כאן, אנו מציגים organotypic culturing פרוטוקול לגדול עוף עובריים באיברים במבחנה. באמצעות שיטה זו, התפתחות עובריים עוף רקמות ניתן יהיה ללמוד, תוך שמירה על רמה גבוהה של שליטה על הסביבה תרבות.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
שיטת Organotypic תרבות ללמוד על התפתחות עובריים עוף רקמות
במאמר זה
סיכום
תקציר
העוף עובריים הוא נפוץ כאורגניזם מודל אמין לפיתוח חוליות. הנגישות שלה, דגירה קצרה תקופה הופך אותו לאידיאלי עבור ניסויים. כיום, המחקר של המסלולים הללו התפתחותית של העובר עוף מבוצע על-ידי החלת מעכבי וסמים באתרים המותאמות לשפות אחרות, בריכוזים נמוכים, תוך שימוש במגוון שיטות. במבחנה culturing רקמות היא טכניקה המאפשרת המחקר של רקמות הופרדו האורגניזם המארח, בזמן בו זמנית תוך עקיפת רבים של המגבלות הפיזיות נוכח בעת עבודה עם כל העוברים, כגון הרגישות של העוברים על מינונים גבוהים של כימיקלים קטלני. כאן, אנו מציגים את organotypic culturing פרוטוקול culturing את העוף מתחלקים חצי ראש במבחנה, המציג הזדמנויות חדשות עבור בחינת תהליכים פיתוחיים מעבר השיטות כיום הוקמה.
מבוא
העוף עובריים (גאלוס גאלוס) הוא אורגניזם מודל מצוין נפוץ בתחום הביולוגיה. תקופת הדגירה שלו הוא בערך 21 ימים, ביצים רבות יכול להיות מודגרות בו זמנית, ביצוע ניסויים מהיר ויעיל. ואולי הכי חשוב, העובר בקלות גם מטופל, המאפשרים לימוד מקיף של תהליכים התפתחותיים המפתח, של גנים, חלבונים כי הכונן תהליכים אלה.
עין עוף עובריים היא איבר מורכב אשר מפתחת דרך האינטראקציה של מספר ברקמות שונות דומה מערכות גוף רבות אחרות. שיטה זו מאפשרת למידת ההתפתחות של רקמות אלה, במיוחד בשלבים מתקדמים של פיתוח. לדוגמה, ייתכן הרשתית רב שכבתית עניין מיוחד הלומדים הפיתוח של מערכת העצבים. שיטות אלטרנטיביות שמאפשרות המחקר של רקמות העין אחרות כגון הקרנית, הגוף vitreal, העדשה, את sclera העפעפיים הם להועיל לחוקרים. העין עובריים עוף מכיל גם סדרה של עצמות שטוחות, עצמות השמע scleral, אשר יכול לשמש כמודל לחקר של עצם intramembranous אינדוקציה, התקשות חולייתנים1.
כיום, ישנן מספר שיטות חקר התפתחות. Microinjections של נוגדנים מעכבות או אחרים מולקולות מעכבות2,3, שהושתל. גרגרי טבולים מעכב4, אלקטרופורציה5 הם כל השיטות יכול לשמש downregulate גנים או חלבונים עניין בהעובר. שיטות דומות משמשות upregulate חלבונים. שיטות אלה אינן ללא המגבלות שלהם. לדוגמה, בעת שימוש בכימיקלים כדי לשנות את ההתפתחות, הערכת ההשפעות קטלני על העובר, זה מגביל את השימוש השיטות דלעיל לאתרים לשפות אחרות של יישום במינונים נמוכים מספיק כדי להבטיח את השרידות של . אני אדם מסוכן
במבחנה culturing רקמות שימש במגוון רחב של אורגניזמים ללמוד פיתוח, יכול לשמש כדי לעקוף חלק מהמגבלות הנ. לדוגמה, femora6, נוצה ניצנים7,8ו הגפיים9 של העוף כל נחקרו באמצעות רקמות culturing שיטות, כמו שיש את האשכים של העכבר10 ושורשים והגבעולים של צמחים11. שיטות אלה מעניקים מדענים רמה גבוהה של שליטה על הפיתוח רקמות, כגון היכולת להשתנות הטמפרטורה ולשנות את זמינות חומרי הזנה. בידודו של הרקמה של העובר כל גם עושה את זה הרבה פחות רגישים להשפעות קטלני של כימיקלים, ובכך מאפשר מניפולציה מחקרים בקנה מידה עולמי בריכוזים גבוהים. יתרון בולט נוסף של במבחנה culturing הוא שימור הסביבה התאית של הרקמה; הסידור של רקמות נותר כמעט ללא שינוי, כך שניתן ללמוד את האינטראקציות בין סוגי רקמות שונות9. לפיכך, במבחנה culturing פותח דלתות נוספות ניסיוני גישות שאינן זמינות במודלים vivo או בכל ovo .
כיום, ללמוד על התפתחות העין עוף עובריים שימוש בכימיקלים הוא מאתגר במיוחד. מספר של ממברנות extraembryonic לכסות את העובר, ולכן קשה ליישם את גרגרי או כימיקלים; העובר הוא מאוד פעיל בתוך הביצה גם כאשר הוא מזדקן, שמסבך עוד יותר את שיטת כבר קשה. פרוטוקול זה מאפשר גישה נוחה לעין, הרקמות הסובבות שלו, ביטול מחסומים אלה, גם בעת מתן הזדמנויות חדשות לבחון תהליכים התפתחותיים בתוך העין. פרוטוקול זה הוקם כדי ללמוד את תנאי הגיוס של עצמות השמע scleral בתוך העין עובריים.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הערה: עבור העובר בשלבים, לנצל את ההמבורגר והמילטון12 (HH) היערכות טבלה.
1. העובר דגירה
- דגירה הביצים עוף מופרית חממה סטרילי, בטמפרטורה מבוקרת-37 ° C ± 1 ° C ו ~ 40% לחות.
- להפוך את הביצים 1 x ליום ולאפשר להם דגירה עד HH34 (8 ימים לאחר ההפריה).
2. הכנה ועיקור של החומרים
- עבור 12 עוברי, החיטוי 2 ל' מים מזוקקים, 1 ליטר של תמיסת מלח צ'יק 0.85%, פיפטות זכוכית 12, 1 קופסה של נייר טישו, 24 2.5 ס"מ x 2.5 ס"מ ריבועי נייר סינון נקבוביים למחצה ו- 24 2.5 ס"מ x 2.5 ס"מ ריבועים של תיל פלדה רשת עם קצוות מעוגלים כלפי מטה. כדי לעקר את החומרים, החיטוי אותם ב 121 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות לפחות.
הערה: autoclaving של החומרים יכול להיעשות מראש. - לעקר את החממה עם 70% אתנול שתמחקי את הצדדים, מדפים, הדלת. מניחים 2 מיכלי פלסטיק המכיל בלוק מזוקקים מים בתוך החממה כדי לשמור על לחות. Prewarm החממה תרבות כדי 37 ° C ± 1 ° C ו ~ 40% לחות. להבטיח שהחממה חשוך לחלוטין; אם הדלת שקוף, מכסה אותו עם נייר כסף.
- Prewarm 100 מ של חומר מזין בינוני, 1 מ"ל של פניצילין על-ידי הצבתם בחממה תרבות.
- מכסה את סביבת העבודה עם מגבת נייר, לעקר את הספסל על ידי התזה עם 70% אתנול. לחטא 2 זוגות של מלקחיים, חיתוך מספריים, סכין גילוח, כפית פלסטיק עם 70% אתנול באופן דומה.
- צלחות פטרי סטריליות 100 מ מ מקום 12 ו- 24 צלחות פטרי סטריליות 35 מ מ על הספסל לשימוש. ודא שהמנות נשארים בשקית סטרילית עד השימוש.
3. עובר הכנה
הערה:, מנקודה זו ואילך, תלבש מסיכת פנים מגן אבק כדי להימנע מזיהום התרבויות. זיהום חיידקי או פטרייתי יהרוס את התרבות, ויש סיכון של זה מתפשטת במהירות בכל התרבויות בחממה.
- לפצח את הביצה ולהעביר את העובר צלחת פטרי 100 מ מ המכיל תמיסת מלח צ'יק 0.85%. בשלב העובר על פי התכונות אנטומי תיאר המבורגר, המילטון היערכות הנחיות12 , לאשר העובר הוא HH34.
- חתך את הצוואר, ואז קטיעות ראש העובר בקו האמצע באמצעות תער מעוקר. בעזרת מלקחיים סטרילי, מסירים את המוח. להשאיר את האף ללא פגע.
4. תרבות ההתקנה
- 2. המקום של 35 מ מ פטרי בתוך צלחת פטרי 100 מ מ אחד.
- מניחים רשת תיל פלדה בתוך צלחת פטרי כל 35 מ מ.
- באמצעות מלקחיים, העברה 1 של ראשי זיבצנטן פיסת נייר סינון נקבוביים למחצה 2.5 ס"מ x 2.5 ס"מ עם העין פונה כלפי מעלה. ודא הרקמה מאובטחת לא להחליק על-ידי הטיית אותו מעט.
- באמצעות מלקחיים, בזהירות המקום רקמת העין, נייר הסינון על גבי רשת התיל פלדה 1 של 35 מ מ פטרי, יצירת במה מוגבהת עם רקמת העין על העליונה.
- חזור על שלבים 4.3 ו- 4.4 עם חצי ראש אחרים.
- בזהירות בעזרת פיפטה של זכוכית סטריליים, להוסיף את מזין בינוני ישירות לתוך צלחת פטרי כל 35 מ מ עד שהוא מגיע לרמת נייר הסינון. לא להטביע את הראש חצי במדיום התזונתי.
- להוסיף 50 µL של 10,000 U/mL פניצילין-סטרפטומיצין המדיום מזין בכל צלחת פטרי.
- מקפלים פיסת נייר טישו לתוך כיכר קטנה ומניחים אותו בתוך 100 מ מ פטרי. להרטיב אותה במים מזוקקים בלוק.
- מקם את המנה תרבות לתוך החממה סטרילי, כהה-37 ° C ± 1 ° C ו ~ 40% לחות עד 4 ימים.
- חזור על שלבים 3 ו- 4 עבור כל העובר.
הערה: מספר העוברים צריך יהיה תלוי בניסוי מסוים; כאן, אנו מתארים את פרוטוקול עוברי 12.
5. תרבות תחזוקה
- פעם אחת ביום, למעלה למעלה את מיכלי פלסטיק בחממה עם מים מזוקקים טריים, בלוק.
- מדי יום בדוק בכל התרבויות עבור זיהומים חיידקים או פטריות. תרבויות זה יש התפוררה או שבהם המדיום השתנה צבע נגועים. למחוק את כל התרבויות שהודבקו.
6. קיבוע
- בעקבות culturing, הסר את כל המנות של החממה.
- באמצעות זוג מלקחיים, להסיר בעדינות את העין נייר הסינון, מטפל לא לקרוע את הרקמה.
- לתקן את רקמת העין paraformaldehyde 4% 1 x באגירה פוספט תמיסת מלח בן לילה ב 4 ° C או בפורמלין באגירה נייטרלי 10% למשך הלילה בטמפרטורת החדר.
- אחסן את הרקמה ב 4 ° C 1 x באגירה פוספט תמיסת מלח.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
באמצעות שיטה זו, עין עוף עובריים יכולים להיות מחונן יום 8 של התפתחותו (HH34) במבחנה 4 ימים ארבעה ימים של ovo פיתוח מקביל HH38.
שיטה זו culturing תומך בפיתוח של נוצה ניצנים סביב העין, על העפעפיים (איור 1B). אלה ניצנים נוצה אינם נוכחים ב ovo -HH34 לפני culturing (איור 1 א'), המציין כי פיתוח באד נוצה מאותחלת במהלך תקופת culturing, כפי שהוא ב ...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
פרוטוקול זה עושה שימוש רקמת הוקמה culturing הטכניקות להשגת צמיחת יש עין עוף מיום עובריים 8 (HH34) במבחנה 4 ימים. שיטה זו רשת culturing תוארה במקור על ידי Trowell15. אנחנו אופטימיזציה פרוטוקול מ של פינטו ואולם 1991 המחקר16 ניצול קרום נקבוביים למחצה עם רשת ללמוד אינדוקטיבית אותות בין רקמות מופרדים שכבות של העין עובריים עוף15. באמצעות שיטה זו, מקק תרבותי עוף 14 - בן יום עצם הירך6. שיטה זו גם הוכח כיעיל ב culturing העכבר ...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים אין לחשוף.
תודות
המחברים רוצה להודות גרגורי האלר (הר סנט וינסנט אוניברסיטת) עבור עבודתו ראשוני בפיתוח של הפרוטוקול. המחברים רוצה גם להודות ג'ונס ניקולס (אוניברסיטת סנט וינסנט הר) עבור שלו מומחיות טכנית ועזרה עם הצילומים וייצור של חלק אודיו-ויזואלית של כתב היד. דניאל אנדרוז נתמכה על ידי מימון MSVU ו מדעי הטבע הנדסה מחקר המועצה של קנדה (NSERC) דרך פרס מחקר של סטודנטים לתואר ראשון. תמרה א פרנץ-Odendaal נתמך על ידי מענק גילוי NSERC.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| צלחות פטרי תרבית תאים 35 מ"מ | קורנינג | 353001 | אחיזה קלה, פוליסטירן, |
| צלחות פטרי תרבית תאים 100 מ"מ | צלחת תרבית רקמות קורנינג 353003, פוליסטירן, רקמת נייר לא פירוגנית | ||
| Kimtech | 34155 | מגבי משימות מותג Kimtech Science, 280 לכל רשת | |
| תיל | n/a | n/a | רשת תיל נירוסטה (גודל רשת 0.7 מ"מ) |
| פיפטות זכוכית חד פעמיות | VWR | 14673-010 | זכוכית בורוסיליקט חד פעמית 5 3/4 אינץ' |
| מזין בינוני | Gibco | 12591-038 | שינוי פיטון-ג'קסון, [+] L-גלוטמין עם פנול אדום (BGJB) |
| פניצילין-סטרפטומיצין | סיגמא-אולדריץ' | P4458 | 10000 יחידות/מ"ל תמיסת סטרפטומיצין פניצילין מסנן מיוצב |
| נייר | Whatman | 1454 090 | נייר סינון חצי נקבובי 90 מ"מ |
| ביצי עוף מופרות | המכללה החקלאית של אוניברסיטת דלהאוזי | n/a | ניתן להשיג מחוות מקומיות |
| נתרן כלורי (NaCl) | EMD | SX0420-3 | גבישי נתרן כלורי, מגיב |
| כיתה 1 L בקבוק זכוכית | VWR | 89000-240 | 1 ליטר פיירקס בקבוק זכוכית חיטוי |
| אתנול | Fisher Scientific | BP82011 | 70% מיכלי טאפרוור בדרגת ביולוגיה מולקולרית |
| n/a | n/a | שנרכשו בחנות ומעוקרים עם | |
| סכיני גילוח חד פעמיים | VWR | 55411-050 | סכיני גילוח תעשייתיים בקצה יחיד (פלדת פחמן כירורגית) |
| כפיות פלסטיק | n/a | /a | נקנו בחנות ומעוקרים עם |
| מסכת אבק | EtOH 3M | n/a | 3M 8500 מסכת נוחות |
| פרפורמלדהיד | סיגמא-אולדריץ' | P6148 | פרפורמלדהיד, דרגת ריאגנט, |
| פורמלין ניטרלי גבישי חוצץ | פישר סיינטיפיק | 72210 | 10% ניטרלי חוצץ פורמלין |
| פוספט מלח (PBS) | n/a | n/a | 10X פוספט חוצץ תמיסת מלח pH 7.4 (137 מ"מ NaCl, 2.5 מ"מ KCl, 4.3 מ"מ Na2HPO4, 1.4mM KH2PO4) |
| 15 מ"ל צינורות בז | VWR | 21008-216 | צינורות צנטריפוגה מעוקרים |
| מלקחיים | FST | n/a | מלקחיים עדינים |
| אפרוחים מלח | n/a | n/a | 0.85% NaCl |
| נייר כסף | N/A | N/A | שנרכשה בחנות |
| N/A | N/A | נקנה בחנות |
מקורות
- Franz-Odendaal, T. A. Towards understanding the development of scleral ossicles in the chicken, Gallus gallus. Developmental Dynamics. 237 (11), 3240-3251 (2008).
- Scholey, J. M. Functions of motor proteins in echinoderm embryos: an argument in support of antibody inhibition experiments. Cell Motility and the Cytoskeleton. 39 (4), 257-260 (1998).
- Horakova, D., et al. Effect of FGFR inhibitors on chicken limb development. Development, Growth & Differentiation. 56 (8), 555-572 (2014).
- Gerlach, G. F., Morales, E. E., Wingert, R. A. Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo. Journal of Visualized Experiments. (101), e52943(2015).
- Luz-Madrigal, A., Grajales-Esquivel, E., Del Rio-Tsonis, K. Electroporation of Embryonic Chick Eyes. Bio-protocol. 5 (12), e1498(2015).
- Roach, H. I. Long-term organ culture of embryonic chick femora: a system for investigating bone and cartilage formation at an intermediate level of organization. Journal of Bone and Mineral Research. 5 (1), 85-100 (1990).
- Jung, H. S., et al. Local inhibitory action of BMPs and their relationships with activators in feather formation: implications for periodic patterning. Developmental Biology. 196 (1), 11-23 (1998).
- McKinnell, I. W., Turmaine, M., Patel, K. Sonic Hedgehog functions by localizing the region of proliferation in early developing feather buds. Developmental Biology. 272 (1), 76-88 (2004).
- Smith, E. L., Kanczler, J. M., Oreffo, R. O. A new take on an old story: chick limb organ culture for skeletal niche development and regenerative medicine evaluation. European Cells & Materials. 26, 91-106 (2013).
- Sato, T., et al. In Vitro Spermatogenesis in Explanted Adult Mouse Testis Tissues. PLoS One. 10 (6), e0130171(2015).
- Ochoa-Villarreal, M., et al. Plant cell culture strategies for the production of natural products. BMB Reports. 49 (3), 149-158 (2016).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Yu, M., et al. The developmental biology of feather follicles. The International Journal of Developmental Biology. 48 (0), 181-191 (2004).
- Jabalee, J., Hillier, S., Franz-Odendaal, T. A. An investigation of cellular dynamics during the development of intramembranous bones: the scleral ossicles. Journal of Anatomy. 223 (4), 311-320 (2013).
- Trowell, O. A. The culture of mature organs in a synthetic medium. Experimental Cell Research. 16 (1), 118-147 (1959).
- Pinto, C. B., Hall, B. K. Toward an understanding of the epithelial requirement for osteogenesis in scleral mesenchyme of the embryonic chick. Journal of Experimental Zoology. 259 (1), 92-108 (1991).
- Mbiene, J. P., MacCallum, D. K., Mistretta, C. M. Organ cultures of embryonic rat tongue support tongue and gustatory papilla morphogenesis in vitro without intact sensory ganglia. Journal of Comparative Neurology. 377 (3), 324-340 (1997).
- Cloney, K., Franz-Odendaal, T. A. Optimized ex-ovo culturing of chick embryos to advanced stages of development. Journal of Visualized Experiments. (95), e52129(2015).
- Korn, M. J., Cramer, K. S. Windowing chicken eggs for developmental studies. Journal of Visualized Experiments. (8), e306(2007).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
