ' הגדרות מתקדמות ' בשלב זה.
      הערה: שגיאות עבור שלבים 2 & 3 עשויים לכלול: (1) A proximal הסנ פ חוסם את העיצוב של פריימר עם הפתרון להיות מסיכה עם בסיס שאינם מתבנית, סדר oligo עם בסיס אוניברסלי כמו Isonine, או, עיצוב שני צבעי יסוד, אחד עם כל אחד אללים של proxim al הסנ פ, או עיצוב פריימר אחד עם אלל נפוץ רק. (2) עוד שגיאה נפוצה היא הכשל לזהות אתר ייחודי עבור ומהצמיגים עם הפתרון כדי לשנות את אורך אמפליקון כדי לזהות אתר ייחודי. בכלי המשמש עבור נייר זה, ברירת המחדל היא לחץ דם 80-120. זה יכול להשתנות מ- 60 עד 400 bp בדיאלוג הגדרות מתקדמות תחת ההגדרות אמפליקון אורך ב "3. לזהות אזורים פריימר אופטימלית"גם תחת הכרטיסיה אמפליקון של"4. עיצוב מבחני." ודא שניהם משתנים. עם זאת, יצוין כי הגדלת אורך אמפליקון בעת שימוש השפיל הדנ א אינה מומלצת.
   8. ממתינים לסיום השלב עיצוב assay ("שלב 4" של העיצוב הכלי), כאן הכלי שואפת לספק מעבר אופטימלית הפרדה בין תחל את הסיומת של אללים של כל SNPs בעיצובים מרובבת. לאחר השלמת השלב זה, לייצא את הקובץ Oligo סדר, אשר מעוצב עבור הזמנת קל דרך oligo הזמנת ספק של בחירה.
      הערה: הגברה תחל (קדימה (נ), הפוכה (R)) נועדו ליצור גודל של האופטימלית אמפליקון של 80 עד 120 bp. פריימר הגברה מסה חייב נבדלים של פריימר מאריך את המוצר שלה כדי למנוע תוצאות סותרות בספקטרום מסה ו עבור הביצועים הכוללים של ה-PCR. סיומת ומהצמיגים צריך להיות 15 אל 30 נוקלאוטידים ארוך (4,500-9,000 דא), תוכנן כך הקצה 3' מייחסים סמוכים ישירות לאתר של פולימורפיזם. כל ההגדרות האלה נקבעות באופן אוטומטי הכלי המשמש ליצירת התוצאות נציג.
3. לייצא את העיצוב תחל שבחרת הכלי וסדר של ספק אוליגומר: 25 nmol של כל אחד תחל PCR (ואחורה) ולאחר nmol 100 של כל אחד תחל הסיומת. ראה טבלה 1 צבעי בסיס המשמש ליצירת התוצאות נציג.

2. genotyping (1-2 ימים)

1. הכנת תחל הגברה.
   1. אם תחל lyophilized שהוזמנו, לשקם במים ברמה המולקולרית. השתמש ריכוז של 100 μM/μL עבור תחל ואחורה ו- 500 μM/μL עבור סיומת.
   2. בריכת תחל קדמי & הפוך עבור כל assay מרובבת לתוך תערובת פריימר מניות, המכיל כל תחל בריכוז של 0.5 מ מ.
      הערה: לדוגמה, בריכה פריימר 400 μL 400 תגובות:
      
      2 μL של כל פריימר, על ריכוז של 100 μM/μL, נדרש עבור מאגר מניות פריימר. עבור 30-פלקס assay עם 60 תחל ואחורה, יהיה סכום כולל של 120 μL של פריימר הנדרש (הבריכה פריימר מרוכז). 280 מים ברמה מולקולרית μL אז ניתן להוסיף כדי להפוך נפח סופי של 400 μL של פריימר לערבב.
2. הגברה באמצעות פולימראז תגובת שרשרת (PCR)
   1. להכין תערובת הבסיס ה-PCR המכיל 100 ננומטר של המיקס פריימר שתוארו לעיל, 500 μM של dNTPs, 2 מ מ של MgCl₂, ו- 0.5 U של אנזים ה-DNA פולימראז. 1 U נדרש עבור גדול ממבחני 26-ה-plex. עיין בטבלה 2.
   2. להוסיף 4 μL של שילוב זה כל טוב של הלוח PCR 384-ובכן, יחד עם μL 1 של ה-DNA גנומי-ריכוז של 5-10 ng/μL.
      הערה: בקרת איכות צריך להיכלל גם על הצלחת, כגון פקד שאינם מתבנית של פקד חיובי ביצע בעבר עם וזמינותו (במהלך מבצע בדיקה). אם מפעיל לוחות מרובים, DNA מספר דגימות מן plate(s) אחרים, למשל., כן, צריכה לפעול כפקדי טכני עבור ההשתנות הבין-plate.
   3. Centrifuge את הצלחת ב g x 200 עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר עם כיסוי לצלחת במקום כדי להבטיח כל נוזל נכלל בחלק התחתון של הבארות צלחת.
   4. הפעל את ה-PCR עם התנאים thermocycler הבאים: הדגירה 4 דקות ב 94 ° C כדי להפעיל את ה-DNA פולימראז; 45 מחזורי הבאות (דנטורציה ב 94 ° C עבור 20 s, חישול ב 56 ° C s 30, ואת סיומת ב 72 מעלות צלזיוס במשך 1 דקה), ואז סיומת הסופי ב-72 מעלות במשך 3 דקות עיין לתוכנית ה-PCR בטבלה3.
   5. לבצע agarose בג'ל כדי להבטיח שהגברה הדנ א הוא מוצלח. השתמש µL 1 של מוצר ה-PCR (עם µL 3 טעינת מאגר) על 2% (w/v) agarose ג'ל, שנעשו על ידי ערבוב אבקת agarose, 0.5% EDTA בוראט טריס (TBE) מאגר, ולרוץ 45 min ב- 100 וולט.
3. שלב טיהור Phosphatase אלקליין (SAP) שרימפס
   הערה: שלב זה משמש כדי להסיר נוקלאוטידים טריטוריה. האנזים SAP cleaves פוספט קבוצות כדי למנוע עודף פריימר dNTPs טריטוריה מהתערבות התגובה ההרחבה הקרובה.
   1. להפוך אמן לערבב המכילה יחידות 1.7/μL של האנזים שרימפס אלקליין פוספטאז (SAP), מאגר SAP x 10 ולהמציא לאמצעי אחסון עם מים ברמה המולקולרית. עיין בטבלה 4.
   2. להוסיף 2 μL של טרי את SAP מאסטר שילוב כל טוב של הצלחת, כבר המכיל 5 μL פי התגובות PCR. צנטריפוגה בקצרה וחוזרים thermocycler ב 37 מעלות צלזיוס למשך 40 דקות ולאחר מכן ב 85 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות עבור אנזים איון. עיין בטבלה 5.
4. התגובה הארכת תחל
   הערה: ריכוז תחל סיומת בתערובת פריימר סיומת שתישמר לפי גודל (ליניארי פריימר ההתאמה – LPA). זה כי יש הופכי בין עוצמת שיא (על ספקטרום המונית), מוצר המוני. ההתאמה של ריכוז פריימר הרחבת מתקן עבור מערכת היחסים הזאת לייצר הפסגות של עוצמות שווה. מותאם תחל המשמש ליצירת הנציג התוצאות הינם מסופקים בטבלאות 6 & 7. אמצעי האחסון המסופקים הם להפיק 1.5 מ של סיומת פריימר מיקס.
   1. לחשב דילול גורמים עבור כל תחל תוך שימוש באלגוריתם הדרגתיות, זמין מ אגנה החיים ('ליניארי פריימר התאמת'), אשר מתאימה עבור מסה וריכוז של פריימר, ואת המספר הכולל של תחל בהתגובה מרובבת (ראה טבלאות 6 & 7). הזן המסה UEP כל פריימר לתוך השדה UEP_MASS הגיליון התאמת פריימר ליניארי.
      הערה: ריכוז מסה מנוכי עונתיות עבור ומהצמיגים באופן אוטומטי יחושבו בתא עם הטקסט בכותרת העליונה "היעד התגובה ריכוז (מיקרומטר)." הנפח של פריימר שיתווספו למאגר פריימר יהיה הפלט בתא מתחת לטקסט הכותרת "אמצעי אחסון מלאי פריימר שיתווספו למאגר (µL)." נפח המים שיתווספו למאגר פריימר כדי לפצות את ריכוזי מחושב הוא פלט על התא בסמוך לטקסט "נפח של PCR כיתה RNase חינם H₂O להיות הוסיף פריימר בריכה (µL)".
   2. לקחת את הנפח של כל פריימר כפי שצוין בקובץ ה-התאמת פריימר ליניארי ולהמציא בריכה פריימר. להוסיף נפח המים מחושב על ידי האלגוריתם כדי לדלל את הבריכה פריימר כפי שנקבע בשלב 2.4.1.
      הערה: אם השיטה אלגוריתם הדרגתיות אינה זמינה, שיטה נוספת היא לחלק את תחל מסה נמוכה ו מסה גבוהה ולהוסיף להכפיל את הריכוז של תחל מסה גבוהה יחסית הקבוצה מסה נמוכה. שלוש או ארבע קבוצות עשויות להידרש וזמינותו גבוהים-פלקס (כלומר, יותר מ 19 SNPs). עם זאת, שיטה זו לא תניב כמו אופטימלית להתקשר לארץ כשיטת אלגוריתם הדרגתיות.
   3. להרכיב את התמהיל אב של סיומת. וזמינותו plex נמוך (1-18 plex), להוסיף μL 0.2 המאגר, μL 0.1 של סיום ערבוב, 0.94 μL של המיקס פריימר LPA מותאם ו μL 0.0205 של אנזים (להכין על הקרח). וזמינותו plex גבוהה (19-36 plex), הוסיפו ריכוז כפול של סיום ערבוב, אנזים (סיום ערבוב 0.2 μL ו- iPLEX האנזים 0.041 μL). עיין בטבלה 8.
   4. להוסיף 2 μL של המיקס מאסטר של התגובה סיומת לצלחת התגובה הקודמת, עכשיו להביא את הנפח הכולל 9 μL לכל טוב. צנטריפוגה בקצרה ולמקם thermocycler: 94 ° C עבור 30 s הראשונית דגירה, 40 מחזורי 1 פרק 94 ° C 5 s עם 5 x (52 ° C 5 s, ואחריו 80 ° C 5 s), ולאחר מכן 72 מעלות צלזיוס במשך 3 דק. עיין בטבלה9.
5. שרף-טיהור.
   הערה: עודפי מלחים עכשיו ניתן להסיר את התגובה עם השימוש של שרף.
   1. להוסיף 16 μL של מים יונים הבארות של צלחת שאוחזרו, מביאים את אמצעי האחסון הצלחת עד 25 μL.
   2. החל שרף, בדרך כלל 6 מ"ג של גומת חן שרף את לוחית (נרכש בנפרד), באופן שווה כל הצלחת. השאר שרף להתייבש בצלחת גומת חן שרף במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר לפני החלת לצלחת התגובה. לאחר תוספת של השרף, לסובב לוח עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר או ביד או עם מערבל ההשעיה במהירות איטית (למשל., 7.5 סל ד).
      הערה: לפני טעינה של analyte genotyping על גבי השבב genotyping, הדגימות ואת וזמינותו הפריסה חייב להיות קלט לתוך ממשק התוכנה. זו יכולה להיות מושגת באמצעות הקובץ עיצוב סיכום של כלי העיצוב וזמינותו.
6. מדידה על פלטפורמה ספקטרומטר מסה.
   1. Centrifuge את הצלחת ב- 3,200 g x עבור 5 דקות כדי להימנע ליישום של שרף השבב ספקטרה המוני.
   2. להעלות את הפריסה צלחת של דגימות של המערכת ממשק התוכנה לפני המרוץ.
      הערה: שלב 2.6.3 צריך לבצע אך ורק על ידי צוות מיומן.
   3. החל את התערובת analyte genotyping מהצלחת השבב genotyping עם מערכת שחולק. לאחר מכן, טען את השבב לתוך המערכת MALDI-תוף כדי ליצור ספקטרום המונית מתוך התערובת analyte, ואז יכול להתפרש בסיועם של ממשק התוכנה של הפלטפורמה.
      הערה: המערכת יוצר ספקטרום המונית על ידי הפניית פולסים קצרים של אור UV-כל 'pad,' המתאים לבאר בודדת של צלחת genotyping, של השבב ספקטרה המוני. הדופק את התוצאה desorption יינון של analyte. אלה מיונן DNA מולקולות ואז מונעות לחלק העליון של שפופרת הוואקום על-ידי שדה אלקטרוסטטי מתח גבוה, להפריד את יוני בהיר יותר, אשר לנוע מהר יותר ולהגיע הגלאי ראשון, מן היונים כבד יותר. "שעת הטיסה" של analytes אלה נרשמות על ידי המערכת, שממנו המסה של כל שבר דנ א יכול להיקבע, כך שניתן להסיק הבסיס נוקלאוטיד נוכח הסנ פ.

3. genotyping נתונים

הערה: בקרת איכות פרשנות הנתונים אינם המוקד של נייר המתודולוגיה הזו. עם זאת, להלן בקצרה יכסה פרשנות הספקטרום המוני.

1. בקרת איכות של ספקטרה המוני, בדיקה ידנית.
   הערה: ספקטרום המוני גולמי שנוצר על-ידי המערכת, ניתח עם התוכנה, כפי שמפורט בטבלה של חומרים. תערובת גאוסיאנית קיבוץ באשכולות שיטת מוחל על פלט זה כדי לבצע שיחות genotyping הסתברותית.
   1. פתח את תוכנת ניתוח. בחר Typer מנתח. בתפריט קובץ , בחר בארות פתוח מקובץ ובחר קובץ ה-xml עם הנתונים קשת הנוצר בשלב 2.6.3. שם צ'יפ עבור ההפעלה צריך להיות גלוי, בחר בה ולאחר חלונית "רמזור" של צלחת 384-ובכן תוצג רשימה של SNPs ב שנבחר היטב. מכאן, לבחור קוראים אשכול מתווה כדי להציג את scatterplot של נקודות נתונים עבור כל הסנ פ.
      הערה: מומלץ כי תוצאה 'אין שיחה' להיות מיושם עבור בעצימות נמוכה SNPs. בתוכנה המשמשת עבור התוצאות נציג, ניתוק מגניטודה קיבוץ באשכולות של 5, שהוא גבוה יותר מאשר ברירת המחדל, הוא הציע לבקרת איכות מחמירים. הגדרה זו ניתן להתאים הפסקת גודל שדה תחת פרמטרים בחלונית פוסט עיבוד אשכולות . בחר Autocluster בכרטיסיה כלים להפעלת ניתוח האשכולות.
   2. לבצע בדיקה ידנית של גנוטיפ שיחות על ידי בחינת מתווה קרטזי בחלונית עיבוד פוסט. בחלונית Assay, בחר את הסנ פ של הריבית ולחץ על הכרטיסיה שלאחר עיבוד אשכולות , מגרש אשכול עם גנוטיפ קיבוץ באשכולות יהיה גלוי עם אחרים המתאימים עבור הסנ פ ומזהים מדגם.
   3. לבחון את האשכולות השיחה גנוטיפ ולהעריך עד כמה כל שיחה בודדים אשכולות עם שיחות אחרות עבור הסנ פ. התוכנה מספקת כמה קווי גבול על המגרש עבור כל גנוטיפ להנחיה; ראה דוגמה של מגרש אשכול גנוטיפ שיחות IL13 הסנ פ (איור 1). אם השיחה לא אשכול בחוזקה עם שיחות אחרות ויושב בבירור מחוץ אשכול, או אם יש לה בעצימות נמוכה מאוד, לנקודות של קליק ימני ובחר שינוי להתקשר עם זה באופן ידני לא להתקשר.
   4. כדי להבטיח איכות גבוהה genotyping הנתונים משמשים לניתוח במורד הזרם, הכללת SNPs ויחידים עם להתקשר לארץ מתחת לסף מסוים QC, למשל 90%. לאחר התאמות נעשו את נתוני השיחות, לייצא את הנתונים עבור יישומים סטטיסטיים. בתוכנה המשמשת כדי להפיק את התוצאות נציג (המופיעות בטבלה של חומרים) זו מושגת עם מבחר צלחת נתונים מתוך תפריט תצוגה ובחירה באפשרות Save As.

תוצאות

עם הפרוטוקול המתואר לעיל, אנו genotyped לתייג SNPs ברחבי הגן המערכת החיסונית Th2 IL13 במדגם של מזון אלרגיה מקרים ופקדים⁹. אנחנו מוחלים ניתוח רגרסיה לוגיסטית, יותאם ממוצא ואת covariates פוטנציאליים אחרים לבדוק אם גרסאות גנטיים בתוך האזור של עניין גדל הסיכון לאלרגיה למזון. טבלה 10 ⁹ מראה rs1295686 variant אחד מזוהה עם אלרגיה למזון מוכחת אתגר וידאנו. עמותה זו במדגם שכפול באמצעות אותו מרובב genotyping הגישה. מטא אנליזה ...

דיון

. הנה, נדגים את השיטה של genotyping מרובבת באמצעות ספקטרומטר מסה. התוצאות נציג נוצרו באמצעות PCR לזווג עם MALDI-TOF ספקטרומטר מסה⁴ בכימיה assay המופיעים בטבלה של חומרים¹³. עם פלטפורמה זו, יצרנו סך של 11,295 אחרים על אנשים 1,255 בגין 9 SNPs בתוך 40 h במעבדה.

אנו ממחישים את התועלת של הטכניקה עונה השערות גנטית על-ידי יצירת וניתוח נתונים הסנ פ עבור הגן המועמד IL13 במדגם גילוי קלינית phenotyped מזון, עם שכפול עצמאי. פלטפורמת ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
דנ"א גנומי	-	-	1 ו-mu; L בריכוז של 5-10 ng/μ L
פריימרים: הגברה קדימה ואחורה והארכה	IDT	-	ראה כתב יד סעיף 1.2.1 על עיצוב פריימרים
מים דה-יונים	למשל מים Milli-Q	-	נטול יונים עם 18.2 MΩ. ערכת ריאגנטים להתנגדות ס"מ
ערכת ריאגנטים לכימיה זהב iPLEX	Agena Bioscience	#10148-2	כולל את כל הריאגנטים לתגובות ב-2.2.1, 2.3.1 ו-2.4.2, לוחות PCR של שבב ושרף
(384-well)	Abgene	#ABGAB-1384	עבור לוחות מערכת MassARRAY של Abgene הם
צנטריפוגות תואמות של Micropipettes			אחת ו-8 ערוצים
			תואם ללוחות 384 בארות
Thermocycler			תואם לתוכניות PCR כמפורט ב-2.2.4, 2.3.2 ו-2.4.3
צלחת שרף גומה	Agena Bioscience		6 מ"ג, מסובב צלחת 384 בארות
MassARRAY Analyzer 4 System	Agena Biosciences		MALDI-TOF (ספיגה/יינון לייזר בעזרת מטריצה – זמן טיסה) ספקטרומטר מסה.
RS1000 Nanodispenser	Agena Biosciences
Assay Assay Suite Agena	Biosciences		כלי המשמש לתכנון מבחני הגנוטיפ המולטיפלקס
Hot Start Taq			DNA פולימראז אנזים
שרף	Agena Biosciences		מסופק עם ערכת iPLEX