מאמר זה מתאר פרוטוקול עבור ex-vivo סידן הדמיה של המוח דרוזופילה . בשיטה זו, תרכובות טבעי או סינתטי ניתן להחיל את המאגר כדי לבחון את היכולת שלהם להפעיל את המסוים הנוירונים במוח.
מאמר שיטה
מאמר זה מתאר פרוטוקול עבור ex-vivo סידן הדמיה של המוח דרוזופילה . בשיטה זו, תרכובות טבעי או סינתטי ניתן להחיל את המאגר כדי לבחון את היכולת שלהם להפעיל את המסוים הנוירונים במוח.
עוגב-כדי-איבר תקשורת על-ידי איתות האנדוקרינית, לדוגמה, מהפריפריה למוח חיונית על שמירה על הומאוסטזיס. כחיה דגם למחקר האנדוקרינית, דרוזופילה melanogaster, אשר מורכבת גנטי כלים ומידע הגנום, משמשת יותר ויותר. מאמר זה מתאר שיטת ההדמיה סידן של explants המוח דרוזופילה . שיטה זו מאפשרת זיהוי ישיר באיתות של הורמון במוח. זה ידוע כי רבים פפטיד ההורמונים לפעול דרך G-חלבון בשילוב קולטנים (GPCRs), הפעלת אשר גורמת לעלייה בריכוז2 +Ca תאיים. הפעלה עצבית גם מגביה תאיים Ca2 + רמות, Ca2 + זרם והן על שחרורו של Ca2 + המאוחסן תוך-פלזמית (ER). חיישן סידן, GCaMP, באפשרותך לפקח על Ca2 + שינויים אלה. בשיטה זו, GCaMP מתבטאת הנוירונים עניין, וה -המוח זחל GCaMP-לבטא ביתר תרבותי ex-vivo. מבחן פפטיד מחילה על explant המוח, שינויים פלורסנט GCaMP מזוהים באמצעות ספינינג דיסק מיקרוסקופ קונפוקלי מצויד with a מצלמה CCD. באמצעות שיטה זו, ניתן לבחון את כל מולקולה מסיסים במים, הסלולר אירועים שונים הקשורים עם הפעלה עצבית יכולה לדימות באמצעות האינדיקטורים פלורסנט המתאים. יתר על כן, על-ידי שינוי התא הדמיה, ניתן בשיטה זו לשיקוף איברים דרוזופילה אחרים או האברים של בעלי חיים אחרים.
עוגב-כדי-איבר תקשורת היא אסטרטגיית אבולוציונית שנשמרת על שמירה על הומאוסטזיס להתמודד עם שינויים סביבתיים. בבני אדם, מגוון רחב של הורמונים arereleased של בלוטות אנדוקריניות למחזור. רבים של הורמונים אלה יעד ההיפותלמוס במוח, אשר מווסת תהליכים מטבוליים והתנהגויות יסוד כגון האכלה1,2. הורמונים רבים כבר גילו באמצעות מודלים בתרבית. עם זאת, מנגנוני הפעולה שלהם, במיוחד הרשתות interorgan בהם הם משתתפים, נותרו בלתי ברורים במידה רבה.
דרוזופילה melanogaster התפתחה מודל שימושי עבור לימוד אורגן-כדי-איבר תקשורת. בחרקים, תהליכים פיזיולוגיים רבים נשלטים על ידי הורמונים. לימודי התמקדות צמיחה ו....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
1. הכנת המוח זחל Explants
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
באמצעות פרוטוקול זה, נבחן את ההפעלה של מייצרי אינסולין תאי המוח (IPCs) על ידי הורמון פפטידי, CCHa2. IPCs של המוח פראי-סוג הודבקו תוויות עם GCaMP6s באמצעות שילוב של dilp2 -GAL412 (מתנה רוליפסון ד ר), UAS-GCaMP6s13 (מתנה ד ר קים). Explants המוח זחל שטופלו פפטיד CCHa2 סינתטי, הוקלט על ידי קרינה פלואורסצנטית מ- GCaMP6s בזמן אמת. בניסוי זה, תמונות, התקבלו מוקד מטוס בודד. כל אשכול IPC מכילה תאים בסביבות 1414
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
Ca2 + הדמיה בשיטה המתוארת כאן היא מערכת שימושית לבדיקה את הפונקציה של הורמונים במוח. אין ויוו, המוח מקבל הורמונים של האורגנים האנדוקרינית. בנוסף, המוח רואה כל הזמן עולה המידע החושי, הגורמת הפעלה עצביים ספונטנית. מערכת זו שמחוץ מבטל רעש נורא ותשואות יחס אות/רעש טוב יותר מאשר ויוו הדמיה. במערכת זו, ניתן לבדוק מולקולות ביחידים או במשולב. בנוסף פפטיד ההורמונים, כל מולקולות מסיסים במים, כולל תרכובות טבעיים או סינתטיים, ניתן ליישם את explant במוח.
עבור Ca2 .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
המחברים אין לחשוף.
עבודה זו היה נתמך על ידי Grants-in-Aid למחקר מדעי (15K 07147, 17K 07419) מ- JSPS (כדי הירושי Ishimoto, סנו לובה פריז), על Inamori קרן המחקר מענק (איץ ' אי), ואת התוכנית של המרכז השימוש/מחקר משותף ללימודי רפואה התפתחותית, ב המכון אמבריולוגיה מולקולרית, גנטיקה, קאמאמוטו אוניברסיטת (HS). אנו מודים ד ר אזוסה Kamikouchi, מר דאיצ'י יאמאדה לעזרה שלהם באמצעות מערכת הדמיה.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| מערכות מוט טונגסטן | A-M, Sequim, WA, ארה"ב | 717000 | |
| Blu Tack | Bostik, פריז, צרפת | 3049100 | דבקים לשימוש חוזר דמויי שפכטל |
| שעון, מרובעת, 1 5/8 | בחברת האספקה הביולוגית של קרוליינה, ברלינגטון, קרוליינה הצפונית, ארה" | 742300 | |
| PBS | TAKARA Bio Inc., Kusatsu, Shiga, יפן | T900 | מלחים חוצצים פוספטים |
| CCHa2 | SCRUM Inc., טוקיו, יפן | פפטיד מסונתז Custum | |
| Ghrerin | Peptide institute Inc., אוסקה, יפן | 4372-s | |
| Nociceptin | Peptide institute Inc., אוסקה, יפן | 4313-v | |
| Axio Imager A2 | Carl Zeiss, Oberkochen, גרמניה | Axio Imager A2 | מיקרוסקופ פלואורסצנטי |
| Objective W N-Achroplan 20x/0.5 M27 | Carl Zeiss, אוברקוכן, גרמניה | 420957-9900-000 | עדשת אובייקט טבילה במים |
| P-725 PIFOC סורק אובייקטיבי עם טווח נסיעה ארוך | Physik Instrumente GmbH & Co. KG, קרלסרוהה, גרמניה | N/A | המופעלת על ידי פיזואלקטרי |
| CSU-W1 | תאגיד החשמל יוקוגאווה, טוקיו, יפן | CSU-W1 | ראש קונפוקלי דיסק מסתובב |
| ImagEM C9100-13 | Hamamatsu Photonics, סיזואוקה, יפן | C9100-13 | EM-CCD מצלמה |
| OBIS 488 ננומטר LS 60 mW | קוהרנטי, סנטה קלרה, קליפורניה, ארה"ב | 1178770 | לייזר 488 ננומטר 488 |
| /568/647 ננומטר מפצל קרן דיכרואי יוקוגאווה | סמרוק, רוצ'סטר, ניו יורק, ארה"ב | Di01-T405/488/568/647-13x15x0.5 | מפצל קרן דיכרואי |
| 528/38 ננומטר BrightLine מסנן פס פס יחיד | סמרוק, רוצ'סטר, ניו יורק, ארה"ב | FF01-528/ 38-25 | מסנן פליטה |
| ומיקרו; מנהל | Open Imaging, Inc. | N/A | https://micro-manager.org |
| ImageJ | U.S. המכונים הלאומיים לבריאות | N/A | https://imagej.nih.gov/ij/ |
| TurboReg | Philippe Thé venaz, קבוצת הדמיה ביומדיקלית, המכון הטכנולוגי הפדרלי השוויצרי לוזאן | N/A | http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/ |
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה
בקש הרשאה