הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

ייצור של מעבר צבע Nanopattern על ידי טכניקת Nanoimprinting תרמית והקרנת התגובה של תאים אנושיים המושבה יוצרי אנדותל

7.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/57661

⸱

1 ביולי 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Biomedical Engineering, Korea University, 2Department of Cardiology, Korea University Anam Hospital

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מציגים עבור הזיוף של צלחות nanopattern מעבר צבע באמצעות nanoimprinting תרמי ואת שיטת הקרנה התגובות של האדם ובתאים אנדותל nanostructures פרוטוקול. באמצעות הטכנולוגיה המתואר, זה אפשרי לייצר לפיגום שיכול להשפיע על התנהגות התא על ידי הגירויים הפיזיים.

תקציר

Nanotopography ניתן למצוא מטריצה חוץ-תאית שונים (ECMs) סביב הגוף וידוע שיש פעולות רגולטוריות חשובות על תגובות הסלולר. עם זאת, קשה לקבוע את היחס בין גודל ננו-מבנה את התגובות של תאים בשל העדר כלים ההקרנה נאותה. כאן, אנו מראים את התפתחות nanopattern מעבר צבע חסכונית הדירים עומדי המניפולציה של תגובות הסלולר. באמצעות אנודי אלומיניום אוקסיד (AAO) כתבנית הבסיס, צלחות nanopattern מעבר צבע עם nanopillars של הגדלת טווחי קוטר [120-200 ננומטר (GP 120/200), 200-280 ננומטר (GP 200/280) ו- 280-360 nm (GP 280/360)] היו מפוברק על ידי תרמית החתמה טכניקה. הצלחות nanopattern הדרגתיות האלה נועדו לחקות את המידות השונות של nanotopography ב- ECM ושימשו למסך את התגובות של אנדותל המושבה יוצרי תאים אנושיים (hECFCs). ב פרוטוקול זה, אנו מתארים את התהליך צעד אחר צעד של בדיית nanopattern הדרגתיות לוחות עבור תא הנדסה, טכניקות של טיפוח hECFCs מדם היקפי אנושי, culturing hECFCs על צלחות nanopattern.

מבוא

לאחרונה, התגובה של התאים על ידי גירוי פיזי של הטופוגרפיה משטח יש כבר לווק בתחום של תא הנדסה1,2,3,4. לכן, יותר תשומת לב התמקדו nanostructures תלת מימדי-התא מצורף משטח5. בעבר דווח כי אינטגרין, אשר המכשיר זיהוי פני השטח של התא, מעביר את הגירוי הפיזי מונע על ידי מבנה מיקרו-ננו ECM עד mechano-התמרה חושית6. גירוי מכני זה מסדיר בהתנהגות התא באמצעות הדרכה קשר7 ומשרה רה-ארגון cytoskeletal כדי לשנות את הצורה, בנוסף הדבקויות מוקד וקשיחות של תאים8.

האדם אנדותל ובתאים (hEPCs) בגוף מקרוב אינטראקציה עם microenvironment של ה-ECM שמסביב9. אפשרות זו מציינת כי המצב הפיסי של ECM משמש פרמטר חשוב עבור תאים ספציפיים-מטריקס אדהזיה היווצרות מורכבות כמו גזירה נגזר זרימת דם10. הוא דיווח כי nanotopography פני שטח משפר את היווצרות במבחנה של רשתות צינור קפילרי נרחב של hEPCs11 , כך גורם מסיסים ECM/ביו בשילוב המערכת מאפשרת hEPCs לזהות סובסטרטים לקוי ומקדם פצע ריפוי12,13. למרות זאת, היחס בין ה-ECM, hEPCs הוא לא הבין היטב.

אף על פי חוקרים רבים ניסו להבהיר את הקשר בין תא תגובות גופניות רמזים סובסטרטים14,15,16, מחקרים אלה נעשה שימוש רק בגודל קבוע של ננו-מבנה או nanopatterns עם כל הסידורים חריג שיש מגבלה להבהיר את הקשר בין הגודל של ההתנהגות ננו-מבנה ותא. הבעיה כאן היא חוסר כלים מתאימים לסינון תגובות סלולרית שיכולה להחליף קיימות גישות מייגע איטרטיבי כדי למצוא את הגודל האופטימלי של ננו-מבנה. לכן, טכניקה פשוטה נדרש לסינון תגובות תאים על stimulations פיזי ללא חזרה.

כאן, אנו מתארים שיטה המשמשת שלנו הקודם דוחות17,18,19 כדי לייצר nanopattern הדרגה שבה הקוטר של nanopillars מסודרים עולה בהדרגה. בנוסף, אנו גם תיאר כיצד לטפח ולנתח את אופן הפעולה של hECFCs על צלחות nanopattern מעבר צבע כדי לקבוע את ההשפעה של גירוי פיזי על התאים. Anodization מתון, תחריט הדרגתית, שיטת ציפוי שכבה אנטי בלטה שימשו ליצור הדרגתיות AAO עובש. על ידי אימוץ תרמית החתמה טכניקת הדפס אבן, זהה nanopatterns הדרגתיות פוליסטירן יוצרו באופן חסכוני נתיישב. שימוש nanopatterns מעבר הצבע, זה ריאלי כדי לקבוע איזה גודל של ננו-מבנה יש השפעה גדולה על התנהגות התא בסט אחד של הניסוי. אנו מצפים כי nanopattern מעבר צבע זה יהיה מועיל להבנת מנגנוני אינטראקציה בין דם, נגזר hECFC או תאים אחרים גדלים שונים של nanostructures.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

מחקר זה אושרה על ידי ועדת הבדיקה מוסדיים בבית החולים אלי באוניברסיטה קוריאה (IRB מס ' ED170495). כל ההליכים בוצעו על פי הצהרת הלסינקי תיקונים מאוחר יותר.

1. הכנת המצע אלומיניום (Al) על ידי ליטוש אלקטרוכימי

התראה: אלקטרופוליש הפתרון הוא מאכל רעילים. ללבוש ציוד מגן אישי כולל nitrile כפפות, משקפי מגן, חלוק המעבדה. לבצע שלב זה ברדס fume.

  1. הכן אלקטרופוליש פתרון על ידי ערבוב אתיל אלכוהול (C2H5הו, 99.9%), חומצה על-כלורית (HClO4, 60%) בתוך הג'קט זוגי 1 ליטר (ג2H5OH:HClO4 = 4:1).
  2. להתחבר כשהספל הז'קט כפול סירקולטור ולהגדיר את הטמפרטורה ב 7 º C. לשים את הספל הז'קט כפול פגים. להשאיר את הפתרון תחת ערבוב במשך לפחות 30 דקות עד הטמפרטורה יורדת 7 ° C.
  3. לטבול את הצלחת Al הנדסה גנטית (99.999%, 20 × 50 × 1 מ3) ופחמן האלקטרודה מונה בתוך תמיסת אלקטרופוליש באמצעות תנין קליפים התיל. להתאים את המיקום של הלוח Al האלקטרודה מונה פחמן אל פנים זה לזה.
    הערה: יש צורך להתקין את הקליפים בזהירות כדי לא לגעת הפתרון. במגע עם הפתרון, זיהומים זורם החוצה מתפסי יכול לזהם את הצלחת באל.
  4. לחבר את הצלחת Al מסוף חיובי ופחמן האלקטרודה מונה למסוף שלילית, ספק כוח של זרם ישיר (DC).
  5. כבה את פגים ולהחיל מתח של 20 נ' תחזוקה למצב זה במשך 4 דקות.
  6. להפעיל את פגים, ולאפשר הנוכחי לזרום עבור עוד 6 דקות.
    הערה: המצב סטטי מסירה רוב זיהומים חספוס מהצלחת Al והיא במצב דינמי משפר את איכות סופית אלקטרופוליש.
  7. כבה את אספקת החשמל ואת באופן ידני להפריד את הצלחת Al הקליפ. בקפדנות לשטוף את הצלחת Al עם מים יונים כדי להסיר את כל הפתרון הנותרים.
  8. יבש את הצלחת Al עם חנקן ולחנות תחת גז אינרטי. לנהל את תהליך הייבוש זה בקצה של כל ניסויים בשלב 1 ו- 2.
    הערה: בעת הזרקת אוויר דחוס, להפוך זרימת האוויר מן החלק מלוטש כדי מעבר לצד הנגדי. במקרה ההפוך, זיהומים יכולים לברוח מן החלק הלא מלוטשים ומזהמות את הצלחת באל.

2. ייצור של עובש AAO מעבר צבע עם חומצה זרחתית אלקטרוליט

התראה: מתיל אלכוהול שלה fume רעילים עינית בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. חשיפה מתמשכת כרומיום יכול להוביל הרעלת כרום רציני. לבצע שלב זה ברדס fume.

  1. Anodization ראשי
    1. להכנת 1 ליטר של חומצה זרחתית אלקטרוליט, לטעון 590 מ ל מים יונים לתוך בקבוק זכוכית.
    2. להוסיף 400 מ של מתיל אלכוהול (CH3הו, 99%) ו- 10 מ"ל של חומצה זרחתית (H3פו4, 85%) לתוך בקבוק הזכוכית. מערבבים את הפתרון על ידי טלטול ידני או עם בחישה מגנטית.
    3. שופכים 500 מ"ל של האלקטרוליט לתוך גביע הז'קט זוגי 1 ליטר. לטבול מלוטש Al צלחת ופחמן מונה האלקטרודה בתוך תמיסת ועם תנין קליפים התיל.
    4. יוצקים אלקטרוליט נוספים כדי לאתר את הגבול של אלקטרופוליש 2-3 מ מ מעל פני השטח של הפתרון.
      הערה: אם anodization מתבצעת עם הגבול של אלקטרופוליש לגעת את הפתרון, הצלחת Al נוטה צרוב במהלך anodization.
    5. להתקין מוט אנכי על הדום U-צורה. לצרף, קדירות תקורה, ו המדחף באמצעות מלחציים ממתכת. מיקום למדחף המדחף ליד הקצה התחתון של שתי אלקטרודות. הגדר את מהירות הסיבוב בחישה תקורה בין 200 עד 300 סל ד.
    6. להתחבר כשהספל הז'קט כפול סירקולטור ולהגדיר את הטמפרטורה ב-10 º C. השארת המערכת במשך לפחות שעה תחת תוך ערבוב עד הטמפרטורה יורדת ל-10 מעלות צלזיוס.
      הערה: אין להשתמש במים כמו הקירור. כי המים קופא בטמפרטורות נמוכות, מחזור הדם לא יפעלו כלל. מומלץ להשתמש תערובת של מים אתיל אלכוהול ביחס של 1:1 כמו הקירור.
    7. החל מתח של 195 V תחת ערבוב עבור 16 h.
      הערה: אם הזרם עולה יותר מ 50 אמא בתוך 2 או 3 h לאחר החלת את המתח, ההסתברות כי שריפת יתרחשו היא גבוהה מאוד. מיד לעצור את התהליך והחלף את הצלחת באל אחד חדש. אם בעיה זו מתרחשת שוב ושוב, בדוק כי קיים אין חריגות טמפרטורה לשליטת סירקולטור. אם אין חריגות, לשנות האלקטרוליט.
    8. עוצרים את אספקת החשמל, באופן ידני להפריד את הצלחת Al הקליפ. לשטוף את הצלחת Al מגולוון עם מים יונים כדי להסיר את כל הפתרון הנותרים.
  2. אלומינה תחריט
    1. להכין חומצה כרומית תצריב פתרון על ידי המסת 9.0 גר' של תחמוצת כרום (CrO3) ו- 20.3 מ ל חומצה זרחתית (H3פו4, 85%) ב- 500 מ"ל מים יונים.
    2. שופכים את הפתרון איכול לתוך כשהספל הז'קט זוגי 1 ליטר. השוכן הטמפרטורה 65 ° C.
    3. לטבול את הצלחת Al anodized בפתרון איכול במשך לפחות 10 h תחת ערבוב. חותם העליון של. הספל עם רדיד אלומיניום.
    4. יש לשטוף את הצלחת Al חרוט מספר פעמים עם מים יונים.
  3. Anodization משנית
    1. הגדר באותם תנאים ניסיוני כשלב 2.1.1 כדי 2.1.7.
    2. לטעון את הצלחת Al חרוט אל האנודה של המערכת ולהחיל מתח של 195 V עבור 6-אייץ '. לאחר מכן, לבטל את אספקת החשמל, באופן ידני להפריד את הצלחת Al הקליפ. מיד לשטוף את הצלחת Al מגולוון עם מים יונים.
      הערה: כאשר הזמן של כביסה מעוכבת, גודל הנקבוביות AAO מגביר בשוגג בשל החומצה הזרחנית שיורית.
  4. הרחבת נקבובית מעבר צבע
    1. להכין פתרון המתרחב נקבובית על ידי המסת g 5.765 של חומצה זרחתית ב 500 מ"ל מים יונים. שופכים את הפתרון לתוך גביע הז'קט זוגי 1 ליטר.
    2. להתחבר כשהספל הז'קט זוגי סירקולטור ולהגדיר הטמפרטורה ב 30 º C. במקום שלב בתנועה ליניארית אנכית ליד הספל. לצרף סוגר חלק מרגש של השלב הליניארי.
    3. הגדר את חלק מרגש של השלב הליניארי למיקום הביתה. לצרף את הקליפ בתושבת וטען את הצלחת Al מגולוון.
    4. לתפעל את המיקום של צלחת Al באופן ידני כך הצלחת Al יבואו ממש מעל פני השטח של הפתרון.
      הערה: בשלב זה, הצלחת Al לא צריכים לגעת הפתרון. הנקבובית הרחבת תהליך מתחיל ברגע הצלחת Al מגיע הפתרון.
    5. בהדרגה לטבול את הצלחת Al בתוך תמיסת במהירות של 4.86 מיקרומטר/s עבור 120 דקות להכין תבנית AAO 35 מ מ עם גודל הדרגתי בין 120 ננומטר ל-200 nm (GP 120/200). הפעל סטופר כרגע שהצלחת Al נוגע השטח של הפתרון.
    6. כדי להפוך את תבניות GP 200/280 ו- GP 280/360, לטבול כל שטח GP 120/200 עובש בתוך הנקבובית הרחבת פתרון עבור h 2 או 4, בהתאמה.
    7. יש לשטוף את הצלחת Al הדרגתיות מספר פעמים עם מים יונים.

3. בתצהיר של שכבה אנטי בלטה על הדרגתיות AAO עובש עם עצמי שהורכב חד שכבתי

הערה: בצע שלבים 3.2.1 כדי 3.3.3 בקופסת הכפפות. להתחבר הכפפות וחדר משאבת ואקום מזרק גז חנקן יבש. מקם כל דגימות, ריאגנטים, ואת מנגנוני בתא הכפפות לפני תהליך dehumidification. חזור על מחזור הזרקת גז פינוי וחנקן יותר משלוש פעמים מספקת להסרת לחות מתא הכפפות. . תן את חנקן יבש לזרום דרך הניסוי.

  1. השינוי הידרוקסיל AAO עובש בטיפול פיראניה
    1. יוצקים 140 מ ל חומצה גופרתית (H2אז4, 95%) בתוך טפלון (PTFE). להוסיף 60 מ ל מי חמצן dropwise (H2O2, 30%). להשאיר את זה במשך 30 דקות עד הפתרון התקררות.
      התראה: להיות זהיר מאוד בעת ביצוע פתרון Piranha. מהרגע של הוספת מימן על-חמצני, הפתרון נמרצות שחין ומייצר בטמפרטורות גבוהות. לבצע את הניסוי ברדס fume.
    2. לטבול כייר AAO בהפתרון עבור 30 s באמצעות פינצטה תווך לא מתכתי.
    3. יש לשטוף את התבנית AAO מספר פעמים עם מים יונים. משרים את התבנית במים יונים למשך 30 דקות ולשים אותו מתיל אלכוהול למשך עוד 30 דקות.
      התראה: כשזה מגיע. להסתרת הפתרון פיראניה בשימוש, לדלל את הפתרון עם כמות שופע של מי ברז.
    4. יבש לחלוטין כייר AAO תחת ואקום במשך 3 שעות.
  2. הכנה של פתרון מניות HDFS × 20
    הערה: HDFS הוא קיצור של (heptadecafluoro-1,1,2,2, - tetrahydrodecyl) dimethylchloro-silane
    1. למלא שליש בקבוק 1 ליטר n-הקסאן הנפות מולקולרית. לאטום את הבקבוק עם הסרט פרפין ואחסן אותו תחת חנקן יבש במשך 24 שעות ביממה.
    2. לסנן את 200 מ של n-הקסאן באמצעות מזרק זכוכית ו- 0.2 µm PTFE מזרק מסנן.
    3. שופכים את 80 מ של n מסונן-הקסאן לתוך בקבוק זכוכית 100 מ. להוסיף 2 מ של HDFS.
  3. טפט עצמית שהורכב התצהיר
    1. לטעון מ 57 ל n-הקסאן מסוננים בתוך 100 מ. לטבול את התבנית AAO לתוך הממס.
    2. להוסיף 3 מ"ל של פתרון מניות HDFS n-הקסאן כדי להפוך 2.9 מ"מ HDFS פתרון. חכה 10 דקות עבור התגובה להמשיך.
    3. להעביר את התבנית AAO n טריים-הקסאן. סגור, לסגור כל ריאגנט הבקבוקים. סגור את השסתום חנקן, ואז להוציא דגימות תא הכפפות.
      הערה: HDFS הוא רגיש מאוד לחות. לאחסן כל ריאגנטים המכילים HDFS ב desiccator.
    4. להשרות את התבנית AAO 60 מ של methoxynonafluorobutane (C10H6F18O2, 99%). Ultrasonically לנקות את התבנית AAO בתוך 10 לשנייה בכל פעם אחת כדי להסיר פיזית הספוחה מולקולות HDFS. חזור על הפעולות ניקוי 10 פעמים.
      הערה: חשיפת כייר AAO כדי אולטראסוניות במשך זמן רב ללא במרווחי זמן יגרום נזק לשכבת תחמוצת.
    5. יבש לחלוטין כייר AAO תחת ואקום במשך 24 שעות ביממה.
      הערה: שכבה אנטי בלטה בהצלחה הפקיד הוא דוחה מים סופר יציב במשך חודשים כאשר מאוחסנים של desiccator. ניתן להשהות את הפרוטוקול פה.

4. ייצור לוחות צבע Nanopattern על ידי החתמה תרמי

הערה: בצע שלבים 4.2 ל 4.7 בחדר נקי.

  1. לחתוך סדין פוליסטירן עבה 1.1 מ מ לגודל של 2.9 מ מ רחב על ידי 3.7 מ מ אורך שימוש בחותך מעגלים מודפסים (PCB) לוח.
  2. חותכים כייר AAO 35 מ"מ מלמטה בעזרת של אוחז. סמן מדגם השם והתאריך של ייצור על הגב.
  3. ניקוי של 8.0" וופל עם מנה קטנה של אתיל אלכוהול. לשים את הסדינים פוליסטירן כשהפחד ולאחר מכן לטעון AAO העובש.
  4. לשים את הסרט תחתון במגירה imprinter תרמית. לצרף את הסרט העליון האטם.
  5. לשים את לחם הקודש על הסרט התחתון. מניחים את האטם על לחם הקודש. ודא שיש אין אבק על לחם הקודש.
  6. סגור את המגירה של imprinter תרמית. החלת 165 מעלות חום ו kPa 620.52 בלחץ עבור 100 s.
  7. מגניב המדגם לטמפרטורת החדר. סובב בעדינות את הגיליון פוליסטירן לשחרר כייר AAO.

5. עיקור ושינוי הידרופילית צלחות Nanopattern מעבר צבע

  1. מניחים את הצלחות nanopattern על צלחת מרובע. לשפוך 100 מ של 70% אתיל אלכוהול ולחשוף את האור האולטרה סגול למשך 30 דקות.
  2. צלחות nanopattern עם חנקן יבש. להעביר את הצלחות nanopattern מחולל פלסמה חמצן.
  3. לפנות את החדר עד שהוא מגיע 1.33 הפלסטינית. לאחר מכן, להחדיר חמצן בשיעור של 30 ס מ3/מינימלית להחיל כוח תדר רדיו של 60 W. שמור על פלזמה חמצן עבור 90 s.
    הערה: מומלץ להשתמש nanopattern שטופלו פלזמה הצלחות תוך 14 ימים.
  4. לצרף את הצלחת nanopattern התחתית לצלחת תרבות התא באמצעות טיפת טולואן.
  5. לאטום את הדגימות בתוך תיק ולחטא עם מעקר פלזמה בטמפרטורה נמוכה.

6. טיפוח של hECFCs

הערה: לנהל את כל ההליכים centrifuging ב 4 ° C אלא אם נכתב אחרת.

  1. לפני לבודד את הדם ההיקפיים תאי תאים (PBMCs), דגירה לצלחת תרבות 12-ובכן מצופים קולגן ב- 37 מעלות לשעה.
  2. לשטוף את הצלחת 12-ובכן תרבות באמצעות 1 × פוספט סטרילי buffered תמיסת מלח (PBS).
  3. לאסוף 50 מ של דם אנושי באמצעות צינור מעכב הפארין.
  4. 6 מ של פתרון רב-סוכר הידרופילית מכניסים צינור 15 מ"ל ולהוסיף 8 מ של דם הפתרון הידרופילית רב-סוכר.
    הערה: לאט לאט pipette את הדם לתוך הפתרון הידרופילית רב-סוכר.
  5. Centrifuge את הצינור ב g x 1020 במשך 20 דקות הצניפה התאים.
  6. לקצור את שכבת תאים אטומים, להעביר צינור 15 מ"ל.
  7. להוסיף 10% סרום שור עוברית (FBS)-הכיל PBS ו centrifuge את הצינור ב 1020 g x 10 דקות הצניפה התאים.
  8. הסר את תגובת שיקוע והוסף מאגר פירוק תאי דם אדומים. לשמור על קרח למשך 5 דקות.
  9. להוסיף 10% FBS הכיל PBS, centrifuge את הצינור ב 1020 g x עבור 5 דקות כדי הצניפה התאים.
  10. הסר את תגובת שיקוע והוסף 10% FBS הכיל PBS. Centrifuge את הצינור ב 1020 g x עבור 5 דקות כדי הצניפה התאים.
  11. הסר את תגובת שיקוע והוסף 1 מ"ל של תאי אנדותל הרחבה בינונית בתוספת 10% FBS. זרע 8.0 × 106 תאים לכל טוב על כל מנה מצופים קולגן.
  12. לשנות את המדיום תרבות כל יום במשך שבוע. לאחר מכן, לשנות את המדיום תרבות כל יומיים.
    הערה: hECFCs ניתן למצוא לאחר תרבות יום 10-14. hECFCs להראות מורפולוגיה ריצוף דמוי טיפוסי ויוצרים מושבה אשר יכול להיות שנצפו בשלב ניגודיות מיקרוסקופ. Immunofluorescence מכתים קדהרין אנדותל כלי הדם (CD144), פקטור Willebrand פון (vWF) ניתן גם לבצע עבור אפיון hECFCs לאחר הרחבת תא נוסף.
  13. כדי לטפח את hECFCs, השתמש תא אנדותל הרחבה בינונית בתוספת 5% FBS ו פניצילין/streptavidin ב 37 מעלות צלזיוס באווירה humidified, המכילה 5% CO2. החלף את המדיום פעם ביום.
  14. לאחר hECFC אינדוקציה, לגדול תאי המעבר 7 לניסויים נוספים.

7. תא זריעה, תרבות על לוחות צבע Nanopattern

הערה: שלב 7 מתאר את התרבות של hECFCs בצלחת nanopattern מעבר צבע, אך מקורות אחרים תא גם יכול לשמש.

  1. מעיל צלחות nanopattern מעבר צבע עם 1 מ של 0.1% חלבון ציפוי פתרון PBS 10 דקות בטמפרטורת החדר.
    הערה: הציפוי 0.1% חלבון אינה מכסה את תכונות nanopillar.
  2. הפוך השעיה hECFCs מתוך קערה התרבות על ידי שיטה פיצול תאים סטנדרטית באמצעות טריפסין.
  3. לדלל התליה תא כדי להשיג את המפגש הרצוי. זרע את hECFCs על גבי צלחות nanopattern הדרגתיות ושליטה שטוח (למשל, 1.0 × 104 תאים/cm2).
    הערה: כאשר hECFCs הם נזרע-1.0 × 104 תאים/cm2 על לוחות צבע nanopattern, confluency תא בדרך כלל מגיע ל- 70-80% לאחר יומיים.
  4. התרבות התאים על לוחות שטוחים או מעבר צבע nanopattern 2 ימים בחממה.

8. התבוננות וניתוח

  1. סריקת הדמיה מיקרוסקופ אלקטרונים (SEM)
    1. תקן hECFCs תרבותי על לוחות שטוחים או מעבר צבע nanopattern עם 2.5% גלוטראלדהיד ב 4 ° C נלון.
    2. פנקו 1% אוסמיום ארבע-חמצני לשעה בטמפרטורת החדר. רחץ דגימות עם PBS.
    3. מייבשים דגימות עם ספירט אתיל מ נמוך כדי ריכוז גבוה (50%, 70%, 80%, 90% ו 100%) למשך 10 דקות לכל כל שלב.
    4. לטיפול hexamethyldisilazane (HMDS) למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, לשטוף דגימות עם HMDS טרי ולהשאיר דגימות מתחת למכסה המנוע fume לפחות יום אחד עד HMDS שאריות מתאדה לחלוטין.
    5. מעיל הדגימות עם coater לרעוד. להוציא פלטינה עבור 5 דקות ולבחון את הדגימות עם ב- SEM.
  2. הילוכים מיקרוסקופ אלקטרונים (TEM) הדמיה
    1. תקן hECFCs תרבותי על לוחות שטוחים או מעבר צבע nanopattern עם 2% paraformaldehyde ו- 2.5% גלוטראלדהיד תערובת ב- PBS ב 4 ° C נלון.
    2. לבצע קיבוע שאחרי מייבשים דגימות בשיטת ב 8.1.3 ושימוש 1% אוסמיום ארבע-חמצני.
    3. להטביע דגימות שרף אפוקסי. הפוך את 60 ננומטר הסעיפים עבה מבלוקים ולמקם מקטע על רשת TEM.
    4. כתם המקטע עם התערובת של 10 מ ג uranyl אצטט ב- 100 מ ל מתיל אלכוהול ו- 0.1 מ"ג עופרת ציטראט במים 100 מ ל מזוקק. להשיג תמונות עם TEM.
  3. קרינה פלואורסצנטית מכתים
    1. תקן hECFCs תרבותי על לוחות שטוחים או מעבר צבע nanopattern עם 4% paraformaldehyde בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.
    2. Permeabilize וחסום את דגימות עם עיזים 5% סרום ו- 0.1% octylphenol ethoxylate ב- PBS (PBST) בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
    3. דגירה בדגימות עם נוגדן העיקרי נגד vinculin (שבערך ב PBST) בטמפרטורת החדר במשך ה 2 דגימות שטיפה שלוש פעמים עם PBST.
    4. דגירה דגימות עם phalloidin מצומדת קרינה פלואורסצנטית (1:1, 000 ב- PBST), קרינה פלואורסצנטית מצומדת נוגדנים משניים (1:1, 000 PBST) בטמפרטורת החדר במשך ה 2 דגימות שטיפה שלוש פעמים עם PBST.
    5. דגירה בדגימות עם 4', 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי, 1:1,000, PBST) בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
    6. ירידה µL 10 של הרכבה בינונית על פני השטח של מעבר צבע nanopattern. מניחים את coverslip על המדיום הרכבה.
    7. למקם את הדגימה במהופך על הבמה לדוגמה, לרכוש תמונות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי זריחה.
  4. ניתוח תמונות
    1. העברת תמונות שנתפסו של hECFCs מערכת ניתוח התמונה.
    2. בחר את השדה אקראי של phalloidin מכתים את התמונה. התאם את הסף וליצור תמונה בינארית שבו תאים הם שונה מצבע הרקע.
    3. לצייר את קווי המתאר סביב התאים כדי למדוד את תא השטח וההיקף ידנית לספור את מספר filopodia לכל תא.
    4. בחר את השדה אקראי של vinculin מכתים את התמונה. התאם את הסף וליצור תמונה בינארית של אדהזיה מוקד אזורי.
      הערה: להתאים תמונה הסף כראוי כדי למנוע מלאכותי נגמר - או תחת - filling של אדהזיה מוקד אזורי.
    5. לספור את מספר מוקדי הדבקה של כל תא.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות


איור 1 מציג תמונות SEM של התבניות מפוברק AAO הדרגתיות בהתאם לסוג ולמיקום שלהם. איור 2 מציג תמונות SEM של צלחות nanopattern מעבר צבע עם nanopillars רגיל, מעוגל, איור 3 כימות הנתונים של הקוטר nanopillar. טבלה 1 מציגה את מאפייני nanopillars מפוברק.

איור 4A מציג את ערכת הטיפוח של דם, נגזר hECFC...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

ייצור של AAO לעיתים קרובות סובל פגמים כגון סדקים, צורות לא סדיר של הנקבוביות, וצריבה. הסיבה העיקרית פגמים אלה, נקרא פירוק אלקטרוליטי, אשר מושפע בחוזקה את אופי סובסטרטים מתכת להיות anodized, את resistivity של ה אלקטרוליט21. מאז resistivity של האלקטרוליט משתנה בהתאם לטמפרטורה שלה, סילוק חום ברציפות מן אלקטרודות היא נקודת קריטית כדי לשמור על הטמפרטורה locational של האלקטרוליט יציב במצב כזה מתח גבוה אילגון לפרופילי אלומיניום. ב פרוטוקול זה, אנחנו מפוברק AAO בתבניות על-ידי שינוי של מסודה שני שלבים anod...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על-ידי התוכנית מחקר מדעי בסיסי דרך לאומי מחקר קרן של קוריאה (ב- NRF) ממומן על ידי משרד החינוך, המדע, הטכנולוגיה (MEST) [ה-NRF-2015R1D1A1A01060397], ביו & פיתוח טכנולוגיות רפואיות תוכנית של ה-NRF במימון של משרד המדע, ICT ותכנון העתיד [ה-NRF-2017M3A9C6029563].

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
חומצה פרכלורית 60%כימיקלים של Daejung & מתכות6512-4100
אלכוהול אתילי, מוחלט 99.9%Daejung Chemicals & Metals4118-4100
חומצה זרחתית 85%Daejung Chemicals & מתכות6532-4400
מתיל אלכוהול 99.5%Daejung כימיקלים & מתכות5558-4400
תחמוצת כרום (VI)Daejung כימיקלים & מתכות2558-4400
חומצה גופרתית 95%Daejung כימיקלים & Metals7781-4100
מי חמצן 30%Daejung Chemicals & מתכות4104-4400
n-הקסאן 95%Daejung כימיקלים & מתכות4081-4400
טולואן 99.5%Daejung כימיקלים & מתכות8541-4400
(heptadecafluoro-1,1,2,2,-tetrahydrodecyl) ג'לסט דימתילכלורוסילןSIH5840.4רגיש ללחות
מתוקסינונאפלואורובוטן 99%464309סיגמא אולדריץ
Stemcell#4902
ג'לטיןסיגמא אלדריץ'G1890תמיסת
ציפוי חלבוןFicoll-PaqueGE Heathcare17-1440-03תמיסת פוליסכריד הידרופילית
EGM-2MVLonzaCC-3202מדיום הרחבת תאי אנדותל
פניצילין-סטרפטומיציןGibco15140-122
פוספט חוצץמלח Gibco10010031
סרום בקר עובריGibco12483-020
ParaformaldehydeSigma aldrichP6148
GlutaraldehydeSigma aldrichG5882-100ML
אוסמיום טטרוקסידSigma aldrich201030-1G
HexamethyldisilazaneSigma aldrich440191
Triton X-100Sigma aldrichX100-100MLאוקטילפנול אתוקסילט 
סרום עיזיםGibco26050-088
נוגדן ראשוני נגד וינקולין אנושי סיגמא אולדריץ'V9131
בדיקה F-actinבדיקות מולקולריותA12379פלואידין מצומד פלואורסצנטי
Alexa Fluor 488 מצומד נגד עכברים  נוגדן IgGבדיקות מולקולריותA11001נוגדן משני מצומד פלואורסצנטי 
4',6-דיאמידינו-2-פנילינדול Sigma aldrichD9542
מדיום הרכבהDAKOS3023
נוגדן ראשוני vWF אנטי אנושי DAKOA0082
אנטי אנושי  נוגדן ראשוני CD144 BD Biosciences#555661
Eponate 12 ™ ערכת הטבעה, עם BDMAטד פלה18012שרף אפוקסי
אורניל אצטט, 25 גרםטד פלה19481
עופרת ציטראט, טריהידרט, 10 גרםטד פלה19312
צלחת אלומיניום טהורה במיוחדGoodfellow26050-088
גיליון פוליסטירןGoodfellowST313120
8.0 אינץ' סילטרון29-01024-03צד יחיד מלוטש, 725 ומיקרו;
מייבש ואקום עבה מ', 4.4 ליטרKartellKA.230
משאבת ואקוםV3. ספק כוח VOP100
UnicorntechUDP-3003
מערבל מגנטיDaihan ScientificSL.
בוחש עיליDaihan HT120DX
סירקולטורDaihan מדעיWCR-P12
שלב נע ליניאריZaberA-LSQ300A-E01-KT07
סוגר זווית, 90 מעלותZaberAB90Mאביזר של מלקחיים PMP שלב נע ליניארי
, 145 מ"מVitlab67995פינצטה לא מתכתית
PTFE, 250 מ"לCowieCW007.25
מנקה אולטרסאונדברנסוןB2510MTH
חותך PCBHozan Tool תעשייתיK-110
Nanoimprint מכשירNanonexNX-2000
מחולל פלזמה חמצןFemto Scienceחמוד
מעקר בטמפרטורה נמוכהLowtemCrystal 50
CO2 חממהPanasonicMCO-18AC
מיקרוסקופ סריקת לייזר ConfoalCarl ZeissLSM700
מיקרוסקופ אלקטרונים סורקJEOLJSM6701
מיקרוסקופ אלקטרונים שידורהיטאצ'יH-7500
תמיסת קולגן ' SMS03022מדעי

מקורות

  1. Dalby, M. J., Gadegaard, N., Oreffo, R. O. Harnessing nanotopography and integrin-matrix interactions to influence stem cell fate. Nature materials. 13 (6), 558-569 (2014).
  2. Qian, W., Gong, L., Cui, X., Zhang, Z., Bajpai, A., Liu, C., Castillo, A., Teo, J. C., Chen, W. Nanotopographic Regulation of Human Mesenchymal Stem Cell Osteogenesis. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (48), 41794-41806 (2017).
  3. Naganuma, T. The relationship between cell adhesion force activation on nano/micro-topographical surfaces and temporal dependence of cell morphology. Nanoscale. 9 (35), 13171-13186 (2017).
  4. Han, J., Lin, K. H., Chew, L. Y. Study on the regulation of focal adesions and cortical actin by matrix nanotopography in 3D environment. Journal of Physics: Condensed Matter. 29 (45), 455101(2017).
  5. Liu, X., Wang, S. Three-dimensional nano-biointerface as a new platform for guiding cell fate. Chemical Society Reviews. 43 (8), 2385-2401 (2014).
  6. Turner, L. A., Dalby, M. J. Nanotopography-potential relevance in the stem cell niche. Biomaterials science. 2 (11), 1574-1594 (2014).
  7. Driscoll, M. K., Sun, X., Guven, C., Fourkas, J. T., Losert, W. Cellular contact guidance through dynamic sensing of nanotopography. ACS nano. 8 (4), 3546-3555 (2014).
  8. Yim, E. K., Darling, E. M., Kulangara, K., Guilak, F., Leong, K. W. Nanotopography-induced changes in focal adhesions, cytoskeletal organization, and mechanical properties of human mesenchymal stem cells. Biomaterials. 31 (6), 1299-1306 (2010).
  9. Davis, G. E., Senger, D. R. Endothelial extracellular matrix. Circulation research. 97 (11), 1093-1107 (2005).
  10. Nakayama, K. H., Surya, V. N., Gole, M., Walker, T. W., Yang, W., Lai, E. S., Ostrowski, M. A., Fuller, G. G., Dunn, A. R., Huang, N. F. Nanoscale patterning of extracellular matrix alters endothelial function under shear stress. Nano letters. 16 (1), 410-419 (2015).
  11. Bettinger, C. J., Zhang, Z., Gerecht, S., Borenstein, J. T., Langer, R. Enhancement of in vitro capillary tube formation by substrate nanotopography. Advanced materials. 20 (1), 99-103 (2008).
  12. Katz, B. Z., Zamir, E., Bershadsky, A., Kam, Z., Yamada, K. M., Geiger, B. Physical state of the extracellular matrix regulates the structure and molecular composition of cell-matrix adhesions. Molecular biology of the cell. 11 (3), 1047-1060 (2000).
  13. Deanfield, J. E., Halcox, J. P., Rabelink, T. J. Endothelial function and dysfunction. Circulation. 115 (10), 1285-1295 (2007).
  14. Tajima, S., Chu, J., Li, S., Komvopoulos, K. Differential regulation of endothelial cell adhesion, spreading, and cytoskeleton on low-density polyethylene by nanotopography and surface chemistry modification induced by argon plasma treatment. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 84 (3), 828-836 (2008).
  15. Mohiuddin, M., Pan, H. A., Hung, Y. C., Huang, G. S. Control of growth and inflammatory response of macrophages and foam cells with nanotopography. Nanoscale research letters. 7 (1), 394(2012).
  16. Kyle, D. J., Oikonomou, A., Hill, E., Bayat, A. Development and functional evaluation of biomimetic silicone surfaces with hierarchical micro/nano-topographical features demonstrates favourable in vitro foreign body response of breast-derived fibroblasts. Biomaterials. 52, 88-102 (2015).
  17. Seo, H. R., Joo, H. J., Kim, D. H., Cui, L. H., Choi, S. C., Kim, J. H., Cho, S. W., Lee, K. B., Lim, D. S. Nanopillar Surface Topology Promotes Cardiomyocyte Differentiation through Cofilin-Mediated Cytoskeleton Rearrangement. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (20), 16803-16812 (2017).
  18. Hwang, J. H., Lee, D. H., Byun, M. R., Kim, A. R., Kim, K. M., Park, J. I., Oh, H. T., Hwang, E. S., Lee, K. B., Hong, J. H. Nanotopological plate stimulates osteogenic differentiation through TAZ activation. Scientific Reports. 7 (1), 3632(2017).
  19. Bae, D., Moon, S. H., Park, B. G., Park, S. J., Jung, T., Kim, J. S., Lee, K. B., Chung, H. M. Nanotopographical control for maintaining undifferentiated human embryonic stem cell colonies in feeder free conditions. Biomaterials. 35 (3), 916-928 (2014).
  20. Cui, L. H., Joo, H. J., Kim, D. H., Seo, H. R., Kim, J. S., Choi, S. C., Huang, L. H., Na, J. E., Lim, I. R., Kim, J. H. Manipulation of the response of human endothelial colony-forming cells by focal adhesion assembly using gradient nanopattern plates. Acta biomaterialia. 65, 272-282 (2017).
  21. Lee, W., Park, S. J. Porous anodic aluminum oxide: anodization and templated synthesis of functional nanostructures. Chemical reviews. 114 (15), 7487-7556 (2014).
  22. Masuda, H., Fukuda, K. Ordered metal nanohole arrays made by a two-step replication of honeycomb structures of anodic alumina. science. 268 (5216), 1466(1995).
  23. Masuda, H., Satoh, M. Fabrication of gold nanodot array using anodic porous alumina as an evaporation mask. Japanese Journal of Applied Physics. 35 (1B), L126(1996).
  24. Zaraska, L., Sulka, G. D., Jaskuła, M. The effect of n-alcohols on porous anodic alumina formed by self-organized two-step anodizing of aluminum in phosphoric acid. Surface and Coatings Technology. 204 (11), 1729-1737 (2010).
  25. Yang, K. Y., Kim, J. W., Byeon, K. J., Lee, H. Selective deposition of the silver nano-particles using patterned the hydrophobic self-assembled monolayer patterns and zero-residual nano-imprint lithography. Microelectronic engineering. 84 (5), 1552-1555 (2007).
  26. Park, B. G., Lee, W., Kim, J. S., Lee, K. B. Superhydrophobic fabrication of anodic aluminum oxide with durable and pitch-controlled nanostructure. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 370 (1), 15-19 (2010).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

ייצור של מעבר צבע Nanopattern על ידי טכניקת Nanoimprinting תרמית והקרנת התגובה של תאים אנושיים המושבה יוצרי אנדותל
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.