הקלטה במרחב מוגבל תנודות בהיפוקמפוס מתנהגים באופן עכברים

תנודות ב- LFP מעורבים באופן ביקורתי מידע עיבוד על ידי מעגלים עצביים. הם מכסים מגוון רחב של תדרים, ועד גלים איטיים (~ 1 Hz) ריפל במהירות תנודות (~ 200 Hz)¹. תדירות ברורים להקות הקשורים עם תפקודים קוגניטיביים, כולל זיכרון, עיבוד רגשי של ניווט^2,3,4,5,6,7. הזרימה הנוכחית מעבר ממברנות עצביים מהווה את החלק הגדול ביותר של האות LFP⁸. קטיונים הזנת התא (למשל באמצעות הפעלה של הסינפסות סינאפסות glutamatergic) מייצגים כיור הנוכחי פעיל (כמו תשלום משאיר המדיום חוץ-תאית). לעומת זאת, זרימה נטו של מטען חיובי למדיום חוץ-תאית, למשל על-ידי הפעלה של GABAergic הסינפסות מעכבות, מתארת מקור הנוכחי פעיל במיקום זה. ב הדיפולים עצביים, כיורים הנוכחי ניתן לזווג עם מקורות סביל ולהפך עקב קיזוז הזרמים המשפיעים על קרום תשלום באתרים מרוחקים.

השדה החשמלי שנוצר על-ידי תהליכים עצביים מרחוק יכול גם לגרום מתח ניכר deflections על אלקטרודה הקלטה, עשויות ובכך באופן כוזב להיחשב כאירוע מקומי. הולכה נפח זה מהווה אתגר רציני הפרשנות של אותות LFP. ניתוח CSD מספק מידע אודות כיורים הנוכחי מקומיים ומקורות שבבסיס LFP אותות ולכן כוללת אמצעים כדי להפחית את ההשפעה של אמצעי האחסון הולכה⁸. במבנים למינציה כמו ההיפוקמפוס, ניתן לקבל אותות CSD חד-ממדי הנגזרת המרחבית השנייה של LFP להקליט מ קו מקביל אלקטרודות המסודרים בניצב מטוסים למינריות⁹. כניסתו של הגששים סיליקון ליניארי זמינים מסחרית אפשרה לחוקרים לנצל את השיטה CSD לצורך המחקר של תנודה המקומי פעילות ההיפוקמפוס. לדוגמה, זה הוכח כי תנודות גמא ברורים להגיח באופן ספציפי שכבה באזור CA1¹⁰. יתר על כן, ניתוח CSD זיהה עצמאית נקודות חמות של פעילות גמא בשכבה התא העיקרי של הפיתול משוננת¹¹. חשוב לציין, ממצאים אלה היו רק לכאורה CSD המקומי, אבל לא LFP אותות. ניתוח CSD ובכך מספק כלי רב עוצמה כדי לקבל תובנה בפעולות microcircuit של ההיפוקמפוס.

ב פרוטוקול זה, אנו מספקים מדריך מקיף כדי לקבל אותות CSD חד-ממדי עם סיליקון הגששים. שיטות אלה יאפשר למשתמשים לחקור אירועים תנודה מקומי בהיפוקמפוס של עכברים להתנהג.

כל השיטות המערבות בעלי חיים החיים אושרו על-ידי פרייבורג Regierungspräsidium לפי חוק רווחת בעלי חיים גרמנית.

1. תכשירים

1. לתכנן ולבנות כלי הכניסה המתאים transiently נושאת את החללית הסיליקון ואת המחבר אלקטרודה במהלך תהליך ההשתלה. לקבלת כלי מותאם אישית הכניסה בנוי דוגמה, ראה איור 1 .
2. בזהירות לשחרר את הסיליקון החללית ואת אלקטרודה מחבר מאריזתו באמצעות מלקחיים שקצהו קרמיקה.
3. הרם את לוח מחבר, בצורה מאובטחת לתקן אותו עם מלחציים תנין המצורפת עמדה.
4. שימוש של סטריאוסקופ, יישר את המכשיר בעזרת הכלי הכניסה עם מלקחיים שקצהו קרמיקה. למרוח שכבה ~ 2 מ מ של פרפין שעווה מומסת עם cauterizer להדביק את החללית ההכנסה לכלי. הקפידו לא נוגעים של שנקס בדיקה במהלך הליך זה.
5. לתקן את מחבר אלקטרודה מוט של הכלי ההכנסה באמצעות דבק רגיל. שימו לב כי בהתאם ליצרן, חוטים הקרקע שאולי צריך להיות מולחמים את לוח מחבר אלקטרודה לפני ההשתלה. הסר את הבידוד של שני קטעים קצרים של חוטי נחושת בידודי לכה באמצעות פח-הלחמה להחיל עם מלחם (400 מעלות צלזיוס). הלחמה החוטים הקרקע כדי החריצים המתאימים בלוח מחבר אלקטרודה.
6. הסר את הבידוד של שני חלקים נוספים של חוטי נחושת. לעטוף כל חוט נחושת חשוף שלוש פעמים סביב בורג פלדה אל חלד (בקוטר 1 מ"מ, 2 מ מ אורך). החל שטף מתאים הלחמה פלדה, הלחמה חוט הנחושת לחלק התחתון של הכיפה בורג. לוודא כי בתחתית חצי מהשרידים חריטה ללא פח-הלחמה.
7. השתמש multimeter רגיל כדי לבדוק קשר חשמלי בין חוט בורג.
8. לחטא את שאנקס של החללית סיליקון, את הברגים הקרקע על ידי טבילה 70% אתנול (10 s).
9. להכין כיסוי מגן השתל בדיקה על ידי חיתוך ראש פלסטיק פסטר פיפטה לשניים.

2. ניתוח ההשתלה

1. לחטא כלי כירורגי (מספריים, מלקחיים שקצהו פיין, מלחציים כירורגי) עם מעקר חרוז חם. למחוק את כל המשטחים עם 70% אתנול.
2. לגרום הרדמה עם איזופלוריין 3% חמצן וכשאשר L ~ 1/min.
   1. לשימוש תחזוקה, 1-1.5% איזופלוריין. שימו לב כי ריכוז איזופלוריין הדרוש להשגת עמידות כירורגי יכול להשתנות חיה חיה.
   2. סובלנות כירורגי יציב מושגת כאשר החיה מצליח להגיב צובט את הבוהן. את קצב הנשימה של העכבר ולהתאים את ריכוז איזופלוריין במידת הצורך.
   3. להחיל משחה לעיניים של החיה כדי למנוע ייבוש.
3. לטעון את העכבר בתוך מסגרת stereotaxic בהוספת סורגים האוזן בעדינות לתוך תעלת האוזן. לאחר בראש של העכבר מתייצב בסורגים האוזן, הצב חתיכה הפה מעל החוטם למסירה איזופלוריין מתמשך. הצב את העכבר על מגבת או כרית מעל כרית החימום ולהזריק. הבופרנורפין subcutaneously (0.05 - 0.1 מ"ג/ק"ג משקל גוף) כדי להבטיח נגד כאבים לאחר הניתוח.
4. לגלח את הראש מכונת הגילוח סטנדרטי, לחטא את העור עם 70% אתנול. באמצעות מספריים כירורגיים, בחתך לתוך העור לאורך הקו האמצעי של הגולגולת ופתח את העור בעזרת תופסנים כירורגי.
5. יישור ראש החיה בעזרת כלי היישור stereotaxic כדי bregma ברמה של למדא. צריך להיות פחות מ- 50 מיקרומטר בהיסט גובה בין bregma למדא. יתר על כן, רמת הראש לאורך הציר mediolateral על ידי מדידת העומק של bregma-הגולגולת על פני השטח-מוגדרים מרחקים ימינה ושמאלה (למשל, 1 מ מ שמאל ואת הזכות של bregma). כיוון ההטיה של הראש במידת הצורך.
6. לנקות את הראש עם 3% חמצן, לנגב היבש עם מגבונים סטריליים כותנה.
7. לקבוע את המיקום של הניתוח ביחס bregma שימוש הולם אטלס stereotaxic¹².
8. באמצעות ראש המקדחה 0.9 מ מ, תרגיל שני חורי הברגים העצם על המוח הקטן למיקום הברגים הקרקע והפניה. בנוסף, 1-3 חורים עגינת הברגים הם רצוי לייצב את השתל. המיקום של ברגי עיגון יהיה תלוי המיקום של הניתוח. עבור ההשתלה בהיפוקמפוס אל הצב בורגי עיגון מעל קליפת חזיתית הקודקוד ואת חולשת contralateral. הכנס את הברגים העצם באמצעות מברג מתאים. הקפידו לא לחדור לתוך המוח.
9. לבצע את הניתוח על ידי דילול לאט את הגולגולת עם התרגיל באזור מלבני מהצד השרשה. לעתים קרובות להרטיב את העצם עם מאגר פוספט סטיריליים (PB). הגולגולת ורקמת הנותרים יכולים להיות בעדינות פירסינג והוציאו בעזרת מחט ההזרקה (27 גרם) בסדר גמור וזוג פינצטה.
10. בזהירות פירס קרום הדורה עם מחט דקה של הזרקה (27 גרם). טופס קרס קטנה על-ידי כיפוף קצה המחט עם זוג מספריים ומשוך את דורא להסרת. החל PB כדי למנוע את פני השטח של המוח ממנו להתייבש.
11. הר הכלי ההכנסה אלקטרודה על בעל stereotaxic, אפס את המכשיר על bregma, וזוזי החללית לקואורדינטות stereotaxic הניתוח אט-אט לחדור את פני השטח של המוח. ודא שהמוטות בדיקה לא מתכופף. הימנע להשתיל דרך כלי הדם.
12. הורידו לאט את המכשיר עד מיקרומטר ~ 200 מעל העומק הרצוי. מכסים את הגולגולת ואת שאנקס של המכשיר סיליקון עם וזלין סטיריליים להגנה. החל מלט שיניים כדי לתקן את הבסיס של המכשיר כדי הבורג עגינת בגולגולת.
13. מיד לאחר יישום מלט, לאט הניעו את החללית אל העומק היעד. קידום של מיקרומטר אחרונה 200 ~ לאחר היישום של הצמנט מפחית לרוחב תנועת החללית ומבטיחה נזק מינימלי לרקמות באזור המטרה. שימו לב כי הזמן ריפוי של הבטון המשמש יכול להשפיע על שלב זה של הפרוטוקול. עם במהירות ריפוי מלט, להשמיט את שלב זה, ישירות שתל החללית לעומק היעד כדי למנוע נזק החללית סיליקון.
14. לאחר ריפאה הבטון, שחרר את החללית של הכלי הכניסה על ידי המסת השעווה עם cauterizer.
15. לשחרר את לוח מחבר מהמכשיר ההכנסה והצב אותו למקום מתאים על הגולגולת באמצעות מלחציים תנין מחוברת ידית ההכנסה. במקרה של בדיקה ההשתלה בהיפוקמפוס אל המקום את לוח מחבר על בדופן העצם contralateral. לתקן את לוח מחבר לגולגולת באמצעות מלט שיניים.
16. הלחמה את החוטים הקרקע והפניה של הלוח מחבר לרדיו המצורפת את שני הברגים על המוח הקטן.
17. לקצץ את מכסה מגן בגובה הנכון ומניחים אותו מעל החללית סיליקון. לתקן את מכסה לוח מחבר ואת הגולגולת באמצעות מלט שיניים, הימנעות העור סביב הגולגולת חשוף. תפירת העור סביב אתר ההשתלה בדרך כלל לא נדרש.

3. ההחלמה לאחר הניתוח

1. החל הטיפול המתאים להרגעה לפחות 2 ימים (למשל זריקות תת עורית של הבופרנורפין כל 6 שעות במהלך היום, במי השתייה בן לילה בשילוב עם carprofen (4-5 מ"ג/ק"ג משקל גוף) subcutaneously כל 24 שעות). יחיד-דיור מומלץ כדי למנוע נזק השתל.
2. אפשר לפחות שבוע להתאוששות. התייעץ עם הנחיות רווחת בעלי חיים מקומיים.

4. קירור והקפאה

1. LFPs שיא לנוע בחופשיות עכברים באמצעות מערכת רכישת נתונים מתאימים מחוברים דרך קומוטטור. לרכוש LFPs, השתמש תדר דגימה של 1-5 קילו-הרץ. שיעור דגימה גבוה יותר (20-30 kHz) נדרשים אם יחידה אחת הפרשות שיירשמו יחד עם LFP.
2. לאחסן קבצי raw הקלטה של והערוצים לניתוח במצב לא מקוון.

5. היסטולוגיה

1. לאחר השלמת ההקלטה, עמוק עזים ומתנגד החיה (למשל 2 g/kg הגוף משקל urethane מוזרק intraperitoneally). לאשר המדינה הרדמה על ידי חוסר תגובה שאורך צובט.
2. Perfuse transcardially את העכבר עם קרח באגירה פוספט תמיסת מלח (~ 1 דקות) ואחריו 4% paraformaldehyde (~ 10 דקות) באמצעות שיטות זלוף intracardial תקן¹³. לפני זלוף, lesioning electrolytic האתרים הקלטה אולי על ידי שבוצעה (למשל על-ידי החלת 10-20 V של מתח מתמיד עד 1 s). לחלופין, צבעי פלורסנט חלה על העצות shank לפני ההשתלה יכול לשמש כדי לעקוב אחר זיהוי. בדיקות בשיטות שונות לצורך זיהוי עמדות אלקטרודה כדי להשיג תוצאות אופטימליות עם סוגים שונים של סיליקון הגששים מומלץ.
3. לחתוך חלקים במוח (~ 100 מיקרומטר) ו מכתים את הפרוסות עם 4'-6-diamidino-2-phenylindole (דאפי, µg 1/mL) ואחריו שלושה צעדים כביסה ב PB (כל 10 דקות בטמפרטורת החדר).
4. במקום הסעיפים על שקופית מיקרוסקופ, להחיל טיפה של הטמעת בינונית ולכסות המקטע עם מכסה. תן את ההטבעה לילה יבש בינוני בטמפרטורת החדר.
5. באמצעות epifluorescence או מיקרוסקופ קונפוקלי סריקה בלייזר, לזהות את המיקום של האתרים הקלטה.
6. ניסיון שחזור של המכשיר סיליקון להמשך השימוש, להחזיק את המכשיר עם מלחציים תנין ולשחרר את המכשיר מ לחתור בהתכה בקפידה את הבטון שיניים במלחם (400 מעלות צלזיוס). הקפידו לא נוגעים של שנקס בדיקה במהלך הליך זה!
7. לשטוף את המכשיר במים מזוקקים חם (~ 80 מעלות, 15 דקות) ואחריו פתרון אנזימטי (1% Tergazyme במים מזוקקים, 30 דקות בטמפרטורת החדר) וצעד נוסף כביסה במים מזוקקים (15 דקות). שימו לב כי שיעור ההצלחה של בדיקה התאוששות נמוך.

6. CSD ניתוח

1. באמצעות סביבת ניתוח מתאים (למשל פיתון), המרת הנתונים LFP של shank בודדים כדי CSD על ידי קירוב הנגזרת המרחבית השנייה לאורך הדוקרן כמו
   
   איפה LFP_{n, t} הוא האות LFP על האלקטרודה^th nבזמן t וδz המרווח בין אלקטרודה. שים לב כי עקב n-1 פעולות n+1, CSD של האלקטרודות הראשון והאחרון של הדוקרן ניתן לאמוד, אשר צריכה להילקח תחת שיקול במהלך בדיקה השמה. ליישם את הנוסחה קירוב באמצעות קטע קצר של קוד מחשב את האות CSD עבור כל אלקטרודה תוך איטראציה לאורך זמן (ראה קובץ קוד משלים).
2. השתמש את האות CSD שהושג עבור ניתוח נוסף (למשל, לומדת תדר מסוים להקות של תנודות המוח על-ידי החלת הלהקה לעבור מסננים).

איור 1 מדגימה את הכלי ההכנסה שימוש עבור ההשתלה של הגששים סיליקון. הקלטות סיליקון כרוני מושתל רגשים פילוח האזור CA1, השכבה תא גרגר של הכישור משוננת מוצגים באיור2. הקלטנו LFPs מ שאנקס בדיקה במהלך תנועה חופשית ב homecage. כדי למזער את ההשפעה של אמצעי האחסון הולכה, האותות שהושג היו המרה CSD לאורך כל shank של המכשיר (איור 2Bיח). בדוגמה הראשונה המוצגת באיור 2B, שארפ-גל אחד אדווה אירועים מוביל כיור הנוכחי בולט בשכבה radiatum של CA1. בדוגמה השניה המוצגת באיור 2C-E, הקלטנו שני אתרי ברורים בשכבה תא גרגר של הכישור משוננת (מרחק לרוחב 400 מיקרומטר). הלהקה גבוהה-גמא היתה מבודדת על ידי החלת מסנן bandpass Hz 60-80 לאות CSD, חשיפת התפרצויות גמא מקומיים על אחד משני האתרים הקלטה ממוקם השכבה תא גרגר (איור דו-ממדי; הקלטה אדום באתר). שימו לב הפעילות תנודה גמא המקומי יכול להתגלות רק לאחר המרה של האות המוקלט CSD (איור דו-ממדי, נכון). איור 2E מראה פרקי זמן נפרד של ההקלטה זהה, שבמהלכו הגמא תנודות על שני האתרים הקלטה נבדלים שלהם שלב (איור 2E, שמאלה) או משרעת (איור 2E, התיכון). הדוגמה הימניות מציגה בתקופה של פעילות גמא מסונכרנות בבשני האתרים הקלטה. דוגמאות אלה ממחישים כי ניתוח CSD הוא מסוגל לבודד את פעילות מקומית לא רק בממד של ניתוח, אלא גם בכיוונים ניצבים. כדי להמחיש עוד יותר את הרעיון המרכזי הזה, אנחנו המודל ניסוי עם מכשיר בדיקה סיליקון בהיקף של שני שאנקס (I ו- II) עם חמישה אתרים הקלטה, כל השוואה על פי התוצאות באיור 2. במודל שלנו, רכב הגישוש. מושתל בתוך הפיתול משוננת תנודה גמא המקומי המתעוררים בשכבה תא גרגר ליד ההקלטה אתר 4 shank אני (איור 3). בהנחה הולכה נפח הומוגנית ברחבי הרקמה, תנודה המקומי תוקלט ב LFP-כל האתרים האחרים הקלטה בגירסה משרעת-מסוננים (איור 3C). עם זאת, ביצוע ניתוח CSD לאורך שני שאנקס בבירור מבודד מיקומה של דור גמא (דמות תלת-ממד). יתר על כן, קטן המרחק בין אתרים הקלטה על הדוקרן אותו, קטן יותר crosstalk בין CSD מאותת על השכנה שאנקס (איור 3EF).

איור 1: תמונה של הכלי ההכנסה. החללית סיליקון מחובר לפין חרקים דבוקים אל בסיס מלחציים תנין. ניתן להוסיף מוט של המחזיק תחמן מיקרו stereotaxic להשתלה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 2: נציג מתוצאות ניתוח CSD בהיפוקמפוס. A: מערך אלקטרודה המורכבת בדיקה סיליקון ארבע-shank (shank ריווח 400 מיקרומטר, אלקטרודה מרווח בין 100 מיקרומטר, אלקטרודות 8/shank) היה מושתל לתוך ammonis cornu אזור 1 (CA1). שאנקס A-C טרוורס שכבה oriens (o), שכבה pyramidale (p) ו שכבה radiatum (r). HF: פיסורה בהיפוקמפוס. די. ג'י: משוננת הפיתול. B: LFP (עקבות שחור), CSD (בצבעים) של שאנקס שלושה ב CA1 במהלך אפוק 200 ms המכיל גל שארפ ספונטנית אדווה אירועים. הערה לכיור הנוכחי בולט בשכבה radiatum. LFP סולם בר: 2 mV. C: דוגמה של בדיקה סיליקון הקלטה מ די. ג'י. שאנקס A ו- B לחדור את די. ג'י. CA3: אזור ammonis cornu 3. נגעים electrolytic בוצעו לאחר ההקלטה לסמן מסלולים אלקטרודה. D: ציור שנקס אלקטרודה ביחס האנטומיה בהיפוקמפוס. LFP הקלטה משני במרחב אתרים מופרדים בשכבת תאים גרגר (אדום וכחול הקלטה באתר) עולה כי הגמא תנודות (60-80 Hz) מסונכרנות בין שני האתרים (משמאל). עם זאת, CSD אותות של מרווח הזמן אותו לחשוף גמא מוקד "נקודה חמה" מוגבלת לאתר ההקלטה האדום (מימין). אותות CSD בשני האתרים הקלטה נמשכים-באותו הסולם. E: אותות CSD אבל לא LFP לזהות תקופות של שלב (משמאל) ו משרעת asynchrony (באמצע) בין שני האתרים הקלטה. התקופה מימין מראה של תקופה קצרה של פעילות גמא מסונכרן. עקבות בתחתית להמחיש את ההבדל שלב (Δ-שלב ברדיאנים) ואינדקס ההבדל משרעת (Ampl. אינדקס, המוגדר כהפרש משרעת בין שני האתרים הקלטה מחולק בסכום amplitudes בכל נקודה בזמן עם מגוון מ-1 ל- 1) עבור LFP (אפור), CSD (שחור) עקבות. כל שלוש דוגמאות 30 ms התרחשה במרחק 400 גב' לוחות C ו- D וארוך מותאמים מ. ואח 2017 Strüber11 תחת Creative Commons (https://creativecommons.org/Licenses/by/4.0/). אותות CSD בשני האתרים הקלטה נמשכים-באותו הסולם בחלונית נפרדים לכל. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 3: מודל הניסוי עם תנודה מדומה 40 הרץ מוקד בשכבה תא גרגר הפיתול משוננת. A: בדיקה סיליקון דגם עם שני שאנקס ממרחק של Dshank = 400 מיקרומטר, חמישה אתרים הקלטה ממוקם במרחקים של Dאלקטרודה = 100 מיקרומטר ימוקם הכישור משוננת. B: לצד הקלטה אתר 4 shank, תנודה-40 הרץ מוקד הוא מדומה כמו גל sinusoidal בתוספת גאוסיאנית רעש לבן. באתרים אחרים, מושרה רעש בלבד. פרמטרים: גמא משרעת: 1 mV; סטיית התקן של רעש: 0.05 mV; רזולוציה טמפורלית: 10 קילו-הרץ. C: אנחנו המודל השפעת משרעת-סינון נפח הולכה דרך שטח חוץ-תאית בצורה פשוטה כמו דעיכה מעריכית שלילי של גמא amplitudes עם רקמת רווח קבוע של 500 מיקרומטר. הפרמטרים המדויק כראוי המתאר את התפשטות אותות LFP הלטראלי הם שנוי במחלוקת14. עם זאת, ההערכה שלנו מתאים היטב על נתונים של מחקר15קוהרנטיות תנודה גמא neocortical. ב LFP וכתוצאה מכך, תנודה במקור מוקד כוללת מספר אתרים הקלטה. D: לאחר ביצוע הניתוח CSD לאורך המוטות בודדים באמצעות המשוואה CSD נתון, תנודה מוצג רק במיקום המקורי. E: כוח ניתוח ספקטרלי צפיפות LFP (משמאל, אדום) וכן שרידים CSD (נכון, כחול) של הקלטה באתרי shank 4 (קו מנוקד) I ו- II (קו רציף). שימו לב כי ניתוח CSD מבודד כראוי את תנודה 40 הרץ מקומיים-shank שתוך LFP האות מכיל פעילות תנודה כמנצח נפח משמעותי shank II. PSD והניתוח נעשה שימוש בפונקציה pwelch של MATLAB. F: הגדלת המרחק בין הקלטות באתרי שאנקס בודדים 400 תוצאות מיקרומטר יכולת מופחתת של ניתוח CSD לבודד את מוקד הפעילות. סימולציה וניתוח בוצעה באמצעות MATLAB 7.10. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

המחברים אין לחשוף.