Method Article

מיקרוסקופ אור גיליונות עבור ויזואליזציה תלת מימדי של תאים חיסוניים אנושי

DOI:

10.3791/57651

⸱

June 13th, 2018

 ,  ,  , 
1Department of Biophysics, Center for Integrative Physiology and Molecular Medicine (CIPMM), School of Medicine, Saarland University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להמחיש תאים חיסוניים בתוך מטריצה תלת מימדי (3D) קולגן באמצעות מיקרוסקופ אור גיליונות. פרוטוקול זה מרחיב כיצד לעקוב אחר נדידת תאים ב- 3D. פרוטוקול זה יכול להיות מועסק עבור סוגים אחרים של תאים השעיה מטריקס תלת-ממד.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In vivo, הפעלה, התפשטות, ותפקודו של תאים חיסוניים כל להתרחש בסביבה תלת מימדי (3D), למשל בבלוטות הלימפה או רקמות. עד כה, רוב במבחנה מערכות להסתמך על משטחים (2D) דו מימדי, כגון לוחות תרבית תאים או coverslips. מחקים בצורה אופטימלית בתנאים פיזיולוגיים במבחנה, אנו מנצלים על מטריצת קולגן 3D פשוטה. קולגן הוא אחד המרכיבים העיקריים של מטריצה חוץ-תאית (ECM) והוא כבר בשימוש נרחב להוות מטריצות תלת-ממד. עבור הדמיה תלת-ממדית, הטכנולוגיה פיתחה לאחרונה מיקרוסקופ אור גיליונות (המכונה גם מטוס יחיד תאורה מיקרוסקופ) בהשתתפות עם מהירות גבוהה רכישה, עומק החדירה גדול, הלבנת נמוך ו photocytotoxicity. יתר על כן, מיקרוסקופ אור גיליונות הוא יתרון מיוחד עבור מדידה ארוכת טווח. כאן נתאר פרוטוקול ממוטבת כיצד להגדיר ולטפל תאים חיסוניים אנושי, למשל ראשי האדם ציטוטוקסיות לימפוציטים מסוג T (CTL) ואת הרוצח הטבעיים (NK) תאי מטריצת קולגן תלת-ממד לשימוש עם מיקרוסקופ אור גיליונות עבור הדמיה תא חי, דוגמאות קבועות. ההליך עבור ייבוא תמונות וניתוח של נדידת תאים מוצגים. דגש מיוחד ניתן להדגיש שלבים קריטיים וגורמים עבור הכנת הדוגמא וניתוח נתונים. פרוטוקול זה יכול להיות מועסק עבור סוגים אחרים של תאים ההשעיה במטריצה קולגן תלת-ממד ואינו מוגבל תאים חיסוניים.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

רוב הידע אודות מעבר תאים נובע 2D ניסויים1,2,3, אשר נערכים בדרך כלל בכוס, או משטח הפלסטיק של תרבות/הדמיה המנה. עם זאת, תרחיש פיזיולוגיים דורש, ברוב המקרים, microenvironment תלת-ממד, שבו מטריצות (ECM) ממלא תפקיד מכריע. ECM לא רק מספק הארומטיים במבנה התלת-ממדי כדי לשמור על מורפולוגיה התא הנכון אלא מציע גם אותות הישרדות או הכיוון הנכון לתפקוד אופטימלי של תאים רבים4,5 . לכן, נדרשת סביבה תלת-ממד לזיהוי טוב יותר של פונקציות תאית והתנהגות בסביבה כדאי המשקף את ההקשר פיזיולוגיים.

בגוף האדם, רוב התאים....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר המבוצע במחקר זה החומר האנושי (ליקוציט צמצום מערכת צ'יימברס מתורמים דם אנושי) מוסמך על ידי ועדת האתיקה המקומית (ההכרזה מ- 16.4.2015 (84/15; פרופסור ד ר רטיג-Stürmer)), עוקב אחר ההנחיות המתאימות.

1. הכנת קולגן ינוטרלו פתרון (500 µL)

  1. העברת µL 400 של קולגן צוננת מניות פתרון (10.4 mg/mL) צינור mL 1.5 סטרילי מתחת למכסה התרבות תאים. לאט לאט להוסיף 50 µL של צונן PBS x 10 (pH 7.0-7.3) כדי µL 400 של פתרון מלאי הקולגן צוננת. לערבב את הפתרון על ידי ריצוף בעדינות את הצינור.
    הערה: כל השלבים בחלק 1 צריך להיעשות תחת ברדס התרבות תאים.
  2. הוסף 8 µL של 0.1 M NaOH לתוך µL 500 של הפתרון קולגן 1.1. כדי להתאים את ה-pH ל 7.2-7.6. השתמש במב....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תיתכן היווצרות במהלך ההעברה תא T הוא תהליך דינמי מאוד, אשר תלויים אקטין. כדי להמחיש תיתכן היווצרות CTL אנושי ראשוני, אנחנו transiently transfected חלבון mEGFP התמזגו לתייג את שלד התא אקטין ב- CTL כמתואר לפני11. יום אחד לאחר תרביות תאים, התאים היו מוטבע קולגן המטריצה. אוספי תמונות נרכשו בכל 40 s עם שלב-בגודל של 1 מיקרומטר ב 37 ° C באמצעות מיקרוסקופ אור גיליונות. כפי שמוצג באיור 2A ו- 1 הסרט משלים, במהלך ההעברה, צורת CTL.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

רוב מבחני במבחנה מתבצעות על משטח דו-מימדית, לדוגמה-פטרי, לוחיות תרבית תאים או על coverslips, ואילו ויוו תאים, במיוחד תאים חיסוניים, לחוות בעיקר microenvironment תלת-ממד. מתעוררים ראיות מראה כי דפוסי ההגירה של תאים חיסוניים שונים בין תרחישים של 2D and 3D-17. יתר על כן, ביטוי פרופילים של תאים סרטניים שונים גם ב- 2D ו 3D-תרבותי רקמות18,19,20. לכן, כדי לדמות בצורה הטובה ביותר את התנאים הפיזי.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים לא פיננסיים או מסחרי ניגוד אינטרסים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים המכון Hemostaseology קלינית ורפואה עירוי למתן דם התורם; כרמן Hässig, קורה Hoxha לעזרה טכנית מצוינת. אנו מודים רטיג ג'נס (אוניברסיטת חבל הסאר) עבור וקטור pMAX ששונה רולנד Wedlich-Söldner (אוניברסיטת מינסטר) עבור הבונה LifeAct-רובי המקורי, כריסטיאן יונקר (אוניברסיטת חבל הסאר) ליצירת הבונה LifeAct-mEGFP. הפרויקט מומן על ידי 1027 Sonderforschungsbereich (פרוייקט A2 כדי B.Q.) ו- 894 (פרוייקט A1 מ. ה). מיקרוסקופ אור גיליונות מומן על ידי DFG (GZ: מוסד 256/4 19-1 FUGG).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Fibricol, תמיסת קולגן בקרמתקדמת ביומטריקס  # 5133-20MLמטריצת קולגן
0.5 M תמיסת NaOHMerck1091381000לנטרול תמיסת פיבריקול
אגרוז נמס נמוך במיוחדAffymetrix32821-10GMהכנת דגימה ב- c [Col]
Dynabeads ערכת תאי CD8 T אנושיים נמוכיםתרמו פישר11348Dבידוד של תאי T אנושיים ראשוניים CD8+ מ-PBMC
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 להרחבה והפעלה של תאי TThermo Fisher11132Dהפעלה של אוכלוסיות CTL
אינטרלוקין-2 תרמו פישר PHC0023 רקומביננטי אנושיגירוי של CTL P3 מתורבת
ערכת תמיסה ראשוניתLonzaV4XP-30XXTransfection
α-PFN1 נוגדן, ארנב, IgGAbcamab124904IF
Alexa Fluor 633 PhalloidinThermo FisherA22284IF
CellMask כתם קרום פלזמה כתוםThermo FisherC10045תווית תא פלורסנט
Tween 20SigmaP1379-250mLIF
Triton X-100Eurobio018774IF
Thermo Fisher14190250אלבומין
סיגמאA9418-100GIF
עז ואלפא; ארנב 568, IgG, ארנבThermo FisherA-11011IF
Lightsheet Z.1 (מיקרוסקופיה של גיליון אור)ZeissN.A.
קולט אדים לתרבית תאיםThermo FisherHeraSafe KS
חממת תרבית תאים HERACell 150i תרמו פישרנ.א.
צנטריפוגה 5418 ו- 5452EppendorfN.A.
פיפטותEppendorf3123000039, 3123000020, 3123000063
טיפים לפיפטותVWR89079-444, 89079-436, 89079-452 
צינורות 15 מ"לSarstedt  62.554.002
נימים 50 ומיקרו; LVWR (מותג)613-3373הכנת דגימת Zeiss LSFM
בוכנה לנימיםVWR (מותג)BRND701934"חותמות עם קצה טפלון" הכנת דגימת LSFM
MColorPhast pHMerck1095430001לבדיקת pH של מזרקי Fibricol
BD Plastipak 1 מ"לBDZ230723  ALDRICHהכנת דוגמאות אלטרנטיבית
חימר דוגמנות (Hasbro Play-Doh A5417EU7)Play-DohN.A.
ממיר קבצים של ImarisBitplaneזמין בכתובת http://www.bitplane.com המרת קבצי הדמיה לפורמט קובץ Imaris
Imaris 8.1.2 (MeasurementPro, Track, Vantage)Bitplaneזמין בכתובת http://www.bitplane.com ניתוח נתוני הדמיה תלת מימדית ו-4D
בסרום בקר של DPBS Dulbecco של DPBS Dulbecco טיפים מנוטרלים BD

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Decaestecker, C., Debeir, O., Van Ham, P., Kiss, R. Can anti-migratory drugs be screened in vitro? A review of 2D and 3D assays for the quantitative analysis of cell migration. Med Res Rev. 27 (2), 149-176 (2007).
  2. Doyle, A. D., Petrie, R. J., Kutys, M. L., Yamada, K. M.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Light sheet Microscopy3D Collagen MatrixHuman Immune CellsCell Migration TrackingSample PreparationImage AcquisitionLive Cell ImagingFixed Sample AnalysisCytotoxic T LymphocytesNatural Killer Cells

Related Articles