פרוטוקול זה מתאר את השלבים הקריטיים של אמצעי הזהירות הנדרשים לביצוע תגובת שרשרת של פולימראז שעתוק במהופך מולטיפלקס תא בודד לאחר תיקון-קלאמפ. טכניקה זו היא שיטה פשוטה ויעילה כדי לנתח את פרופיל ביטוי של קבוצת גנים מתא יחיד מאופיין על ידי תיקון-קלאמפ הקלטות מראש.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
תגובת שרשרת של פולימראז מולטיפלקס שעתוק במהופך תא בודד לאחר תיקון-קלאמפ
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
קליפת המוח מורכב סוגי תאים רבים מפגין תכונות מורפולוגיות, הפיזיולוגית מולקולרית שונות. המגוון הסלים קל זיהוי ואפיון אחד מסוגי התאים, תנאים מוקדמים ללמוד הפונקציות הספציפיות שלהם. מאמר זה מתאר תא בודד מולטיפלקס שעתוק במהופך פולימראז תגובת שרשרת (RT-PCR) הפרוטוקול, המאפשר, לאחר תיקון-קלאמפ הקלטה לפרוסות, כדי לזהות בו זמנית את הביטוי של עשרות גנים בתא יחיד. שיטה זו פשוטה ניתן ליישם עם אפיון מורפולוגי, והוא החלים נרחב כדי לקבוע את התכונות פנוטיפי של סוגי תאים שונים ועם סביבתם הסלולר מסוים, כמו למשל בקרבת כלי דם. העיקרון של פרוטוקול זה היא כדי להקליט תא עם הטכניקה תיקון-קלאמפ, כדי לקצור ולהפוך לתמלל את התוכן cytoplasmic שלה, כדי לזהות איכותית הביטוי של ערכה מוגדרת מראש של גנים על ידי מגה-פלקס PCR. זה דורש עיצוב זהיר של PCR תחל והפתרון תיקון תאיים-קלאמפ תואמת ל- RT-PCR. כדי להבטיח תעתיק סלקטיבי ואמין זיהוי, טכניקה זו מחייבת גם הפקדים המתאימים הציטופלסמה הקטיף לצעדים הגברה. למרות אמצעי הזהירות שנדונו כאן חייב להיות במעקב בלבד, כמעט כל מעבדה אלקטרופיזיולוגיות באפשרותך להשתמש התא הבודד מולטיפלקס בטכניקת RT-PCR.
מבוא
קליפת כוללת סוגי תאים רבים המעורבים בתהליכים פיזיולוגיים שונים. זיהוי ואפיון שלהם, תנאי הכרחי להבנה של הפונקציות הספציפיות שלהם, יכולה להיות מאוד מאתגרת בהתחשב גדול מורפולוגי, הפיזיולוגית המולקולריים הרב גוניות המאפיינת את סלולרי קורטיקלית סוגים1 ,2,3,4.
תא בודד מולטיפלקס RT-PCR מבוססת על השילוב של תיקון-קלאמפ וטכניקות RT-PCR. זה יכול לחקור בו זמנית את הביטוי של גנים מוגדרים מראש יותר מ-30 תאים מזוהה electrophysiologically5 ההכללה של מכשיר מעקב עצביים ב ההקלטה פיפטה נוספת מאפשרת אפיון מורפ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל ההליכים ניסיוני באמצעות בעלי חיים היו שבוצעה על פי תקנות צרפתי (קוד כפריים R214/87 כדי R214/130), תאמו את ההנחיות האתית של האמנה הלאומית הצרפתית והן בקהילה הכלכלית האירופית (86/609/EEC) על האתיקה של ניסויים בבעלי חיים. כל הפרוטוקולים היו אושרו על ידי ועדת האתיקה צ'ארלס דרווין, נאספו צרפתית משרד חינוך ומחקר (אישור 2015 061011367540). המתקן בעלי חיים IBPS הוא מוכר על ידי הרשויות הצרפתיות (A75-05-24).
1. שיקולים ראשוניים
הערה: כדי להימנע מציג, תואם ההמלצות הבאות לפני שיחתמו תא בודד RT-PCR לאחר תיקון-קלאמפ.
- אל תשתמש פלסמידים המכיל גנים עניין במעבדה כפי שהם מקור פוטנציאלי של זיהום.
- שומרים ספסל מ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
אימות נציג של מולטיפלקס RT-PCR מוצג באיור3. הפרוטוקול תוכנן כדי לחקור בו זמנית את הביטוי של גנים שונים 12. VGluT1 טרנספורטר גלוטמט vesicular נלקח בתור פקד חיובי עבור הנוירונים glutamatergic42. גאבא סינתזה אנזימים (GAD65 ו- 67 גד), Neuropeptide Y (NPY) ו Somatostatin (סום) שימשו כסמנים של GABAergic interneurons3,5,11. האנזים cyclooxygenase-2 (C.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
יחיד תא מולטיפלקס RT-PCR לאחר תיקון-קלאמפ יכול בו זמנית ובאמינות לחקור את הביטוי של גנים יותר מ-30 תאים מזוהה electrophysiologically5. ניתוח ביטוי גנים ברמת תא בודד דורש תחל PCR יעילים ביותר. אחד הצעדים המגביל ביותר הוא אוסף של תוכנו של התא. היעילות שלה תלוי הקוטר של קצה פיפטה תיקון, אשר חייב להיות גדול ככל האפשר תוך התאמת גודל התא. מדי סוכר עם 1-2 מיקרומטר עצה פתוחה קוטר הוכח להיות מתאים עבור סוגי ביותר עצביים. זה גם חיוני כדי לוודא כי רק את התוכן הסלולר נאסף, ואת לא הרקמה שמסביב. זו מושגת על ידי.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים אין לחשוף.
תודות
אנו מודים ד ר אלכסנדר Mourot על דבריו על כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים סוכנות הידיעות נאסיונאל דה לה רשרש (ANR 2011 MALZ 003 01; ANR-15-CE16-0010 ו- ANR-17-CE37-0010-03), בניין נתמך על-ידי אחוות מ Fondation pour la רשרש סור אלצהיימר. אנו מודים את המתקן בעלי חיים IBPS (פריז, צרפת).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| MACAW v.2.0.5 | NCBI | יישור מרובה לעיצוב פריימר | |
| Dithiothreitol | VWR | 443852A | |
| RT פריימרים אקראיים | Sigma-Aldrich (Merck) | 11034731001 | RT |
| dNTPs | GE Healthcare Life Sciences | 28-4065-52 | RT ו-PCR |
| מעכבי RNasin Ribonuclease | Promega | N2511 | RT |
| SuperScript II Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18064014 | RT |
| Taq DNA פולימראז | Qiagen | 201205 | PCR |
| שמן מינרלי | סיגמא-אולדריץ' (Merck) | M5904-5ML | PCR |
| PCR פריימרים | סיגמא-אולדריץ' (Merck) | PCR / מותפל ומדולל ב-200 ומיקרו; צינורות M | |
| , 0.5 מ"ל, מכסה שטוח | סדרות ThermoFisher Scientific | AB0350 | RT ו-PCR |
| BT10 - 10 ומיקרו; L קצה מסנן | Neptune Scientific | BT10 | RT ו-PCR |
| BT20 סדרות - 20 ומיקרו; L קצה מסנן | Neptune Scientific | BT20 | RT ו-PCR |
| BT200 סדרות - 200 ומיקרו; L קצה מסנן | Neptune Scientific | BT200 | RT ו-PCR |
| BT1000 סדרות - 1000 ומיקרו; L קצה מסנן | נפטון סיינטיפיק | BT1000.96 | RT ו-PCR |
| DNA צילצר תרמי | פרקין אלמר Cetus | PCR | |
| אתידיום ברומיד | סיגמא-אולדריץ' (Merck) | E1510-10ML | אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז |
| Tris-Borate-EDTA מאגר | סיגמא-אולדריץ' (Merck) | T4415-1L | אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז |
| UltraPure Agarose | Life Technologies | 16500-500 | אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז |
| Φ X174 DNA-Hae III Digest | NEB (New England BioLabs) | N3026S | אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז |
| EDA 290 | אלקטרופורזה של ג'ל | קודאק | |
| אלקטרופורזה ספק כוח EPS 3500 | Pharmacia Biotech | Agarose gel אלקטרופורזה | |
| אלקרופורה אופקית Midi דגם SHU13 | סיגמא-אולדריץ' (Merck) | אלקטרופורזה | |
| של ג'ל אגרוזנייר חלק עם מראה סאטן | פישרברנד | 1748B | תמיסה פנימית מהדק תיקון |
| אשלגן הידרוקסיד | סיגמא-אולדריץ' (Merck) | 60377 | תמיסה פנימית מהדק תיקון |
| אתילן גליקול-ביס(2-אמינואתילאתר)-N,N,N&פריים;,N′-חומצה טטראצטית | סיגמא-אולדריץ' (Merck) | E3889 | מהדק תיקון תמיסה פנימית |
| HEPES | Sigma-Aldrich (Merck) | H4034 | מהדק תיקון תמיסה פנימית |
| אשלגן D-גלוקונאט | סיגמא-אולדריץ' (Merck) | G4500 | מהדק תיקון תמיסה פנימית |
| תמיסת מגנזיום כלוריד | סיגמא-אולדריץ' (Merck) | M1028 | מהדק תיקון תמיסה פנימית |
| 5500 מד אוסמומטר לחץ | אדים Wescor | Patch clamp תמיסה פנימית | |
| ביוציטין | סיגמא-אולדריץ' (Merck) | B4261 | מהדק תיקון תמיסה פנימית |
| סוכרוז | סיגמא-אולדריץ' (Merck) | S5016 | הכנת פרוסות |
| D-(+)-גלוקוז מונוהידראט | סיגמא-אולדריץ' (Merck) | 49159 | הכנת פרוסה |
| נתרן כלורי | סיגמא-אולדריץ' (Merck) | S6191 | הכנת פרוסה |
| אשלגן כלורי | סיגמא-אולדריץ' (Merck) | 60128 | הכנת פרוסה |
| נתרן ביקרבונט | סיגמא-אולדריץ' (Merck) | 31437-M | הכנת פרוסה |
| נתרן פוספט מונו-בסיסי | סיגמא-אולדריץ' (Merck) | S5011 | הכנת פרוסה |
| תמיסת מגנזיום כלוריד | סיגמא-אולדריץ' (Merck) | 63069 | הכנת פרוסה |
| תמיסת סיגמא-אולדריץ | (Merck) | 21115 | הכנת |
| חומצה קינורנית | סיגמא-אולדריץ' (Merck) | K3375 | הכנת פרוסות |
| Isoflurane | Piramal Healthcare בריטניה | הכנת פרוסות | |
| VT 1000S | Leica Biosystems | 14047235613 | הכנת פרוסות |
| תמיסת מי חמצן | סיגמא-אולדריץ' (Merck) | H1009 | ניקוי הגדרת מהדק תיקון |
| נימי זכוכית דקים עם נימה | World Precision Instruments | TW150F-4 | Patch Clamp |
| PP-83 | Narishige | Patch Clamp | |
| Eppendorf Microloader | Eppendorf | 5242956003 | Patch Clamp |
| BX51WI מיקרוסקופ זקוף | אולימפוס | תיקון מהדק | |
| XC-ST70 / CE CCD B / W מצלמת וידאו | Sony | Patch Clamp | |
| Axopatch 200B מגבר | Molecular Devices | Patch Clamp | |
| Digidata 1440 | Molecular | Devices Patch Clamp | |
| pCLAMP 10 חבילת תוכנה | Molecular Devices | Patch Clamp | |
| 10 מ"ל מזרק | Terumo | SS-10ES | Expelling |
| E Series עם גוף ישר (מחזיק) | Phymep | 64-0997 | הוצאת |
| נתרן פוספט דו-בסיסי | סיגמא-אולדריץ' (Merck) | S7907 | גילוי היסטוכימי |
| נתרן פוספט מונו-בסיסי | סיגמא-אולדריץ' (Merck) | S8282 | גילוי היסטוכימי |
| פרפורמלדהיד | סיגמא-אולדריץ' (Merck) | P6148 | גילוי היסטוכימי |
| טריטון X-100 | סיגמא-אולדריץ' (Merck) | X100 | גילוי היסטוכימי |
| ג'לטין מעור דגי | מים קריםסיגמא-אולדריץ' (Merck) | G7041 | גילוי היסטוכימי |
| סטרפטווידין, Alexa Fluor 488 מצומד | ThermoFisher Scientific | S11223 | גילוי היסטוכימי |
| 24 בארות | צלחת Greiner Bio-One | 662160 | גילוי היסטוכימי |
מקורות
- Ascoli, G. A., et al. Petilla terminology: nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex. Nat.Rev.Neurosci. 9 (7), 557-568 (2008).
- DeFelipe, J., et al. New insights into the class....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
