מאמר שיטה

תגובת שרשרת של פולימראז מולטיפלקס שעתוק במהופך תא בודד לאחר תיקון-קלאמפ

DOI:

10.3791/57627

⸱

20 ביוני 2018

 ,  ,  , 
1UPMC Univ Paris 06, INSERM, CNRS, Neuroscience Paris Seine - Institut de Biologie Paris Seine (NPS - IBPS), Sorbonne Université

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר את השלבים הקריטיים של אמצעי הזהירות הנדרשים לביצוע תגובת שרשרת של פולימראז שעתוק במהופך מולטיפלקס תא בודד לאחר תיקון-קלאמפ. טכניקה זו היא שיטה פשוטה ויעילה כדי לנתח את פרופיל ביטוי של קבוצת גנים מתא יחיד מאופיין על ידי תיקון-קלאמפ הקלטות מראש.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קליפת המוח מורכב סוגי תאים רבים מפגין תכונות מורפולוגיות, הפיזיולוגית מולקולרית שונות. המגוון הסלים קל זיהוי ואפיון אחד מסוגי התאים, תנאים מוקדמים ללמוד הפונקציות הספציפיות שלהם. מאמר זה מתאר תא בודד מולטיפלקס שעתוק במהופך פולימראז תגובת שרשרת (RT-PCR) הפרוטוקול, המאפשר, לאחר תיקון-קלאמפ הקלטה לפרוסות, כדי לזהות בו זמנית את הביטוי של עשרות גנים בתא יחיד. שיטה זו פשוטה ניתן ליישם עם אפיון מורפולוגי, והוא החלים נרחב כדי לקבוע את התכונות פנוטיפי של סוגי תאים שונים ועם סביבתם הסלולר מסוים, כמו למשל בקרבת כלי דם. העיקרון של פרוטוקול זה היא כדי להקליט תא עם הטכניקה תיקון-קלאמפ, כדי לקצור ולהפוך לתמלל את התוכן cytoplasmic שלה, כדי לזהות איכותית הביטוי של ערכה מוגדרת מראש של גנים על ידי מגה-פלקס PCR. זה דורש עיצוב זהיר של PCR תחל והפתרון תיקון תאיים-קלאמפ תואמת ל- RT-PCR. כדי להבטיח תעתיק סלקטיבי ואמין זיהוי, טכניקה זו מחייבת גם הפקדים המתאימים הציטופלסמה הקטיף לצעדים הגברה. למרות אמצעי הזהירות שנדונו כאן חייב להיות במעקב בלבד, כמעט כל מעבדה אלקטרופיזיולוגיות באפשרותך להשתמש התא הבודד מולטיפלקס בטכניקת RT-PCR.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קליפת כוללת סוגי תאים רבים המעורבים בתהליכים פיזיולוגיים שונים. זיהוי ואפיון שלהם, תנאי הכרחי להבנה של הפונקציות הספציפיות שלהם, יכולה להיות מאוד מאתגרת בהתחשב גדול מורפולוגי, הפיזיולוגית המולקולריים הרב גוניות המאפיינת את סלולרי קורטיקלית סוגים1 ,2,3,4.

תא בודד מולטיפלקס RT-PCR מבוססת על השילוב של תיקון-קלאמפ וטכניקות RT-PCR. זה יכול לחקור בו זמנית את הביטוי של גנים מוגדרים מראש יותר מ-30 תאים מזוהה electrophysiologically5 ההכללה של מכשיר מעקב עצביים ב ההקלטה פיפטה נוספת מאפשרת אפיון מורפולוגי של התאים מוקלט אחרי התגלות פתולוגיה6,7,8,9, 10. זאת שיטה מאוד שימושי עבור הסיווג של סוגי עצביים מבוסס על ניתוח רב משתני שלהם תכונות פנוטיפי5,9,10,11,12 13, ,14. תא בודד מולטיפלקס RT-PCR מתאים גם אפיון תאים שאינם עצביים כגון האסטרוציטים15,16,17, ולא ניתן להחיל כמעט על כל המוח מבנה18, 19,20,21,22,23 תא וסוג, בהנחה שהם ניתן להקליט בתצורה של כל תא.

טכניקה זו היא מאוד נוח עבור זיהוי מקורות הסלולר ו/או מטרות של שידור מערכות7,8,15,16,20,21, 24,25,26,27,28, במיוחד כאשר נוגדנים ספציפיים חסרים. זה מסתמך על תיקון-קלאמפ הקלטות של תאים שזוהה באופן חזותי29, ובכך מאפשר גם את המיקוד של תאים ב-15,8,16בסביבה התאית הספציפית. יתר על כן מאז cytoarchitecture של רקמת המוח נשמר פרוסות המוח, גישה זו גם מאפשרת חקר הקשרים האנטומי של התאים מאופיין עם אלמנטים שאינם עצבית עצביים7,8 , 18.

מאז בטכניקה זו הוא מוגבל לפי כמות הציטופלסמה שנקטפו ועל ידי יעילות RT, הגילוי של mRNA באה לידי ביטוי במספר עותק נמוך יכול להיות קשה. למרות גישות אחרות מבוסס על טכנולוגיית RNaseq לאפשר לנתח את כל transcriptome של תאים בודדים3,4,30,31, הם צריכים תפוקה גבוהה סקוונסרים יקר. לא בהכרח זמין בכל מעבדה. מאז הטכניקה RT-PCR תא בודד מולטיפלקס משתמשת מובילים PCR, זה רק דורש thermocyclers הנפוצה. זה יכול להתפתח בקלות במעבדות מצויד אלקטרופיזיולוגיות set-ups, לא דורשת ציוד יקר. זה יכול לספק, בתוך יום אחד, ניתוח איכותי של הביטוי של ערכה מוגדרת מראש של גנים. לפיכך, גישה זו מציעה גישה נוחה אפיון מולקולרי תאים בודדים בצורה מהירה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל ההליכים ניסיוני באמצעות בעלי חיים היו שבוצעה על פי תקנות צרפתי (קוד כפריים R214/87 כדי R214/130), תאמו את ההנחיות האתית של האמנה הלאומית הצרפתית והן בקהילה הכלכלית האירופית (86/609/EEC) על האתיקה של ניסויים בבעלי חיים. כל הפרוטוקולים היו אושרו על ידי ועדת האתיקה צ'ארלס דרווין, נאספו צרפתית משרד חינוך ומחקר (אישור 2015 061011367540). המתקן בעלי חיים IBPS הוא מוכר על ידי הרשויות הצרפתיות (A75-05-24).

1. שיקולים ראשוניים

הערה: כדי להימנע מציג, תואם ההמלצות הבאות לפני שיחתמו תא בודד RT-PCR לאחר תיקון-קלאמפ.

  1. אל תשתמש פלסמידים המכיל גנים עניין במעבדה כפי שהם מקור פוטנציאלי של זיהום.
  2. שומרים ספסל מעבדה מן החדר ג'ל אלקטרופורזה להכין מותני.
  3. להקדיש סט של פיפטות וטיפים אירוסול עמיד המסנן לתמרן DNA ו- RNA בריכוזים נמוכים יותר 1 ng/µL. אף פעם לא השתמש ברשימות אלה כדי לנתח את מוצרי ה-PCR.
  4. תמיד להשתמש במוצרים RNase-DNase נטול, תלבש כפפות.
  5. השתמש כימיקלים ייעודי עבור הכנת פתרונות תיקון פנימי-קלאמפ. לעולם אל תשתמש במרית אבל מעדיף במשקל נייר לשקול אבקות.
  6. השתמש אלקטרודת pH ייעודי ו- pH פתרונות סטנדרטיים, כמו שהם יכולים להיות מקור זיהום (למשל, RNase).
  7. לאחסן זכוכית בורוסיליקט נימים... 20 µL ארוכה, בסדר וגמיש טיפים; micropipette 20 µL; expeller תוצרת בית (מצורף מזרק 10 מ"ל מחזיק פיפטה תיקון-קלאמפ); µL המבחנות 500; 10 µL אירוסול עמיד המסנן טיפים; דק פרמננטיים בקופסא ייעודית (איור 1).

2. פריימר עיצוב

הערה: RT-PCR מולטיפלקס מסתמך על שני צעדים הגברה. במהלך PCR הראשון, כל הגנים של עניין הם מוגבר במשותף על ידי ערבוב יחד כל תחל ה-PCR. כדי לזהות באופן אמין תעתיקים של תאים בודדים, זה חיוני לעיצוב תחל PCR סלקטיבי ויעילה. השימוש מקוננים תחל (פנימי) הסיבוב השני של ה-PCR משפר את יחודיות וגם את היעילות של ההגברה.

  1. אחזר את רצפי mRNA אצר את הגנים של עניין NCBI הפניה רצף מסד32 , כמו גם אלה של משפחתם קשורים (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/).
    1. הזן את השם של gene (s), המינים של עניין כשאילתה ולחץ על הרצף הרלוונטיים שאוחזרו.
    2. כדי להגביל את הניתוח רצף קידוד gene (s), לחץ על שלח אל (בפינה הימנית העליונה), ובחר קידוד רצפים של נוקלאוטיד FASTA כתבנית. לאחר מכן לחץ על צור קובץ , שמירת הרצף FASTA באמצעות סיומת קובץ ".nt".
  2. השתמש ארת ענק התוכנה33 (בנייה יישור מרובים & ניתוח עבודה, שעליו מונחים) או כל תוכנה יישור מרובים אחרים כדי לקבוע את מחוזות הומולוגיה.
    1. לחץ על הקובץ | פרוייקט חדש... ובחר DNA כסוג רצף. כדי לייבא את רצפי הגן, בחר רצף | ייבוא רצף... לטעון קובץ ".nt". חזור על הפעולות על כל רצפי קשורים.
    2. לחץ וגרור כל רצפי בחלון סכמטית כדי לבחור את הרצף כולו.
    3. חפש את מחוזות הומולוגיה על-ידי בחירה יישור | חיפוש של רחובות... (CTRL + S). בחר קטע זוג חופפים שיטת החיפוש. התאם את Pairwise ניקוד הפסקת לערך גבוה יחסית (למשל, 1,000), את seqs. מינימלית לכל בלוק למספר הכולל של רצפי יישור, לחץ על התחל.
    4. המופיעים בחלון תוצאות חיפוש , בחר את result(s) עם MP-הניקוד הגבוה ביותר ולחץ על הקישור. אם התוצאה לא נמצא, להקטין את Pairwise ניקוד הפסקת ו/או את seqs. מינימלית לכל בלוק.
    5. כדי להקל על הפריט החזותי של אזורים הומולוגיים, בחר יישור | הצללה | כלומר הציון.
    6. בחר חלקים לא מקושרים של הרצף וחזור 2.2.3–2.2.4 את השלבים לקביעת פוטנציאל באזורים אחרים של הומולוגיה עם MP-ציון נמוך יותר.
    7. כדי להשיג את תחל הספציפי ביותר, בחר את האזורים עם הומולוגיה לפחות הרצף.
  3. תביא את רצף כל הווריאציות splice וחזור על שלבים 2.2.1–2.2.6. בחר שלהם אזורים משותפים לגילוי הכללית. שקול קלטות חלופי עבור splice ייעודי גרסאות ניתוחים20,34,35,36.
  4. יישר את רצפי mRNA על הגנום במודל חיה באמצעות הפיצוץ37 הגנום (בסיסי מקומי יישור כלי חיפוש) כדי לקבוע את המבנה אינטרון-אקסון של הגנים (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
    1. בחר את הגנום העכבר הפיצוץ על ידי לחיצה על העכבר ולהעלות את רצף FASTA שאוחזרו במקטע להזין שאילתת רצף . תוכנית הבחירה, בחר מטב עבור רצפים דומים מאוד (megablast)ולאחר מכן לחץ על לחצן הפיצוץ .
    2. במקטע ' תיאור ', בחר את היישור באמצעות זהות הגבוהה ביותר (עד 100%). ודא כי הוא מתאים הגן עניין כמצוין תכונות של המקטע במערכים .
    3. למיין את היישור על-ידי השאילתה מיקום התחלה באותו מקטע כדי לקבל את הירושה exons של רצף קידוד. הערה את מיקומי ההתחלה והסוף של כל הלהיטים, המקבילים בערך למיקום של אינטרונים על הרצף שאילתה (איור 2 א).
  5. בחר שני exons שונים עבור תחל הישר ואת antisense להבדיל בקלות cDNA גנומית הגברה דנ א (gDNA) בהתבסס על קריטריון גודל (איור 2).
    הערה: ההגברה של gDNA יכול להתרחש בתדירות נמוכה כאשר הגרעין הוא נקצרו עם הציטופלסמה. לכן, זה חיוני כדי לעצב אינטרון overspanning זוגות פריימר (איור 2 א). במקרה של גנים אינטרון-פחות, האוסף של הגרעין בעייתי כמו זה יכול להוביל פוטנציאל משתנה מתערב תוצאות. כדי לטפל בבעיה זו, כולל ערכה של צבעי יסוד מכוון הגברה רצף intronic כדי לחקור הנוכחות של gDNA25. אם הפקד גנומית הוא חיובי, התוצאות עבור כל הגנים אינטרון-פחות חייב להיות מושלך.
  6. כדי להשיג הגברה יעיל, בחר תחל לייצר amplicons באורך מורכבת באופן אידיאלי בין 200 ו-400 בסיסי זוגות (איור 2).
  7. כדי להגביר בו זמנית שונים cDNAs במהלך השלב ה-PCR מולטיפלקס, עיצוב תחל עם אורך בין 18 ו-24 נוקלאוטידים טמפרטורת ההיתוך (Tm) בין 55 ל- 60 מעלות צלזיוס.
  8. כדי לצמצם את היווצרות מבנים משניים, המקטינים את התשואה הגברה, בחר חוש חוש אנטי תחל עם סיכת ראש מינימלי, דופלקס אורכי (איור 2B).
  9. עיצוב פנימי תחל אותם קריטריונים (שלבים 2.5-2.8).
  10. ודא יחודיות של תחל ה-PCR על ידי יישור תחל את הפניה RNA רצף במסד הנתונים של האורגניזם עניין באמצעות נוקלאוטיד הפיצוץ.
    1. בפיצוץ (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), לחץ על נוקלאוטיד הפיצוץ. הדבק את הרצף של פריימר הזן רצף שאילתה.
    2. במקטע בחר להגדיר חיפוש , לחץ על אחרים (nr וכדומה), בחר רצפי RNA הפניה (refseq_rna) באפשרות מסד הנתונים וציין האורגניזם (למשל, ס. מאסכאלאס (taxid:10090) ) כדי להגביל את הניתוח מהמין הרצוי.
    3. בחירת תוכנית בחר מטב עבור רצפי דומה במקצת (blastn). במקטע פרמטרי האלגוריתם להקטין את גודל מילה עד 7 כדי להגדיל את הסיכוי להשגת תוצאות.
  11. כדי לעצב תחל סלקטיבית, לשמור רק את רצף של מי יש אי-התאמות לפחות 3 עם cDNAs רצויה כאשר הדבר אפשרי.
  12. סדר desalted תחל בריכוז גבוה יחסית (למשל, 200 מיקרומטר) על מנת להבטיח כי כל תחל החיצוני ניתן לערבב יחד-ריכוז סופי של 1 מיקרומטר.

3. הכנת ריאגנטים RT

  1. 5 x RT-מיקס: להכין במים נטולי RNase µL 400 של עובד RT תמהיל פתרון (5 x) המכילה אקראי תחל ב 25 מיקרומטר, dNTPs ב- 2.5 מ מ. חנות בשילוב עבודה זה כמו aliquots 20 µL 500 µL צינורות.
  2. 20 x Dithiothreitol (DTT): להכין 1 מ"ל של 0.2 מ' DTT ב RNase ללא מים, לאחסן אותו כמו 50 µL aliquots.
  3. חנות 2,500 U של RNase מעכב (40 U µL) ל- 10,000 U של רוורס טרנסקריפטאז (RTase, 200 U/µL) כמו 5 µL aliquots.
  4. כדי להבטיח איכות אופטימלית של ריאגנטים RT, לאחסן את aliquots ב-80 מעלות צלזיוס. להשתמש בהם עבור עד 10 תאים, רק ליום אחד.

4. PCR אימות

  1. להכין cDNAs על-ידי ביצוע של שעתוק במהופך על כמות גדולה יחסית של RNA (בדרך כלל 1 µg) שחולצו סה כ38 מן המבנה של ריבית.
    1. אין להשתמש על פיפטות ייעודי יחיד תא RT-PCR עבור שלבים מוקדמים אלה אבל השימוש מדי את RNase ללא סוכר. לדלל RNA הכולל עד µg 1/µL.
    2. בשפופרת 500 µL PCR, להוסיף 1 µL של RNA הכולל מדולל ו µL 8 RNase ללא מים. Denature ב 95 ° C עבור 1 דקות, לצנן את הצינורית על קרח.
    3. להוסיף µL 4 RT 5 x המאגר שסופק על-ידי היצרן, µL 4 RT תמהיל פתרון, 1 µL של RTase, 1 µL של מעכב RNase ו 1 µL של 200 מ מ DTT (ראה סעיף 3).
    4. קפיצי הצינור, לסובב אותו, דגירה בין לילה ב 37 º C.
    5. אחסן את cDNAs ב-80 מעלות צלזיוס במשך עד מספר שנים. הכן של aliquot של cDNAs מדולל כדי 1 ng/µL של מקבילות RNAs הכולל.
  2. לערבב, לדלל כל זוג תחל ב- 1 מיקרומטר עם פיפטות המוקדש תא בודד RT-PCR. השתמש µL 20 של כל תערובת פריימר עבור 100 µL מותני.
  3. על קרח, להכין עבור כל זוג פריימר של premix המכיל: מים (q.s., 80 µL), µL 10 של 10 X מאגר µL 1 של 100 x dNTPs (50 מיקרומטר כל אחד), 500 – 1,000 pg של cDNA מדולל ב 1 ng/µL, 0.5 µL (2.5 U, U 5/µL) של אנזימים.
  4. השתמש המבחנות שמתאימים בחוזקה הבארות של המכונה PCR עבור פקד טמפרטורה אופטימלית. להוסיף 2 טיפות (~ 100 µL) של שמן מינרלי premix בלי לגעת בקיר או את הכובע של הצינור ה-PCR.
  5. כדי לצמצם את היווצרות פריימר-הדימרים, לבצע התחלה חם על-ידי הצבת את המבחנות thermocycler שחומם מראש ב- 95 מעלות צלזיוס. לאחר 30 s, במהירות לגרש 20 µL של המיקס פריימר על גבי השמן.
  6. אחרי 3 דקות ב 95 מעלות צלזיוס, הפעל את מחזורי 40 (95 ° C, 30 s; 60 ° C, 30 s; 72 ° C, 35 s) ואחריו שלב התארכות הסופי ב-72 מעלות במשך 5 דקות.
  7. ניתוח µL 10 של כל מוצרי ה-PCR על-ידי agarose ג'ל אלקטרופורזה (2%, משקל/נפח)39. אם כמה מוצרים PCR אין את הגודל הצפוי, עיצוב מחדש אחרים תחל (ראה סעיף 2).
    התראה: אתידיום ברומיד הוא חומר כימי intercalating זה יכול לגרום DNA מוטציות. התייעץ עם המשרד המקומי בטיחות לפני השימוש בו. השתמש בכפפות בשעת טיפול זה. השתמש פתרון זמין מסחרית של אתידיום ברומיד (10 mg/mL) פתרון במקום אבקת כדי למזער את הסיכון של אינהלציה. באופן דומה, אור UV יכולה להזיק, כך שעליך לוודא ללבוש משקפי הגנה UV או מסכה. תיסוג ג'לים המלוכלכים, טיפים, כפפות, מאגר במיכלים המוקדש אתידיום פסולת.
  8. לאחר כל זוגות פריימר הוכר כתקף באופן אינדיבידואלי, הבדיקה פרוטוקול מולטיפלקס (איור 3).
    1. לערבב, לדלל כל תחל החיצוני יחד 1 מיקרומטר. בחנות תחל מולטיפלקס לערבב ב-20 ° C עבור עד מספר שבועות.
    2. על קרח, להכין premix המכיל: מים (q.s., 80 µL), µL 10 של 10 X מאגר, µL 1 של 100 x dNTPs (50 מיקרומטר של כל אחד), 500-1000 pg של cDNAs מדולל ב 1 ng/µL, 0.5 µL (2.5 U, U 5/µL) של אנזימים.
    3. קפיצי הצינור PCR, לסובב אותו, וכן להוסיף 2 טיפות (~ 100 µL) של שמן מינרלי.
    4. לבצע התחלה חם כפי שמתואר בשלב 4.5 עם 20 µL של פריימר מולטיפלקס מיקס. לאחר 3 דקות ב 95 מעלות צלזיוס, להפעיל 20 מחזורים PCR זהים לאלה של שלב 4.6.
    5. הכן מספר זהה למספר של גנים לנתח המבחנות. הכן של premix כמו שלב 4.8.2, אבל בעזרת µL 1 של המוצר הראשון PCR לכל הגן כתבנית. התאם את כל אמצעי האחסון לפי מספר גנים כדי לנתח, שקול להשתמש 10% יותר נפח כדי לפצות על שגיאות pipetting.
    6. לנער בעדינות, לסובב את הצינור, מוקד µL 80 של premix כל צינור PCR, וכן להוסיף שתי טיפות (~ 100 µL) של שמן מינרלי למחזור מבלי לגעת בקיר או את הכובע של הצינורות.
    7. מבצע חם להתחיל (ראה שלב 4.5) על ידי שחרור 20 µL של פריימר פנימי תערובת מוכנה בשלב 4.2. הפעל את מחזורי PCR 35 זהה לשלב 4.6.
    8. לנתח את המוצרים PCR השני על ידי agarose בג'ל. ודא כי כל PCR השני יוצר של אמפליקון הגודל הצפוי. במקרה של amplifications לא יעיל או לא ספציפית, עיצוב מחדש חדשה תחל (שלבים 2.5-2.12) ולאמת אותם (שלבים 4.2 – 4.8).

5. הכנה ובדיקת של פתרון תיקון תאיים-קלאמפ

הערה: פרוטוקול הבאים מתאר את ההכנה, אימות של /gluconate K+המבוסס על הפתרון הפנימי, אבל כמעט כל סוג של פתרון תיקון-קלאמפ יכול לשמש כל עוד זה לא ה"בלתי את היעילות של RT-PCR. לבש כפפות הוא חובה להשיג פתרון פנימי ללא RNase.

  1. עבור 60 מ של פתרון הקלטה תיקון פנימי-קלאמפ, להכין את extemporaneously 10 מ"ל של 0.1 M KOH.
  2. להמיס 11.4 מ"ג EGTA (סופי 0.5 מ"מ) ב- 0.9 מ של 0.1 M KOH.
  3. להוסיף 40 מ"ל RNase ללא מים, להמיס 2.02 גר' K-gluconate (144 מ"מ הסופי), 143 מ ג של HEPES (10 מ מ הסופי), 180 µL של 1 מ' MgCl2 (3 מ מ הסופי).
  4. להתאים את ה-pH ל 7.2 על-ידי הוספת ~ 6 מ ל 0.1 M KOH.
  5. להתאים את osmolarity כדי mOsm 295 עם ~ 13 מיליליטר מים RNase-חופשית.
  6. מאז הפתרון הפנימי משמש גם כאמצעי שעתוק לאחור, בזהירות לשלוט מ ג2 + ריכוז. לפצות על Mg2 + ריכוז נמוך יותר בפתרון פנימי על-ידי הוספת MgCl2 לאחר מכן להגיע ריכוז סופי של 2 מ מ בהתגובה RT.
  7. להוספת תווית התא שנקטפו לאחר תיקון-קלאמפ הקלטה, להוסיף 2 – 5 מ"ג/מ"ל של biocytin נטולת RNase הפתרון הפנימי המתואר לעיל (שלבים 5.1 – 5.5).
  8. סינון (גודל הנקבוביות מיקרומטר 0.22) הפתרון פנימי ואחסן אותו ב-80 מעלות צלזיוס כמו 100 – 250 µL aliquots.
  9. כדי לאמת את השימוש של הפתרון הפנימי החד-תאיים RT-PCR, להוסיף 0.5 µL של RNAs הכולל מדולל ב ng/µL 1 עד 6 µL של פתרון תיקון-קלאמפ ולהשאיר אותו על הספסל במשך כ 30 דקות.
  10. עם micropipette 2 µL, להוסיף 2 µL של 5 x RT-מיקס, 0.5 µL של 20 x DDT, מעכב RNase µL 0.5 ו- 0.5 µL RTase, דגירה בין לילה ב 37 º C.
  11. לסובב את הצינור. על קרח מוסיפים מים (q.s., 80 µL), µL 10 של 10 X מאגר, 0.5 µL (2.5 U, U 5/µL) של אנזימים.
  12. לבצע 40 מחזורי PCR באמצעות קבוצת המאומת תחל (שלבים 4.4 – 4.6).
  13. לנתח את המוצרים PCR ידי agarose בג'ל (ראה שלב 4.7) ולוודא שיש להם את הגודל הצפוי.
    הערה: השמטת את µL 0.5 של RNA הכולל והחלפתו 0.5 µL נטולת RNase מים יבטיחו כי הפתרון הפנימי הינו ללא מציג RNA או DNA.

6. חריפה פרוסה הכנה

הערה: פרוטוקול זה מתאר את השגרה עם פרוסות לנוער (כלומר, פחות מ 28 ימים לאחר הלידה) עכברים זכר ונקבה. פתרונות חיתוך אחרים, כגון מבוססי סוכרוז מלאכותי השדרתי (כלנית חדד) הם גם שמיש40.

  1. להכין 2 ל' של חנה המבר המכיל (במ מ) 125 NaCl, 2.5 אשלגן כלורי, 2 CaCl2, 1 MgCl2, NaH 1.252PO4, 26 NaHCO3, גלוקוז 10 ו- 15 סוכרוז. כדי לצמצם את פעילות glutamatergic במהלך ההכנה פרוסה, להכין פתרון חיתוך על-ידי הוספת 1 מ מ של חומצה kynurenic.
  2. לפני עם פרוסות, להכין ערכת לנתיחה המכיל מספריים כירורגיים, מספריים איריס בסדר, שפכטלים שני, מלקחיים, דיסק של מסנן נייר, דבק מגע, דבק.
  3. להשתמש בפתרון חיתוך כקרח רווי O2/CO2 (95% / 5%) וקריר למטה לחדר חיתוך ב-20 ° C.
  4. עזים ומתנגד העכבר עם מגבת נייר קטן ספוגה איזופלוריין. לאחר ~ 2 דק ', ודא כי העכבר נמצא תחת הרדמה עמוקה על-ידי אימות היעדר תגובה ל כף של קורט.
  5. במהירות לערוף את העכבר. הסר את הקרקפת, לפתוח את הגולגולת. תמצית המוח בזהירות ומניחים אותו לתוך חבית קטנה מלאה קר כקרח (~ 4 ° C) חיתוך פתרון חמצן ב- O-2-/CO-2.
  6. להסיר את התא חיתוך מ-20 ° C תנאים ולהסיר לחות עם מגבת נייר.
  7. בזהירות לנתח את המוח כדי לבודד את האזור של הריבית, להדביק את זה. על תא חיתוך ולהוסיף פתרון חיתוך כקרח חמצן ב- O-2-/CO-2.
  8. לחתוך 300 מיקרומטר עבים פרוסות משתמש של vibratome. להעביר אותם בטמפרטורת החדר בחדר המנוחה מלא עם חיתוך מחומצן פתרון ולאפשר להם להתאושש במשך לפחות 0.5 h.

7. ותא RT-PCR לאחר תיקון-קלאמפ הקלטה

  1. לנקות את המערכת זלוף באופן קבוע עם ~ 100 מ"ל של 30% H2O2 פתרון ולשטוף בהרחבה עם ~ 500 מ ל מים מזוקקים כדי למנוע גידול חיידקים, כפי שהוא מקור תסולא בפז RNase זיהום.
  2. Chlorinate חוט הלהט עם פיפטה תיקון מלא עם אקונומיקה מרוכזת כל יום האיסוף. אל תשתמש micropipette כדי למלא את פיפטה תיקון אבל מעדיף 20 µL ארוך, בסדר, גמיש טיפ מצורף מזרק 1 מ"ל. לאחר מכן, לשטוף אותו בהרחבה עם מים חינם RNase, לייבש אותו עם מטלית גז.
  3. הכנת קופסה קטנה של קרח המכילה 5 x RT-מיקס, 20 x DTT aliquots. אחסן aliquots מעכב את RTase ואת RNase ב-20 ° C benchtop קריר יותר.
  4. העברת פרוסה לתוך החדר הקלטה perfused ב 1-2 מ ל/דקה עם חנה המבר מחומצן.
  5. משוך תיקון מכשור ניסוי ברטט (1 – 2 מיקרומטר פתח בקוטר עצה, MΩ 3-5) מ זכוכית בורוסיליקט בעת לבישת כפפות, למלא אחד מהם 8 μL של הפתרון הפנימי. זכור כי בידית של פולר פיפטה מהווים מקור לזיהום RNase.
  6. למקם את פיפטה המחזיק פיפטה תוך כדי לבש כפפות חדש, לא נוגע הלהט עם האצבעות.
  7. הגישה של פיפטה תיקון עם לחץ חיובי ולבצע הקלטה תאים שלמים כדי לאפיין את התא יישוב (איור 4).
  8. על מנת לשמר את mRNAs, להגביל את משך הזמן בתצורת כל-תא ל- 20 דקות41.
  9. בסוף ההקלטה, הכן צינור PCR 500 µL מלא עם 2 µL של 5 x מיקס RT ו- 0.5 µL של 20 x DTT, לסובב אותו, ואחסן אותו בקרח.
  10. הקציר הציטופלסמה תא על-ידי החלת לחץ שלילי עדין (איור 4). מבחינה ויזואלית שליטה שמגיע בתוך פיפטה תוכנו של התא תוך שמירה על חותם צר.
    1. להימנע ככל האפשר איסוף הגרעין אם כמה גנים אינטרון-פחות נחשבים. במקרה כזה יש לכלול תמיד ערכה של תחל מכוון הגברה gDNA כדי לחקור זיהום גנומית.
    2. הגרעין בא קרוב לקצה פיפטה, לשחרר את הלחץ השלילי ולהעביר את פיפטה הרחק מהגרעין. להבטיח כי החותם חזק נשמר והפעל מחדש כדי לאסוף את הציטופלסמה במקום פיפטה החדש.
  11. תפסיקי לגזום את כאשר אין עוד חומר מגיע ו/או לפני איבוד החותם חזק.
  12. למשוך את פיפטה בעדינות כדי ליצור תיקון בחוץ-אאוט כדי להגביל זיהום על-ידי ההריסות חוץ-תאית (איור 4) וכדי טובה הסגר על קרום התא לניתוח פתולוגיה עוקבות.
  13. זכור את ידיות, micromanipulators, מקלדת מחשב, או עכבר המחשב הם מקורות RNase זיהום פוטנציאליים. אם הם היו נגע במהלך ההקלטה, לשנות כפפות.
  14. לצרף את פיפטה expeller ולגרש את תוכנו לתוך הצינור PCR על-ידי החלת בלחץ חיובי (איור 1).
  15. לפרוץ את קצה פיפטה הצינור PCR כדי לעזור את האוסף של התוכן שלה.
  16. בקצרה centrifuge ברכבת התחתית להוסיף 0.5 µL של מעכב RNase ו 0.5 µL של RTase, מערבבים בעדינות, צנטריפוגה שוב, דגירה בין לילה ב 37 º C.
  17. לסובב את הצינור ואחסן אותו ב-80 מעלות צלזיוס במשך אפילו מספר חודשים עד ניתוח ה-PCR.
  18. ביצוע השלב הראשון הגברה ישירות הצינור המכיל את µL ~ 10 של RT מוצרים על-ידי הוספת מים (q.s., 80 µL), µL 10 x 10 המאגר, 0.5 µL (2.5 U) של אנזימים. לאחר מכן, בצע את ההוראות המתוארות שלבים 4.8.2–4.8.8.

8. פתולוגיה מכתים של התא מוקלטות (אופציונלי)

  1. בעקבות ההקלטות אלקטרופיזיולוגיות, לשמור על הפרוסה למשך 20 דקות בחנה המבר מחומצן כדי לאפשר פעפוע של biocytin בעץ עצב ו דנדריטים.
  2. מניחים הפרוסה בבאר של צלחת 24-ובכן ו תיקון זה לינה ב 4 ° C עם 1 מ"ל של 4% paraformaldehyde 0.1 M מאגר פוספט.
  3. לשטוף את הפרוסות 4 פעמים, 5 דקות כל אחד, עם 1 מ ל תמיסת מלח Buffered פוספט (PBS).
  4. באותו, permeabilize וירווה את הפרוסה במהלך h 1 בטמפרטורת החדר עם 1 מ"ל של PBS בתוספת 0.25% טריטון ג'לטין X-100 ו- 0.2% מן העור דגים מים קרים (PBS-GT).
  5. דגירה בין לילה עם אבידין fluorescently שכותרתו מדולל ב- 1/400 ב- 250-500 µL של PBS-GT.
  6. לשטוף 5 פעמים, 5 דקות כל אחד, עם 1 מ"ל של PBS והר הפרוסות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אימות נציג של מולטיפלקס RT-PCR מוצג באיור3. הפרוטוקול תוכנן כדי לחקור בו זמנית את הביטוי של גנים שונים 12. VGluT1 טרנספורטר גלוטמט vesicular נלקח בתור פקד חיובי עבור הנוירונים glutamatergic42. גאבא סינתזה אנזימים (GAD65 ו- 67 גד), Neuropeptide Y (NPY) ו Somatostatin (סום) שימשו כסמנים של GABAergic interneurons3,5,11. האנזים cyclooxygenase-2 (C...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יחיד תא מולטיפלקס RT-PCR לאחר תיקון-קלאמפ יכול בו זמנית ובאמינות לחקור את הביטוי של גנים יותר מ-30 תאים מזוהה electrophysiologically5. ניתוח ביטוי גנים ברמת תא בודד דורש תחל PCR יעילים ביותר. אחד הצעדים המגביל ביותר הוא אוסף של תוכנו של התא. היעילות שלה תלוי הקוטר של קצה פיפטה תיקון, אשר חייב להיות גדול ככל האפשר תוך התאמת גודל התא. מדי סוכר עם 1-2 מיקרומטר עצה פתוחה קוטר הוכח להיות מתאים עבור סוגי ביותר עצביים. זה גם חיוני כדי לוודא כי רק את התוכן הסלולר נאסף, ואת לא הרקמה שמסביב. זו מושגת על ידי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים ד ר אלכסנדר Mourot על דבריו על כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים סוכנות הידיעות נאסיונאל דה לה רשרש (ANR 2011 MALZ 003 01; ANR-15-CE16-0010 ו- ANR-17-CE37-0010-03), בניין נתמך על-ידי אחוות מ Fondation pour la רשרש סור אלצהיימר. אנו מודים את המתקן בעלי חיים IBPS (פריז, צרפת).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
MACAW v.2.0.5NCBIיישור מרובה לעיצוב פריימר
DithiothreitolVWR443852A
RT פריימרים אקראייםSigma-Aldrich (Merck)11034731001RT
dNTPsGE Healthcare Life Sciences28-4065-52RT ו-PCR
מעכבי RNasin RibonucleasePromegaN2511RT
SuperScript II Reverse TranscriptaseInvitrogen18064014RT
Taq DNA פולימראזQiagen201205PCR
שמן מינרליסיגמא-אולדריץ' (Merck)M5904-5MLPCR
PCR פריימריםסיגמא-אולדריץ' (Merck)PCR / מותפל ומדולל ב-200 ומיקרו; צינורות M
, 0.5 מ"ל, מכסה שטוחסדרות ThermoFisher ScientificAB0350RT ו-PCR
BT10 - 10 ומיקרו; L קצה מסנןNeptune ScientificBT10RT ו-PCR
BT20 סדרות - 20 ומיקרו; L קצה מסנןNeptune ScientificBT20RT ו-PCR
BT200 סדרות - 200 ומיקרו; L קצה מסנןNeptune ScientificBT200RT ו-PCR
BT1000 סדרות - 1000 ומיקרו; L קצה מסנןנפטון סיינטיפיקBT1000.96RT ו-PCR
DNA צילצר תרמיפרקין אלמר CetusPCR
אתידיום ברומידסיגמא-אולדריץ' (Merck)E1510-10MLאלקטרופורזה של ג'ל אגרוז
Tris-Borate-EDTA מאגרסיגמא-אולדריץ' (Merck)T4415-1Lאלקטרופורזה של ג'ל אגרוז
UltraPure AgaroseLife Technologies16500-500אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז
Φ X174 DNA-Hae III DigestNEB (New England BioLabs)N3026Sאלקטרופורזה של ג'ל אגרוז
EDA 290אלקטרופורזה של ג'לקודאק
אלקטרופורזה ספק כוח EPS 3500Pharmacia BiotechAgarose gel אלקטרופורזה
אלקרופורה אופקית Midi דגם SHU13סיגמא-אולדריץ' (Merck)אלקטרופורזה
של ג'ל אגרוזנייר חלק עם מראה סאטןפישרברנד1748Bתמיסה פנימית מהדק תיקון
אשלגן הידרוקסידסיגמא-אולדריץ' (Merck)60377תמיסה פנימית מהדק תיקון
אתילן גליקול-ביס(2-אמינואתילאתר)-N,N,N&פריים;,N′-חומצה טטראצטיתסיגמא-אולדריץ' (Merck)E3889מהדק תיקון תמיסה פנימית
HEPESSigma-Aldrich (Merck)H4034מהדק תיקון תמיסה פנימית
אשלגן D-גלוקונאטסיגמא-אולדריץ' (Merck)G4500מהדק תיקון תמיסה פנימית
תמיסת מגנזיום כלורידסיגמא-אולדריץ' (Merck)M1028מהדק תיקון תמיסה פנימית
5500 מד אוסמומטר לחץאדים WescorPatch clamp תמיסה פנימית
ביוציטיןסיגמא-אולדריץ' (Merck)B4261מהדק תיקון תמיסה פנימית
סוכרוזסיגמא-אולדריץ' (Merck)S5016הכנת פרוסות
D-(+)-גלוקוז מונוהידראטסיגמא-אולדריץ' (Merck)49159הכנת פרוסה
נתרן כלוריסיגמא-אולדריץ' (Merck)S6191הכנת פרוסה
אשלגן כלוריסיגמא-אולדריץ' (Merck)60128הכנת פרוסה
נתרן ביקרבונטסיגמא-אולדריץ' (Merck)31437-Mהכנת פרוסה
נתרן פוספט מונו-בסיסיסיגמא-אולדריץ' (Merck)S5011הכנת פרוסה
תמיסת מגנזיום כלורידסיגמא-אולדריץ' (Merck)63069הכנת פרוסה
תמיסת סיגמא-אולדריץ(Merck)21115הכנת
חומצה קינורניתסיגמא-אולדריץ' (Merck)K3375הכנת פרוסות
IsofluranePiramal Healthcare בריטניההכנת פרוסות
VT 1000SLeica Biosystems14047235613הכנת פרוסות
תמיסת מי חמצןסיגמא-אולדריץ' (Merck)H1009ניקוי הגדרת מהדק תיקון
נימי זכוכית דקים עם נימהWorld Precision InstrumentsTW150F-4Patch Clamp
PP-83NarishigePatch Clamp
Eppendorf MicroloaderEppendorf5242956003Patch Clamp
BX51WI מיקרוסקופ זקוףאולימפוסתיקון מהדק
XC-ST70 / CE CCD B / W מצלמת וידאוSonyPatch Clamp
Axopatch 200B מגברMolecular DevicesPatch Clamp
Digidata 1440MolecularDevices Patch Clamp
pCLAMP 10 חבילת תוכנהMolecular DevicesPatch Clamp
10 מ"ל מזרקTerumoSS-10ESExpelling
E Series עם גוף ישר (מחזיק)Phymep64-0997הוצאת
נתרן פוספט דו-בסיסיסיגמא-אולדריץ' (Merck)S7907גילוי היסטוכימי
נתרן פוספט מונו-בסיסיסיגמא-אולדריץ' (Merck)S8282גילוי היסטוכימי
פרפורמלדהידסיגמא-אולדריץ' (Merck)P6148גילוי היסטוכימי
טריטון X-100סיגמא-אולדריץ' (Merck)X100גילוי היסטוכימי
ג'לטין מעור דגימים קריםסיגמא-אולדריץ' (Merck)G7041גילוי היסטוכימי
סטרפטווידין, Alexa Fluor 488 מצומדThermoFisher ScientificS11223גילוי היסטוכימי
24 בארותצלחת Greiner Bio-One662160גילוי היסטוכימי
אגרוז יחידת ' פרוסה

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ascoli, G. A., et al. Petilla terminology: nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex. Nat.Rev.Neurosci. 9 (7), 557-568 (2008).
  2. DeFelipe, J., et al. New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons. Nat.Rev.Neurosci. , (2013).
  3. Tasic, B., et al. Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics. Nat.Neurosci. , (2016).
  4. Zeisel, A., et al. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq. Science. , (2015).
  5. Cauli, B., et al. Classification of fusiform neocortical interneurons based on unsupervised clustering. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 97 (11), 6144-6149 (2000).
  6. Cauli, B., et al. Molecular and physiological diversity of cortical nonpyramidal cells. J.Neurosci. 17 (10), 3894-3906 (1997).
  7. Férézou, I., et al. 5-HT3 receptors mediate serotonergic fast synaptic excitation of neocortical vasoactive intestinal peptide/cholecystokinin interneurons. J. Neurosci. 22 (17), 7389-7397 (2002).
  8. Cauli, B., et al. Cortical GABA interneurons in neurovascular coupling: relays for subcortical vasoactive pathways. J.Neurosci. 24 (41), 8940-8949 (2004).
  9. Wang, Y., Gupta, A., Toledo-Rodriguez, M., Wu, C. Z., Markram, H. Anatomical, physiological, molecular and circuit properties of nest basket cells in the developing somatosensory cortex. Cereb.Cortex. 12 (4), 395-410 (2002).
  10. Wang, Y., et al. Anatomical, physiological and molecular properties of Martinotti cells in the somatosensory cortex of the juvenile rat. J.Physiol. 561 (Pt 1), 65-90 (2004).
  11. Karagiannis, A., et al. Classification of NPY-expressing neocortical interneurons. J.Neurosci. 29 (11), 3642-3659 (2009).
  12. Battaglia, D., Karagiannis, A., Gallopin, T., Gutch, H. W., Cauli, B. Beyond the frontiers of neuronal types. Front Neural Circuits. 7, 13(2013).
  13. Toledo-Rodriguez, M., et al. Correlation maps allow neuronal electrical properties to be predicted from single-cell gene expression profiles in rat neocortex. Cereb.Cortex. 14 (12), 1310-1327 (2004).
  14. Toledo-Rodriguez, M., Goodman, P., Illic, M., Wu, C., Markram, H. Neuropeptide and calcium binding protein gene expression profiles predict neuronal anatomical type in the juvenile rat. J.Physiol. , (2005).
  15. Lecrux, C., et al. Pyramidal neurons are "neurogenic hubs" in the neurovascular coupling response to whisker stimulation. J.Neurosci. 31 (27), 9836-9847 (2011).
  16. Lacroix, A., et al. COX-2-derived prostaglandin E2 produced by pyramidal neurons contributes to neurovascular coupling in the rodent cerebral cortex. J.Neurosci. 35 (34), 11791-11810 (2015).
  17. Matthias, K., et al. Segregated expression of AMPA-type glutamate receptors and glutamate transporters defines distinct astrocyte populations in the mouse hippocampus. J.Neurosci. 23 (5), 1750-1758 (2003).
  18. Rancillac, A., et al. Glutamatergic control of microvascular tone by distinct gaba neurons in the cerebellum. J.Neurosci. 26 (26), 6997-7006 (2006).
  19. Miki, T., et al. ATP-sensitive K+ channels in the hypothalamus are essential for the maintenance of glucose homeostasis. Nat.Neurosci. 4 (5), 507-512 (2001).
  20. Liss, B., Bruns, R., Roeper, J. Alternative sulfonylurea receptor expression defines metabolic sensitivity of K-ATP channels in dopaminergic midbrain neurons. EMBO J. 18 (4), 833-846 (1999).
  21. Gallopin, T., et al. Identification of sleep-promoting neurons in vitro. Nature. 404 (6781), 992-995 (2000).
  22. Gallopin, T., et al. The endogenous somnogen adenosine excites a subset of sleep-promoting neurons via A2A receptors in the ventrolateral preoptic nucleus. Neuroscience. 134 (4), 1377-1390 (2005).
  23. Fernandez, S. P., et al. Multiscale single-cell analysis reveals unique phenotypes of raphe 5-HT neurons projecting to the forebrain. Brain Struct.Funct. , (2015).
  24. Porter, J. T., et al. Selective excitation of subtypes of neocortical interneurons by nicotinic receptors. J.Neurosci. 19 (13), 5228-5235 (1999).
  25. Hill, E. L., et al. Functional CB1 receptors are broadly expressed in neocortical GABAergic and glutamatergic neurons. J.Neurophysiol. 97 (4), 2580-2589 (2007).
  26. Férézou, I., et al. Extensive overlap of mu-opioid and nicotinic sensitivity in cortical interneurons. Cereb.Cortex. 17 (8), 1948-1957 (2007).
  27. Hu, E., et al. PACAP act at distinct receptors to elicit different cAMP/PKA dynamics in the neocortex. Cereb.Cortex. 21 (3), 708-718 (2011).
  28. Louessard, M., et al. Tissue plasminogen activator expression is restricted to subsets of excitatory pyramidal glutamatergic neurons. Mol.Neurobiol. , (2015).
  29. Stuart, G. J., Dodt, H. U., Sakmann, B. Patch-clamp recordings from the soma and dendrites of neurons in brain slices using infrared video microscopy. Pflugers Arch. 423 (5-6), 511-518 (1993).
  30. Cadwell, C. R., et al. Electrophysiological, transcriptomic and morphologic profiling of single neurons using Patch-seq. Nat.Biotechnol. 34 (2), 199-203 (2016).
  31. Fuzik, J., et al. Integration of electrophysiological recordings with single-cell RNA-seq data identifies neuronal subtypes. Nat.Biotechnol. 34 (2), 175-183 (2016).
  32. O'Leary, N. A., et al. Reference sequence (RefSeq) database at NCBI: current status, taxonomic expansion, and functional annotation. Nucleic Acids Res. 44, D733-D745 (2016).
  33. Schuler, G. D., Altschul, S. F., Lipman, D. J. A workbench for multiple alignment construction and analysis. Proteins. 9 (3), 180-190 (1991).
  34. Ruano, D., Lambolez, B., Rossier, J., Paternain, A. V., Lerma, J. Kainate receptor subunits expressed in single cultured hippocampal neurons: molecular and functional variants by RNA editing. Neuron. 14 (5), 1009-1017 (1995).
  35. Porter, J. T., et al. Properties of bipolar VIPergic interneurons and their excitation by pyramidal neurons in the rat neocortex. Eur.J.Neurosci. 10 (12), 3617-3628 (1998).
  36. Ruano, D., Perrais, D., Rossier, J., Ropert, N. Expression of GABA(A) receptor subunit mRNAs by layer V pyramidal cells of the rat primary visual cortex. Eur.J.Neurosci. 9 (4), 857-862 (1997).
  37. Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. Basic local alignment search tool. J.Mol.Biol. 215 (3), 403-410 (1990).
  38. Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate- phenol-chloroform extraction. Anal Biochem. 162 (1), 156-159 (1987).
  39. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J.Vis.Exp. (62), (2012).
  40. Liss, B., et al. K-ATP channels promote the differential degeneration of dopaminergic midbrain neurons. Nat.Neurosci. 8 (12), 1742-1751 (2005).
  41. Lambolez, B., Audinat, E., Bochet, P., Crepel, F., Rossier, J. AMPA receptor subunits expressed by single Purkinje cells. Neuron. 9 (2), 247-258 (1992).
  42. Gallopin, T., Geoffroy, H., Rossier, J., Lambolez, B. Cortical sources of CRF, NKB, and CCK and their effects on pyramidal cells in the neocortex. Cereb.Cortex. 16 (10), 1440-1452 (2006).
  43. Cunningham, M. O., et al. Neuronal metabolism governs cortical network response state. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 103 (14), 5597-5601 (2006).
  44. Tsuzuki, K., Lambolez, B., Rossier, J., Ozawa, S. Absolute quantification of AMPA receptor subunit mRNAs in single hippocampal neurons. J.Neurochem. 77 (6), 1650-1659 (2001).
  45. McCormick, D. A., Connors, B. W., Lighthall, J. W., Prince, D. A. Comparative electrophysiology of pyramidal and sparsely spiny stellate neurons of the neocortex. Journal of Neurophysiology. 54 (4), 782-806 (1985).
  46. Andjelic, S., et al. Glutamatergic nonpyramidal neurons from neocortical layer VI and their comparison with pyramidal and spiny stellate neurons. J.Neurophysiol. 101 (2), 641-654 (2009).
  47. Cauli, B., Lambolez, B. Chapter 9: Gene Analysis of Single Cells. Unravelling Single Cell Genomics: Micro and Nanotools. Bontoux, N., Potier, M. C. , RSC publishing. Cambridge. 81-92 (2010).
  48. Bontoux, N., et al. Integrating whole transcriptome assays on a lab-on-a-chip for single cell gene profiling. Lab Chip. 8 (3), 443-450 (2008).
  49. Sellner, L. N., Coelen, R. J., Mackenzie, J. S. Reverse transcriptase inhibits Taq polymerase activity. Nucleic Acids Res. 20 (7), 1487-1490 (1992).
  50. Perrenoud, Q., Rossier, J., Geoffroy, H., Vitalis, T., Gallopin, T. Diversity of GABAergic interneurons in layer VIa and VIb of mouse barrel cortex. Cereb.Cortex. , (2012).
  51. Tricoire, L., et al. Common origins of hippocampal ivy and nitric oxide synthase expressing neurogliaform cells. J.Neurosci. 30 (6), 2165-2176 (2010).
  52. Cea-del Rio, C. A., et al. M3 muscarinic acetylcholine receptor expression confers differential cholinergic modulation to neurochemically distinct hippocampal basket cell subtypes. J.Neurosci. 30 (17), 6011-6024 (2010).
  53. Tricoire, L., et al. A blueprint for the spatiotemporal origins of mouse hippocampal interneuron diversity. J.Neurosci. 31 (30), 10948-10970 (2011).
  54. Franz, O., Liss, B., Neu, A., Roeper, J. Single-cell mRNA expression of HCN1 correlates with a fast gating phenotype of hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated ion channels (Ih) in central neurons. Eur.J.Neurosci. 12 (8), 2685-2693 (2000).
  55. Szabo, A., et al. Calcium-permeable AMPA receptors provide a common mechanism for LTP in glutamatergic synapses of distinct hippocampal interneuron types. J.Neurosci. 32 (19), 6511-6516 (2012).
  56. Hodne, K., Weltzien, F. A. Single-Cell Isolation and Gene Analysis: Pitfalls and Possibilities. Int.J.Mol.Sci. 16 (11), 26832-26849 (2015).
  57. Li, H. H., et al. Amplification and analysis of DNA sequences in single human sperm and diploid cells. Nature. 335 (6189), 414-417 (1988).
  58. Bochet, P., et al. Subunit composition at the single-cell level explains functional properties of a glutamate-gated channel. Neuron. 12 (2), 383-388 (1994).
  59. Audinat, E., Lambolez, B., Rossier, J., Crepel, F. Activity-dependent regulation of N-methyl-D-aspartate receptor subunit expression in rat cerebellar granule cells. Eur.J.Neurosci. 6 (12), 1792-1800 (1994).
  60. Jonas, P., Racca, C., Sakmann, B., Seeburg, P. H., Monyer, H. Differences in Ca2+ permeability of AMPA-type glutamate receptor channels in neocortical neurons caused by differential GluR-B subunit expression. Neuron. 12 (6), 1281-1289 (1994).
  61. Geiger, J. R., et al. Relative abundance of subunit mRNAs determines gating and Ca2+ permeability of AMPA receptors in principal neurons and interneurons in rat CNS. Neuron. 15 (1), 193-204 (1995).
  62. Flint, A. C., Maisch, U. S., Weishaupt, J. H., Kriegstein, A. R., Monyer, H. NR2A subunit expression shortens NMDA receptor synaptic currents in developing neocortex. J.Neurosci. 17 (7), 2469-2476 (1997).
  63. Angulo, M. C., Lambolez, B., Audinat, E., Hestrin, S., Rossier, J. Subunit composition, kinetic, and permeation properties of AMPA receptors in single neocortical nonpyramidal cells. J.Neurosci. 17 (17), 6685-6696 (1997).
  64. Lambolez, B., Ropert, N., Perrais, D., Rossier, J., Hestrin, S. Correlation between kinetics and RNA splicing of alpha-amino-3-hydroxy-5-methylisoxazole-4-propionic acid receptors in neocortical neurons. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 93 (5), 1797-1802 (1996).
  65. Liss, B., et al. Tuning pacemaker frequency of individual dopaminergic neurons by Kv4.3L and KChip3.1 transcription. EMBO J. 20 (20), 5715-5724 (2001).
  66. Aponte, Y., Lien, C. C., Reisinger, E., Jonas, P. Hyperpolarization-activated cation channels in fast-spiking interneurons of rat hippocampus. J.Physiol. 574, 229-243 (2006).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

RT PCRPatch clampMultiplex PCRHot Start PCR

מאמרים קשורים