Method Article

פיתוח ואפיון פונקציונאלי של תאים דנדריטים מאתר Tolerogenic

DOI:

10.3791/57637

⸱

May 18th, 2018

 ,  , 
1Department of Biochemistry, School of Medicine, Case Western Reserve University, 2Department of Pediatrics, Division of Pediatric Hematology/Oncology, Case Western Reserve University, 3Angie Fowler Cancer Institute, Rainbow Babies & Children's Hospital, University Hospitals, Cleveland

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לפתח, איפיון תאים דנדריטים tolerogenic (TolDCs), להעריך את השירות immunotherapeutic שלהם.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מערכת החיסון פועלת על ידי שמירה על איזון הדוק בין תיאום תגובות נגד אנטיגנים זרים, שמירה על מצב שאינו מגיב נגד אנטיגנים העצמי, כמו גם אנטיגנים נגזר מאורגניזמים commensal. שיבוש הומאוסטזיס החיסון הזה יכול להוביל לדלקת כרונית להתפתחות של מחלת חיסון עצמי. תאים דנדריטים (Dc) הם תאים אנטיגן מקצועיים של מערכת החיסון המולדת הכרוכה בהפעלתו תמים T תאים ליזום תגובות מערכת החיסון כנגד אנטיגנים זרים. עם זאת, ניתן להבחין DCs גם לתוך TolDCs שפועלים כדי לשמר ולקדם את תא T סובלנות וכדי לדכא את התאים אפקטור תורמים להתפתחות של תנאים או דלקת אוטואימונית או כרונית. ההתקדמות האחרונה בהבנה שלנו של TolDCs מרמז כי DC סובלנות יכולה להיות מושגת על ידי להתכוונן מצבם בידול. תופעה זו הובילה לצמיחה אדירה בפיתוח טיפולים TolDC רבים כשל חיסוני נגרמת בשל לפרוץ סובלנות המערכת החיסונית. להצלחה בלימודים במודלים מאתר פרה מחלת חיסון עצמי יש נוספת לאמת את התועלת immunotherapeutic של TolDCs בטיפול של הפרעות אוטואימוניות. היום, TolDCs הפכו כלי immunotherapeutic מבטיח במרפאה עבור החזרתו של רגישות המערכת החיסונית בהפרעות חיסוניים שונים על ידי מיקוד תגובות אוטואימוניות פתוגניים תוך השארת חיסון הגנתי ללא פגע. למרות מגוון של אסטרטגיות הוצע על ידי מעבדות מרובים כדי לגרום TolDCs, יש אין עקביות באפיון של פנוטיפ הסלולר ופונקציונליים של תאים אלה. פרוטוקול זה מספק מדריך צעד אחר צעד להתפתחות של מח עצם-derived DCs במספרים גדולים, שיטה ייחודית המשמשת כדי להבדיל אותם לתוך TolDCs עם triterpenoid סינתטי 2-cyano-3,12-dioxooleana-1,9-dien-28-oic חומצה-difluoro-propyl-אמיד (CDDO-DFPA), של טכניקות השתמשו כדי לאשר פנוטיפ שלהם, כולל ניתוחים של חיוניות חתימות מולקולרית של TolDCs. לבסוף, אנו מראים שיטה להערכת הפונקציה TolDC על-ידי בדיקת שלהם לדיכוי המערכת החיסונית בתגובה במבחנה וב -vivo במודל של פרה של טרשת נפוצה.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאים דנדריטים (Dc) הם חלק אינטגרלי של מערכת החיסון המולדת, היו ראשית גילה, מאופיין על ידי ראלף שטיינמן, כהן Zanvil בשנת 1973 כמו הצגת אנטיגן מקצועיים ראשי תאים1. DCs הוכחו לשחק תפקיד חשוב בהפעלת מערכת החיסון על ידי הצגת אנטיגנים מעובד על תאי T ותאי B באמצעות קומפלקסים histocompatibility הגדולות (MHC) באיברים הלימפה משני כדי לקשר את מולדת ומערכות החיסון מסתגלת2. המערכת החיסונית יונקים, יש לפחות שתי קטגוריות של בקרי קבוצת מחשבים אשר תוארו מיאלואידית DCs ו- plasmacytoid בקרי קבוצת מחשבים (שיתפקדו)3. תאים מיאלואידים DCs, ידוע גם בשם DCs קונבנציונאלי (cDCs), מאופיינים על ידי הביטוי של CD11c, ניתן להבחין כמו בקרי קבוצת מחשבים (iDCs) לא בוגר חוץ גופית בתוך מח העצם ובתאים או ומונוציטים דם היקפיים באמצעות פקטור גרנולוציט-מקרופאג-המושבה-מגרה (GM-CSF) ו- IL-4 במאתר או מין אנושי, בהתאמה4.

הפעלת 'סכנה' אותות, כגון פתוגן-הקשורים לתבניות מולקולרית (PAMP) או נזק-הקשורים דפוסי מולקולרית (רטיבות), יניעו ההבשלה iDCs לכיוון immunogenic DCs בתור בוגר בקרי קבוצת מחשבים (mDCs) דרך מחייבות קולטנים שונים של זיהוי תבנית DC משטח5. Immunogenic Dc נוסף פריים התפשטות תא T נאיבי ובידול דרך קולטנים upregulation של MHCII2, ליגנדים costimulatory (CD80, CD86 ו- CD40)6, ציטוקינים מגשרים מסיסים אחרים7. מפל של המתווך הפרו דלקתיים הפקה של Dc Immunogenic חיוני עבור תא T בתיווך ציטוקין בידול. לדוגמה, IFN-γ ו- IL-12 נחוצים Th1 בידול8 ו- IL-1, IL-6, ו- IL-23 הם קריטיים עבור תמים קיטוב תא T לכיוון תאי Th179. למרות DCs בוגרת מגיבים אנטיגנים זרים, הפעלת DC לא מבוקרת על ידי העצמי-אנטיגנים עלול לגרום סובלנות אבלציה ולטפח התפתחות מחלות אוטואימוניות על ידי יצירת autoreactive T תאים אשר הפעלת מוביל הרס רקמות10 .

דיווחים אחרונים סיפקו ראיות ברורות של DC פלסטיות, ומעוררות את יכולתם לתקשר ברמזים שונים בתוך microenvironment רקמות שלהם וכדי להבדיל לערכות אפקטור ברורים/DC מדכא. המתווכים אנטי-דלקתי, כגון IL-1011, TGF-β12והו-113 הוכחו לשחק תפקיד חשוב בדיכוי המערכת החיסונית על ידי גרימת tolerogenic בקרי קבוצת מחשבים (TolDCs). TolDCs אלה לרכוש פונקציות רגולטוריות, לדכא את תא T התפשטות14. יתר על כן, העדר גירוי משותף על-ידי בקרי ואת הייצור של מגשרים אנטי דלקתיות של TolDCs לתרום אינדוקציה של הרגולציה ותאי T (Tregs) והן גם ביעילות לעכב Th1 והן Th17 בידול והתרחבות15. אחרי שני עשורים, הפוטנציאל הטיפולי של TolDCs דווח על ידי מספר חוקרים. במחקרים אלה, הממשל של לשעבר-vivo המופקים סימפטומים פתולוגיים TolDCs לא רק יושבחו במודלים פרה שונה של מחלות אוטואימוניות16 אבל גם הוביל את הפיתוח של רגישות המערכת החיסונית בחולי17 ,18. מעניין, היום הטיפול TolDCs נחשב כמו גישה חלופית או משלים עבור מחלות אוטואימוניות בניסויים קליניים מספר, כולל מסוג 1 סוכרת19, דלקת מפרקים שגרונית20, 21, טרשת נפוצה (MS)22,23,24, ו- מחלת קרוהן25.

ישנם מגוון של פרוטוקולים נועדה לפתח TolDCs, מספר מעבדות דיווחו על שיטות הדור, אפיון פנוטיפי של TolDCs. שיטות אלה ניתן לייצר reproducibly TolDCs במבחנה אבות hematopoietic, לשמור אותם על stably tolerogenic המדינה ויוו26,27,28,29. ניתן להמיר את iDCs TolDCs על ידי חשיפה שונים immunomodulatory סוכנים תרופתי או ציטוקינים אנטי דלקתיות. לדוגמה, ויטמין D3 הוא סוכן תרופתי ידוע ידוע אל להגדיל ייצור IL-10, לדכא את הפרשת IL-12 מ- Dc, ובכך להגביר את הפונקציה לדיכוי המערכת החיסונית שלהם30. יתר על כן, כאשר DCs חשופים לגירויים דלקתי חזק, כגון lipopolysaccharides (LPS), מספר סוכנים תרופתי כגון דקסמתזון31, rapamycin32קורטיקוסטרואידים33 הוכחו כדי לעודד פנוטיפ TolDC על-ידי הפחתת ביטוי משטח DC CD40, CD80, CD86 ו- MHCII34. IL-10 ו- TGF-β הן רוב: לימודי ציטוקינים אנטי דלקתיות לזירוז DC סובלנות35 , חשיפה והמצוות הן של ציטוקינים אלה הוכחו לגרום פנוטיפ tolerogenic ב Dc36.

מאז tolerogenic ש-DC מוגדרת על-ידי מאפיינים פונקציונליים ולא על ידי סמנים פנוטיפי, שם הוא נהדר צריך לפתח שיטה עקבית של אפיון הסלולר ופונקציונליים של TolDCs. יתר על כן, נוהל קפדני ועקבית יש ליצור את אפיון פנוטיפ tolerogenic DC והערכת עקבי אם אנחנו רוצים ביעילות, reproducibly להשוות את היכולת של סוכנים חדשים כדי לעודד את פנוטיפ TolDC ב מעבדה. כאן אנו מספקים פרוטוקול מפורט עם שיטות שלב אחר שלב כדי לבודד את iDCs של אבות hematopoietic של עכברים וכדי לאחר מכן לנתח את היעילות של סוכנים חדשים תחת הערכת היכולת שלהם להמיר iDCs TolDCs, מתן של חזקים אפיון פנוטיפי פונקציונלי של TolDCs גם במבחנה וגם בתוך vivo. תיאור זה כולל שיטה משוכללת כדי לאפיין את TolDCs על ידי שלהם ליגנדים משטח, ציטוקינים בפרופיל פונקציות לדיכוי המערכת החיסונית במבחנה. אנו מספקים גם דוגמה של שיטה כדי לחקור את היישום טיפולית פוטנציאל של אלה TolDCs במודל של ניסויים פרה-קליניים של MS, ניסיוני אוטואימוניות דלקת המוח וחוט השדרה (EAE). פרוטוקול הוקמה זה יסייע החוקרים להעריך את היכולת של סוכנים חדשים כדי לקדם את אינדוקציה של TolDCs, יקל על המאמץ להרחיב את היקף הפיתוח טיפוליות TolDC.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל מחקרים בוצעו בהתאם הליכים שאושרו על-ידי את Case Western Reserve הספר לרפואה של אוניברסיטת של אכפת לי חיה המוסדית והוועדה שימוש.

1. מכינים תאים דנדריטים הנגזרות מח העצם (BMDCs)

  1. לעקר את כל מכשירי הניתוח באמצעות autoclaving, לבצע את הניסוי ב- class II בטיחות ביולוגית ארון עם נהלי בטיחות הופקעו.
  2. המתת חסד C57BL/6 עכברים בגיל 8-10 שבועות באמצעות CO2 קאמרית. הנח את העכבר על לוח ויבתר ולשטוף עם 70% אתנול. לסלק עצמות השוקה-שוקית, עצם הירך באמצעות מספריים כירורגיים ולמקם אותם עם 70% אתנול בצלחת תרבות 10 ס מ.
  3. השתמש להבים כירורגי, מלקחיים לנתח רקמות משם ככל האפשר על המכסה של 10 ס מ תרבות מאכל ובידוד tibias ועצמות ירך כדי למקם אותם עם 70% אתנול בצלחת תרבות 6 ס מ.
  4. השתמש להבים כירורגי כדי לקצץ בשני הקצוות של tibias ועצמות ירך. השתמש 3 מ"ל PBS במזרק 3 מ עם מחט 23 גרם לרוקן את התוכן של מח מקצה אחד של עצמות כדי צינור חרוטי המכיל 12 ml PBS. חזור על שלב 3 x בכל קצה של עצמות.
  5. Centrifuge התליה תא ב g x 300 במשך 5 דקות.
  6. הסר את תגובת שיקוע ולאחר resuspend בגדר תא עם 1 מ"ל ACK מאגר lysing במשך 5 דקות להסיר תאי דם אדומים.
  7. להוסיף 9 מ ל PBS לדלל מאגר lysing ACK, צנטריפוגה ב 300 x g במשך 5 דקות.
  8. הסר את תגובת שיקוע ולאחר resuspend בינונית תרבות 10 מ"ל (RPMI-1640 פלוס -גלוטמין, 10% FBS, חומצת אמינו שאינן הכרחיות 1% (100 x), 10 מ מ HEPES, 50 ננומטר β-mercaptoethanol ו- 5% פניצילין/סטרפטומיצין).
    הערה: רמת אנדוטוקסין חייב להיות פחות מ 0.1 האיחוד האירופי/מ ל FBS.
  9. לעבור התליה תא דרך מסננת תא 40 μm לקחת 20 µl תא השעיה, לערבב עם µl 80 של trypan כחול כדי לספור את מספר תאים חיים על-ידי שימוש cytometer.
  10. התאם מספר תאים לעונה 1 פרק 106 תאים למ"ל ng/ml 15 GM-CSF, 10 ננוגרם למ"ל IL-4.
  11. צלחת 3 מ"ל של עונה 1 פרק 106 תאים למ"ל בבאר בכל צלחת 6-ובכן, דגירה התאים ב- 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2ו- 95% הלחות בחממה2 CO.
    הערה: תאי מח העצם של עכבר אחד הוא סביב 3-5 x 107 תאים, המציין כי זה יכול להיות ממוקם 2 כדי 3 צלחות 6-. טוב.
  12. ביום 3, הסר כל 3 מ ל תרבות בינוני מכל קידוח, להוסיף PBS טריים 2 מ"ל כל היטב, ואז בעדינות מערבולת את הצלחת כדי להבטיח הסרת כל התאים שאינם מחסידי.
  13. החלף בינוני תרבות טריים 3 מ ל 15 ננוגרם למ"ל GM-CSF ו 10 ננוגרם למ"ל IL-4 כל היטב. דגירה התאים ב- 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2ו- 95% הלחות בחממה2 CO.
  14. יום 5, ישירות להוסיף עוד 3 מ"ל טריים תרבות בינוני עם 15 ננוגרם למ"ל GM-CSF ו 10 ננוגרם למ"ל IL-4 מכל קידוח. דגירה התאים ב- 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2, ו- 95% הלחות בחממה2 CO.
    הערה: הנפח הכולל כל היטב זה עכשיו 6 מ.
  15. יום 7, לשים את הצלחת על קרח במשך 10 דקות. בעדינות pipette המדיום תרבות בבאר כל מכך באופן רופף-כנצרות BMDCs כמו iDCs לתוך ההשעיה.
    הערה: המקרופאגים חסיד עדיין מחוברים לצלחת. טמפרטורה נמוכה ובעדינות ההליכים הם המפתח כדי למנוע DC הפעלה להשפיע עוד ניסויים.
  16. Centrifuge התליה תא ב g x 300 במשך 5 דקות, resuspend טריים בינונית תרבות לניסויים נוספים.
    הערה: BMDCs יכול להיות מזוהה עם התווית על-ידי קרינה פלואורסצנטית נוגדן CD11c על ידי cytometry זרימה, הראנו את האסטרטגיה שלנו חסימה של BMDCs לניסויים נוספים באיור1.

2. איפיון TolDC ג'ין ופרופיל חלבון

  1. צלחת ml 2 של עונה 1 פרק 106 BMDCs/ml לכל באר היטב 6-צלחת עם תרבות במדיום נוכחות או היעדרות של 100-400 nM CDDO-DFPA עבור המקננת h 1-37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 ו- 95% הלחות בחממה2 CO.
    הערה: CDDO-DFPA, triterpenoid סינתטי, מהווה גורם גרעיני (נגזר erythroid 2) - כמו - 2 פקטור (Nrf2) משרן והמעכב הפקטור הגרעיני-κB (NF-κB). להחיל סוכנים אחרים עבור אינדוקציה של TolDCs מתוך iDCs, כגון IL-10, ויטמין D3, דקסמתזון או מפרץ 11-7085, ולשנות את שלב זה כדי תנאי האופטימלי עבור כל סוכן.
  2. להוסיף 10 או 100 ננוגרם למ"ל של LPS עבור המקננת 4-24 שעות כדי לגרום mDCs (זמן הדגירה היא שונה בשל מדידה mRNA או חלבון).
  3. בעדינות pipette המדיום תרבות בבאר כל ולקצור התליה תא באמצעות פיפטה 1 מ"ל. צנטריפוגה-300 גרם x עבור 5 דקות לאסוף את התאים ואת תגובת שיקוע, בהתאמה.
  4. לנתח את ליגנדים משטח של כדורי תא ידי cytometry זרימה, כגון ליגנדים מופחתים: CD40, CD80, CD86, MHC-II, OX40L, ICOSL או מעכבות ליגנדים: PD-L1, PD-L2, ILT3, ILT4.
  5. לבודד את הרנ א מ כדורי תא ולנתח את ה-RNA ודוגמאות supernatant עבור ציטוקין פרופיל, גנים וחלבונים הרמות על ידי PCR כמותי בזמן אמת (לרביעיית-PCR) ואליסה, בהתאמה.
    הערה: לדוגמה, ציטוקינים דלקתיים: TNF-α, IFNγ, ציטוקינים EDN-1, IL-6, IL-12, ו- IL-23 או אנטי דלקתיות: IL-4, IL-10, IL-15, TGF-β1, הו-1.

3. להעריך את תפקוד TolDCs במבחנה , In Vivo

  1. תא T התפשטות Syngeneic Assay
    1. לעקר את כל מכשירי הניתוח באמצעות autoclaving, לבצע את הניסוי ב- class II בטיחות ביולוגית ארון עם נהלי בטיחות הופקעו.
    2. להכין מאגר MACS באמצעות 0.5% אלבומין שור (BSA) ו- 2 מ מ EDTA 500 מ"ל PBS. לעקר את המאגר על-ידי סינון דרך מסנן 0.2 µm.
      הערה: לשמור על המאגר על הקרח במהלך הניסוי הבא.
    3. כדי להשיג CD4+ T תאים, המתת חסד OT-II T-cell קולטן (TCR) העכברים הטרנסגניים בגיל 8-10 שבועות באמצעות CO2 קאמרית. הנח את העכבר על לוח ויבתר ולשטוף עם 70% אתנול. לבודד את הטחול מהצד השמאלי של הבטן באמצעות מספריים כירורגיים וחדים.
    4. הכניסו את הטחול עם 2 מ"ל PBS לצלחת תרבות 6 ס מ ולהשתמש האחורי של דחיפה-מקל של מזרק 3 מ"ל מינצ הטחול על-ידי העברת מסננת תא 40 μm.
    5. לאסוף את ההשעיה תא צנטריפוגה ב 300 x g במשך 5 דקות.
    6. Resuspend בגדר תא ב- 400 μl מאגר מקינטוש.
    7. להוסיף 100 μl של CD4+ תא T ביוטין-נוגדן קוקטייל ב 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות.
      הערה: קוקטייל הנוגדן נקשר על סוגי תאים אחרים מלבד CD4+ T תאים, כגון CD8a, CD11b, CD11c, CD19, CD25, CD45R (B220), CD49b (DX5), CD105, אנטי-MHC class II, טר-119, TCRγ/אלפא.
    8. הוסף μl 300 MACS מאגר μl 200 של חרוזים אנטי ביוטין (טבלה של חומרים) ב 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
    9. מקום חיבר העמודה של הספירות פרומגנטי (טבלה של חומרים) ומסנן הכנה להפרדות צבע ביחד על המגנטי שדה, לשטוף אותו עם 3 מ"ל של מאגר מקינטוש.
    10. מוסיפים 9 מ של מקינטוש מאגר התאים ואת צנטריפוגה ב 300 x g במשך 5 דקות.
    11. Resuspend בגדר תא ב- 3 מ"ל של מאגר MACS, החל על העמודה. לאסוף זרימה דרך CD4 המכיל+ T תאים.
    12. לשטוף את העמודה עם עוד 3 מ"ל של מקינטוש מאגר ולאסוף גם את הזרימה דרך.
    13. כדי להשיג DCs פאן הטחול, המתת חסד C57BL/6 עכברים בגיל 8-10 שבועות באמצעות CO2 קאמרית. הנח את העכבר על לוח ויבתר ולשטוף עם 70% אתנול. לבודד את הטחול מהצד השמאלי של הבטן באמצעות מספריים כירורגיים וחדים. הכניסו את הטחול לצלחת תרבות 6 ס"מ המכילה 2 מ"ל של פתרון collagenase D (2 מ"ג/מ"ל collagenase D מומס HBSS המכילים סידן, מגנזיום).
    14. להזריק 1 מ"ל collagenase D לפתרון הטחול פעמיים עם מזרק 1 מ"ל, מחט 25 גרם. לחתוך הטחול לחתיכות קטנות עם מספריים קטנות.
    15. לנער, דגירה בטמפרטורת החדר במשך 25 דקות.
    16. להוסיף 500 μl של 0.5 M EDTA בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
      הערה: השלבים של 3.1.13-3.1.14 הם קריטיים להגדלת היבול של בקרי תחום.
    17. כעת להשתמש האחורי של דחיפה-מקל של מזרק 3 מ"ל מינצ slurry את הטחול על-ידי העברת מסננת תא 40 μm ולאסוף התליה תא על-ידי צריך שתוציאו ב g x 300 במשך 5 דקות.
    18. Resuspend בגדר תא ב- 350 μl של מקינטוש מאגר, 50 μl של ה-FcR חסימת ריאגנט μl 100 של פאן הדנדריטים תאים ביוטין-נוגדן קוקטייל ב 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
      הערה: נוגדן קוקטייל נגד אנטיגנים זה אינם מבוטאים על-ידי בקרי.
    19. לשטוף את התאים על-ידי הוספת 9 מ של מאגר MACS, צנטריפוגה ב g x 300 במשך 5 דקות.
    20. Resuspend בגדר תא ב- 800 μl MACS המאגר ולהוסיף 200 μl של אנטי ביוטין חרוזים ב 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
    21. חזור על השלבים של 3.1.9-3.1.11 כדי לאסוף DCs.
    22. לשטוף עמודה עם עוד 3 מ"ל של מקינטוש מאגר פעמיים, גם לאסוף את הזרימה דרך.
    23. לפנק את 2 x 105 Dc/ml נוכחות או היעדרות של 100-400 nM CDDO-DFPA ב C ° 37 עבור 1 מר בנפרד, תווית CD4+ תאי T (1 x 107/ml) עם 1 μM CFSE ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות, לשטוף עם PBS , והתאם את עוצמת הקול כדי להשיג ריכוז סופי 2 x 106 T תאים/מ ל....
    24. בשלב הבא, בצלחת 96-ובכן, בשיתוף תרבות 100 μl של התאים הדנדריטים שטופלו באותו אמצעי אחסון של CD4 התווית על-ידי CFSE+ T תאים, שניהם שנאסף על השלבים שלעיל כדי לקבל 1:10 יחס. עכשיו להוסיף 100 ננוגרם למ"ל אובלבומין (פשוט) פפטיד 323-329 לכל טוב, למדוד עוצמת CFSE של תאי T על ידי cytometry זרימה לאחר 2-3 ימי דגירה.
      הערה: את מספרי הטלפון הנייד ואת יחס של DCs ו- T תאים מוטבו מן העבודה הקודמת שלנו37.
  2. זירוז פסיבית EAE באמצעות הזרקת BMDCs פעמו עם מיאלין אוליגודנדרוציטים גליקופרוטאין (ש א) (35-55)
    1. צלחת ml 2 של עונה 1 פרק 106 BMDCs/ml לכל טוב טוב 6-צלחת בינונית-תרבות ב נוכחות או היעדרות של 100-400 nM CDDO-DFPA עבור המקננת 1שעות.
    2. להוסיף 10 ng/ml של LPS עבור ומוכנסות 24 שעות.
    3. להוסיף 100 μg/ml של ש. א. (35-55) עבור ומוכנסות 4 שעות.
    4. לקצור את הבולם תא, צנטריפוגה ב 300 x g במשך 5 דקות.
    5. Resuspend בגדר תא עם PBS ולספור את התאים.
    6. Subcutaneously להזריק μl 200 2 x 106 תאים עכברים C57BL/6 נקבה בת 8-10 שבועות (100 μl לתוך כל רגל).
    7. ביום של הזרקת BMDC ו- 48 שעות. מאוחר יותר, להזריק 200 ng של שעלת רעל (PTX) כל עכבר.
    8. חזור על צעדים 3.2.6-3.2.7 פעם בשבוע, למשך 4 שבועות רצופים.
    9. להעריך את הסימפטומים הקליניים של EAE מדי יום באמצעות הקריטריונים הסטנדרטיים37 (0.5-רפוי הזנב, הזנב 1-צליעה, חולשה של הגפיים האחוריות 2 בינוני, חולשה של הגפיים האחוריות 3-חמור, שיתוק גפיים הינד 4-שלמה, 5-quadriplegia או אדעך המדינה, 6-מוות).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בידול ובחירה של BMDCs:

מח עצם ובתאים היו תרבותי שלם בינוני RPMI בנוכחות GM-CSF ו- IL-4 כדי להתמיין iDCs במשך 7 ימים (איור 1 א'). יום 1, התאים היו קטנים בגודלם, הראו מורפולוגיה כדורית. כביסה עם PBS לפני ההחלפה של בינוני טריים יום 3 עזר תאים לאשכולות טופס, גם הגדילה את אוכלוסיית CD11c+ תאים. ביום 4, BMDCs הורחבו במידה ויזם הקמת אשכול. מודבקת מקרופאגים היו גם המרה, נצפתה בתח...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאמר זה מתאר פרוטוקול יעיל זה עשוי לשמש reproducibly ליצירת iDCs, לאחר מכן להבדיל אותם לתוך TolDCs, אנו מציעים כי זה ניתן להחיל כדי להעריך את היכולת של סוכנים היעד מולקולריים חדשים כדי לעודד את TolDC פנוטיפ. כפי שמתואר בדו ח זה, עקבנו רצף שבו קודם ניתחנו ביטוי TolDC של ליגנדים פני השטח על ידי cytometry זרימה, ואחריו הערכה של הפרופיל ציטוקין DC כפי שנמדד על-ידי לרביעיית-PCR ELISA. לבסוף, הפונקציה immunoregulatory של TolDCs אושר על ידי הפגנת יכולת שלהם כדי להפחית את תא T התפשטות במבחנה והיעילות שלהם לדכא את מחלת ח...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים ריאטה תרופות על מתן CDDO-DFPA. אנו גם להכיר את התמיכה של ג'יין, לי כיסא זיידמן בחדשנות סרטן בילדים (ג'ון Letterio). עבודה זו נתמכה על ידי משרד ההגנה [W81XWH-12-1-0452]; יוזמת המחקר אנג'י פאולר המתבגר ויאנג של סרטן מבוגרים, בכל מקרה מקיף במרכז לחקר הסרטן; ופרס קלהאן בוגר מלומד עבור מצב Hsi-ג'ו ווי מקרן F.J. קלהאן.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
CDDO-DFPA (RTA-408)Reata Pharmaceuticalsבסינתזה ביתיתתרבית תאים
GM-CSFPeprotech Inc.315-03עכבר בידול BMDC
IL-4Peprotech Inc.214-14התמיינות BMDC
ליפופוליסכרידים (LPS)סיגמא אולדריץ' בע"מ.L2880תרבית תאים
ובטא;-מרקפטואתנולסיגמא אולדריץ' בע"מ516732תרבית תאים
רעלן שעלת (PTX)R& D systems3097EAE אינדוקציה
MOG (35– 55) פפטיד21stCentury ביוכימיקליםבסינתזה ביתיתאינדוקציה EAE
טריפאן כחולGibco, Life Technologies15250-061תרבית תאים
RPMI-1640 בתוספת L-גלוטמיןThermoFisher Scientific11875-093תרבית תאים
חומצת אמינו לא חיונית (100X)ThermoFisher Scientific11140050תרבית
תאים HEPESThermoFisher Scientific15630080תרבית תאים
פניצילין/סטרפטומיציןThermoFisher Scientific15140122תרבית תאים
40 & #956; מסננת תאיםm Corning352340בידוד תאים
מצומד PE CD80BD Biosciences557227ציטומטריית זרימה
מצומד PE CD86BD Biosciences555665ציטומטריית זרימה
מצומד PE PD-L1BioLegend124307ציטומטריית זרימה
מצומד APC MHCIIMiltenyi Biotec Inc.130-112-388ציטומטריית זרימה
מצומד APC CD11cBD Biosciences340544איזוטיפ ציטומטריית זרימה
תואם PEMiltenyi Biotec Inc.130-091-835איזוטיפ ציטומטריית זרימה
תואם APCMiltenyi Biotec Inc.130-091-836ציטומטריית זרימה
CFSEBioLegend423801בדיקת התפשטות תאי T
ערכת בידוד תאים דנדריטייםפאן Miltenyi Biotec Inc.130-100-875בדיקת התפשטות תאי T
מגיב חוסם FCRMiltenyi Biotec Inc.130-100-875בדיקת התפשטות תאי
T קוקטייל נוגדנים ביוטין של תאים דנדריטייםMiltenyi Biotec Inc.130-100-875בדיקת התפשטות תאי T
ביוטין מיקרו-חרוזיםMiltenyi Biotec Inc.130-100-875בדיקת התפשטות תאי
T CD4+ ערכת בידוד תאי TMiltenyi Biotec Inc.130-104-454בדיקת התפשטות תאי
T CD4+ תאי T קוקטייל נוגדניםביוטין Miltenyi Biotec Inc.130-104-454בדיקת התפשטות תאי T
ביוטין מיקרו-חרוזיםMiltenyi Biotec Inc.130-104-454בדיקת התפשטות תאי
T מאגר ליסינג ACKThermoFisher ScientificA1049201BMDC התמיינות
1 מ"ל מזרקBD Biosciences309626בדיקת התפשטות תאי T
3 מ"ל מזרקBD Biosciences309588התמיינות BMDC
25G מחטBD Biosciences309626בדיקת התפשטות תאי T
מחט 23GBD Biosciences309588התמיינות BMDC
BSASigma Aldrich Inc.A2058בדיקת התפשטות תאי T
EDTAThermoFisher Scientific15575020בדיקת התפשטות תאי T
LS ColumnMiltenyi Biotec Inc.130-042-401בדיקת התפשטות תאי T
מסנן טרום הפרדהMiltenyi Biotec Inc.130-095-823בדיקת התפשטות תאי
T קולגנאז DSigma Aldrich Inc.11088858001בדיקת התפשטות תאי T
HBSSThermoFisher Scientific14025076בדיקת התפשטות תאי T
אובאלבומין (OVA) פפטיד 323– 329סיגמא אולדריץ' בע"מO1641בדיקת התפשטות תאי T
עכבר IFN-γ בדיקה TaqManThermoFisher ScientificMm01168134_m1עכבר qRT-PCR
IL-12a בדיקה TaqManThermoFisher ScientificMm00434165עכבר qRT-PCR
IL-12 p70 DuoSet ELISAR& מערכות DDY419-05ELISA
Mouse EDN-1 ELISARayBiotechELM-EDN1-1ELISA
TNF-α בדיקה TaqManThermoFisher ScientificMm00443258qRT-PCR
עכבר TNF-α Quantikine ELISA KitR& D systemsMTA00BELISA
IL-6 TaqMan בדיקהThermoFisher ScientificMm00446190qRT-PCR
עכבר IL-6 Quantikine ELISA KitR& D systemsM6000BELISA
IL-23a TaqMan בדיקהThermoFisher ScientificMm01160011qRT-PCR
עכבר IL-23 DuoSet ELISAR& D systemsDY1887-05ELISA
IL-4 TaqMan בדיקהThermoFisher ScientificMm99999154_m1qRT-PCR
IL-10 TaqMan בדיקהThermoFisher ScientificMm01288386_m1qRT-PCR
TGF-β בדיקת TaqManThermoFisher ScientificMm01178820_m1qRT-PCR
Anti-Heme Oxygenase 1 נוגדןAbcamab13248Western blotting
Anti-β-actin נוגדןAbcamab8226Western blotting
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection SystemBio-Rad Inc.qRT-PCR
BD FACSמנתח תאי קליבורBD Biosciencesזרימה ציטומטריה
עכבר אנטי אנטי

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Steinman, R. M., Cohn, Z. A. Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. I. Morphology, quantitation, tissue distribution. J Exp Med. 137 (5), 1142-1162 (1973).
  2. Inaba, K., et al. Efficient presentation of phagocytosed cellular fragments on the major histocompatibility complex class II products of dendritic cells. J Exp Med. 188 (11), 2163-2173 (1998).
  3. Banchereau, J., et al. Immunobiology of dendritic cells. Annu Rev Immunol. 18, 767-811 (2000).
  4. Sallusto, F., Lanzavecchia, A. Efficient presentation of soluble antigen by cultured human dendritic cells is maintained by granulocyte/macrophage colony-stimulating factor plus interleukin 4 and downregulated by tumor necrosis factor alpha. J Exp Med. 179 (4), 1109-1118 (1994).
  5. Hemmi, H., Akira, S. TLR signalling and the function of dendritic cells. Chem Immunol Allergy. 86, 120-135 (2005).
  6. Caux, C., et al. B70/B7-2 is identical to CD86 and is the major functional ligand for CD28 expressed on human dendritic cells. J Exp Med. 180 (5), 1841-1847 (1994).
  7. Chastain, E. M., Duncan, D. S., Rodgers, J. M., Miller, S. D. The role of antigen presenting cells in multiple sclerosis. Biochim Biophys Acta. 1812 (2), 265-274 (2011).
  8. Smeltz, R. B., Chen, J., Ehrhardt, R., Shevach, E. M. Role of IFN-gamma in Th1 differentiation: IFN-gamma regulates IL-18R alpha expression by preventing the negative effects of IL-4 and by inducing/maintaining IL-12 receptor beta 2 expression. J Immunol. 168 (12), 6165-6172 (2002).
  9. Gyulveszi, G., Haak, S., Becher, B. IL-23-driven encephalo-tropism and Th17 polarization during CNS-inflammation in vivo. Eur J Immunol. 39 (7), 1864-1869 (2009).
  10. Kronenberg, M., Rudensky, A. Regulation of immunity by self-reactive T cells. Nature. 435 (7042), 598-604 (2005).
  11. Boks, M. A., et al. IL-10-generated tolerogenic dendritic cells are optimal for functional regulatory T cell induction--a comparative study of human clinical-applicable DC. Clin Immunol. 142 (3), 332-342 (2012).
  12. Anderson, A. E., et al. Tolerogenic dendritic cells generated with dexamethasone and vitamin D3 regulate rheumatoid arthritis CD4+ T cells partly via transforming growth factor-beta1. Clin Exp Immunol. 187 (1), 113-123 (2017).
  13. Chauveau, C., et al. Heme oxygenase-1 expression inhibits dendritic cell maturation and proinflammatory function but conserves IL-10 expression. Blood. 106 (5), 1694-1702 (2005).
  14. Maldonado, R. A., von Andrian, U. H. How tolerogenic dendritic cells induce regulatory T cells. Adv Immunol. 108, 111-165 (2010).
  15. Schmidt, S., Nino-Castro, A., Schultze, J. Regulatory dendritic cells: there is more than just immune activation. Frontiers in Immunology. 3 (274), (2012).
  16. Hilkens, C. M., Isaacs, J. D., Thomson, A. W. Development of dendritic cell-based immunotherapy for autoimmunity. Int Rev Immunol. 29 (2), 156-183 (2010).
  17. Dhodapkar, M. V., Steinman, R. M. Antigen-bearing immature dendritic cells induce peptide-specific CD8(+) regulatory T cells in vivo in humans. Blood. 100 (1), 174-177 (2002).
  18. Dhodapkar, M. V., Steinman, R. M., Krasovsky, J., Munz, C., Bhardwaj, N. Antigen-specific inhibition of effector T cell function in humans after injection of immature dendritic cells. J Exp Med. 193 (2), 233-238 (2001).
  19. Giannoukakis, N., Phillips, B., Finegold, D., Harnaha, J., Trucco, M. Phase I (safety) study of autologous tolerogenic dendritic cells in type 1 diabetic patients. Diabetes Care. 34 (9), 2026-2032 (2011).
  20. Benham, H., et al. Citrullinated peptide dendritic cell immunotherapy in HLA risk genotype-positive rheumatoid arthritis patients. Sci Transl Med. 7 (290), 290ra287(2015).
  21. Bell, G. M., et al. Autologous tolerogenic dendritic cells for rheumatoid and inflammatory arthritis. Ann Rheum Dis. 76 (1), 227-234 (2017).
  22. University Hospital, A. A "Negative" Dendritic Cell-based Vaccine for the Treatment of Multiple Sclerosis: a First-in-human Clinical Trial (MS tolDC). ClinicalTrials.gov. , (2015).
  23. Pujol, F. I. G. T. i Tolerogenic Dendritic Cells as a Therapeutic Strategy for the Treatment of Multiple Sclerosis Patients (TOLERVIT-MS) (TOLERVIT-MS). ClinicalTrials.gov. , (2016).
  24. Varea, S. Treatment of Multiple Sclerosis and Neuromyelitis Optica With Regulatory Dendritic Cell: Clinical Trial Phase 1 B. ClinicalTrials.gov. , (2017).
  25. Jauregui-Amezaga, A., et al. Intraperitoneal Administration of Autologous Tolerogenic Dendritic Cells for Refractory Crohn's Disease: A Phase I Study. J Crohns Colitis. 9 (12), 1071-1078 (2015).
  26. Mahnke, K., Schmitt, E., Bonifaz, L., Enk, A. H., Jonuleit, H. Immature, but not inactive: the tolerogenic function of immature dendritic cells. Immunol Cell Biol. 80 (5), 477-483 (2002).
  27. Lutz, M. B., Schuler, G. Immature, semi-mature and fully mature dendritic cells: which signals induce tolerance or immunity? Trends Immunol. 23 (9), 445-449 (2002).
  28. Suciu-Foca, N., et al. Molecular characterization of allospecific T suppressor and tolerogenic dendritic cells: review. Int Immunopharmacol. 5 (1), 7-11 (2005).
  29. Wakkach, A., et al. Characterization of dendritic cells that induce tolerance and T regulatory 1 cell differentiation in vivo. Immunity. 18 (5), 605-617 (2003).
  30. Szeles, L., et al. 1,25-dihydroxyvitamin D3 is an autonomous regulator of the transcriptional changes leading to a tolerogenic dendritic cell phenotype. J Immunol. 182 (4), 2074-2083 (2009).
  31. Unger, W. W., Laban, S., Kleijwegt, F. S., vander Slik, A. R., Roep, B. O. Induction of Treg by monocyte-derived DC modulated by vitamin D3 or dexamethasone: differential role for PD-L1. Eur J Immunol. 39 (11), 3147-3159 (2009).
  32. Reichardt, W., et al. Impact of mammalian target of rapamycin inhibition on lymphoid homing and tolerogenic function of nanoparticle-labeled dendritic cells following allogeneic hematopoietic cell transplantation. J Immunol. 181 (7), 4770-4779 (2008).
  33. Woltman, A. M., et al. The effect of calcineurin inhibitors and corticosteroids on the differentiation of human dendritic cells. Eur J Immunol. 30 (7), 1807-1812 (2000).
  34. Hackstein, H., Thomson, A. W. Dendritic cells: emerging pharmacological targets of immunosuppressive drugs. Nat Rev Immunol. 4 (1), 24-34 (2004).
  35. Torres-Aguilar, H., Blank, M., Jara, L. J., Shoenfeld, Y. Tolerogenic dendritic cells in autoimmune diseases: crucial players in induction and prevention of autoimmunity. Autoimmun Rev. 10 (1), 8-17 (2010).
  36. Rutella, S., Danese, S., Leone, G. Tolerogenic dendritic cells: cytokine modulation comes of age. Blood. 108 (5), 1435-1440 (2006).
  37. Wei, H. J., Pareek, T. K., Liu, Q., Letterio, J. J. A unique tolerizing dendritic cell phenotype induced by the synthetic triterpenoid CDDO-DFPA (RTA-408) is protective against EAE. Sci Rep. 7 (1), 9886(2017).
  38. van Etten, E., Mathieu, C. Immunoregulation by 1,25-dihydroxyvitamin D3: basic concepts. J Steroid Biochem Mol Biol. 97 (1-2), 93-101 (2005).
  39. Pan, J., et al. Dexamethasone inhibits the antigen presentation of dendritic cells in MHC class II pathway. Immunol Lett. 76 (3), 153-161 (2001).
  40. Zhu, J., Paul, W. E. Heterogeneity and plasticity of T helper cells. Cell Res. 20 (1), 4-12 (2010).
  41. Spirig, R., et al. TLR2 and TLR4 agonists induce production of the vasoactive peptide endothelin-1 by human dendritic cells. Mol Immunol. 46 (15), 3178-3182 (2009).
  42. Walton, E. L. Make immunological peace not war: Potential applications of tolerogenic dendritic cells. Biomed J. 40 (2), 77-79 (2017).
  43. Constantinescu, C. S., Farooqi, N., O'Brien, K., Gran, B. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) as a model for multiple sclerosis (MS). Br J Pharmacol. 164 (4), 1079-1106 (2011).
  44. Xu, Y., Zhan, Y., Lew, A. M., Naik, S. H., Kershaw, M. H. Differential development of murine dendritic cells by GM-CSF versus Flt3 ligand has implications for inflammation and trafficking. J Immunol. 179 (11), 7577-7584 (2007).
  45. Angelov, G. S., Tomkowiak, M., Marcais, A., Leverrier, Y., Marvel, J. Flt3 ligand-generated murine plasmacytoid and conventional dendritic cells differ in their capacity to prime naive CD8 T cells and to generate memory cells in vivo. J Immunol. 175 (1), 189-195 (2005).
  46. Lowes, M. A., et al. Increase in TNF-alpha and inducible nitric oxide synthase-expressing dendritic cells in psoriasis and reduction with efalizumab (anti-CD11a). Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (52), 19057-19062 (2005).
  47. Schnorrer, P., et al. The dominant role of CD8+ dendritic cells in cross-presentation is not dictated by antigen capture. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (28), 10729-10734 (2006).
  48. Wang, W., Li, J., Wu, K., Azhati, B., Rexiati, M. Culture and Identification of Mouse Bone Marrow-Derived Dendritic Cells and Their Capability to Induce T Lymphocyte Proliferation. Med Sci Monit. 22, 244-250 (2016).
  49. Lutz, M. B., et al. An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. J Immunol Methods. 223 (1), 77-92 (1999).
  50. Griffin, M. D., et al. Dendritic cell modulation by 1alpha,25 dihydroxyvitamin D3 and its analogs: a vitamin D receptor-dependent pathway that promotes a persistent state of immaturity in vitro and in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (12), 6800-6805 (2001).
  51. Bscheider, M., Butcher, E. C. Vitamin D immunoregulation through dendritic cells. Immunology. 148 (3), 227-236 (2016).
  52. Castiello, L., et al. Monocyte-derived DC maturation strategies and related pathways: a transcriptional view. Cancer Immunol Immunother. 60 (4), 457-466 (2011).
  53. Decker, W. K., et al. Deficient T(H)-1 responses from TNF-alpha-matured and alpha-CD40-matured dendritic cells. J Immunother. 31 (2), 157-165 (2008).
  54. Longhi, M. P., et al. Dendritic cells require a systemic type I interferon response to mature and induce CD4+ Th1 immunity with poly IC as adjuvant. J Exp Med. 206 (7), 1589-1602 (2009).
  55. Link, H., Huang, Y. M., Xiao, B. G. Dendritic cells in experimental allergic encephalomyelitis and multiple sclerosis. J Neuroimmunol. 100 (1-2), 102-110 (1999).
  56. Leech, M. D., et al. Cutting edge: IL-6-dependent autoimmune disease: dendritic cells as a sufficient, but transient, source. J Immunol. 190 (3), 881-885 (2013).
  57. Saul, L., Besusso, D., Mellanby, R. J. LPS-matured CD11c+ bone marrow-derived dendritic cells can initiate autoimmune pathology with minimal injection site inflammation. Lab Anim. 51 (3), 292-300 (2017).
  58. Aghdami, N., Gharibdoost, F., Moazzeni, S. M. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) induced by antigen pulsed dendritic cells in the C57BL/6 mouse: influence of injection route. Exp Anim. 57 (1), 45-55 (2008).
  59. Wilson, H. L. Limitations with in vitro production of dendritic cells using cytokines. J Leukoc Biol. 75 (4), 600-603 (2004).
  60. Ni, K., O'Neill, H. C. Development of dendritic cells from GM-CSF-/- mice in vitro : GM-CSF enhances production and survival of cells. Dev Immunol. 8 (2), 133-146 (2001).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Tolerogenic Dendritic CellsBone Marrow Derived DCsCDDO DFPA TreatmentFlow Cytometry AnalysisT Cell Proliferation AssayMagnetic Cell SortingCytokine Gene ExpressionPro Inflammatory ReductionAutoimmune Encephalomyelitis ModelImmunosuppressive Response Testing

Related Articles