הכנת לפתח רקמות היקפיים חוש הריח עבור מולקולרית וניתוח Immunohistochemical ב דרוזופילה

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול שלב ומנתחים לפתח חוש הריח רקמות ממינים דרוזופילה . הרקמה ביתור מאוחר יותר ניתן להשתמש עבור ניתוחים מולקולריים, כגון כמותיים RT-PCR (הפוך תמלול-תגובת שרשרת פולימראזית) או RNA רצף (RNAseq), כמו גם ניתוחים ויוו כגון אימונוהיסטוכימיה או בחיי עיר הכלאה.

Abstract

מערכת הריח של דרוזופילה הוא בשימוש נרחב מערכת הנוירו-ביולוגיה התפתחותית, מערכות neuroscience, כמו גם נוירופיזיולוגיה, התנהגות ו אבולוציה התנהגותית. רקמות חוש הריח דרוזופילה בית הנוירונים קולטני ריח (ORNs) לזהות סימנים כימיים נדיפים בנוסף הידרו - ו התרמו-החישה הניריונים. ב פרוטוקול זה, אנו מתארים את הקרע לפתח רקמות היקפיים חוש הריח של המין דרוזופילה למבוגרים. ראשית נתאר כיצד שלב גיל דרוזופילה הזחלים, ואחריה את הקרע של הדיסק antennal הגולמי בשלבים המוקדמים, ואחריה ניתוח מחושיהם שלבים אמצע-הגולמי ומבוגרים. אנו גם מראים שיטות שבו ההכנות יכול להיות מנוצל טכניקות מולקולריות, כגון החילוץ RNA לרביעיית-PCR, RNAseq או אימונוהיסטוכימיה. שיטות אלה ניתן להחיל גם למינים אחרים דרוזופילה לאחר פיתוח הגולמי תלויי מין פעמים נקבעים, בשלבים המתאימים מחושבים להזדקנות המתאים.

Introduction

מערכת הריח של דרוזופילה הוא מערכת הנפוצה הנוירו-ביולוגיה התפתחותית, מערכות neuroscience, כמו גם נוירופיזיולוגיה, לימודי התנהגות ו אבולוציה התנהגותית^{1,2,3, 4}. רקמות חוש הריח דרוזופילה בית הנוירונים קולטני ריח (ORNs) לזהות סימנים כימיים נדיפים בנוסף הידרו - ו התרמו-החישה הניריונים^1,5,6. המטרה הכוללת של כתב יד זה הוא כדי להדגים כיצד שלב ומנתחים לפתח רקמות חוש הריח הגולמי ומבוגרים במינים דרוזופילה . הרציונל של טכניקה זו היא כ....

Protocol

פרוטוקול הבאים הוא תואם ההנחיות האתיקה שנקבעו על-ידי ועדת האתיקה של המחקר באוניברסיטת דיוק.

1. רקמות והכנה הזמני התפתחותית של גולם דרוזופילה melanogaster

1. ראשית, עליך לזהות כמה זבובים יהיה צורך הקרע. RT-PCR, RNAseq, לאסוף 100-200 דיסקים antennal אנטנות מאנשים אשר נחוצים בשלבים prepupal, 8 שעות APF, 40 h APF, ולמבוגרים. עבור אימונוהיסטוכימיה, לנתח אדם 10-20.
2. לנקות את כל החומרים, כולל רפידות לנתיחה, מלקחיים, באמצעות מגבונים לחים עם 70% EtOH. אם החומר והטרף הוא לשמש RNA עקירות, לנקות את הכל עם RNase neutralizers ולעשות כל הפתרונות משתמש ללא נוקלאז או מים מטופלים diethyl pyrocarbonate (DEPC).
   הערה: פרוטוקול זה משת....

Results

הרקמה ביתור חוש הריח המתפתח יכול לשמש לחילוץ RNA ואחריו RT-PCR כדי להעריך ביטוי גנים או יכול להיתפס באמצעות פרוטוקולים אימונוהיסטוכימיה כדי לקבוע את דפוס הביטוי שלו, לוקליזציה תת הסלולר של הגנים של ריבית. בחלק זה, אנו מציגים תוצאות נציג או פרוטוקול. איור 1 הוא נציג כמותיים RT-PCR מציג שעתוק של קולטן פני שטח התא, גנים קולטני ריח בפראי-סוג האנטנה למבוגרים. איור 2 מציג את h 6-8 ו- 12 שעות APF דיסק antennal stainings על Rn-EGFP הטרנס.......

Discussion

פרוטוקול זה הוא משאב שימושי עבור מעבדות מעוניין לזהות את גנטי תעתיק ותוכניות הפעלה בפיתוח דרוזופילה רקמות חוש הריח, כמו גם ניתוח השוואתי של תוכניות אלה על פני דרוזופילה מינים. זה שימושי במיוחד אם מערכות ברמת פרופילים תעתיק של שלבים התפתחותיים שונים נדרשים בתור פריימר עבור מחקרים עתידיים. הפרוטוקול המתואר כאן מדגים כיצד שלב ולבודד לפתח חוש הריח ברקמה מן דרוזופילה להשיג דגימות של ארבעה שלבי פיתוח מערכת חוש הריח של המתבנת מראש כדי התמיינות סופנית, כדי לשמש מפתח החיסון-היסטולוגית המולקולריים מחקרים.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10X תמיסת מלח חוצצת פוספט	Gibco	70011-044	מדלל ל-1X במים נטולי RNase
CO2 tank	גז אוויר	CD R200
שני מלקחיים חדים (Dumont #55)	Fine Science Tools	11255-20
Trizol	Invitrogen	15596-026	פתרונות בידוד RNA
מיקרוסקופ
דלי קטן עם קרח
מיקרופיפטות P20 ו-P200 וטיפים
1.7 מ"ל צינורות מיקרופוגה			רכשו ללא נוקלאז לקבלת התוצאות הטובות
ביותר 0.2 מ"ל צינורות
אבקת פרפורמלדהיד	Polysciences	380
10% טריטון X-100	Teknova	T1105	לדלל ל-0.2% v/v ב-1X PBS
2 אינץ' צלחות
55 מ"מ נייר סינון	Whatman	1001-055	להרטיב במים ולהניח בצלחת פטרי כדי לשמור על לחות הגלמים
25 C אינקובטור
H2O			רכוש נוקלאז ללא נוקלאז או טפל עם DEPC
Sylgard 184 ערכת אלסטומר סיליקון	Dow Corning		שישמשו להכנת רפידות חיתוך מכיסויי צלחות טריזאקי.
מגשי מיני MicroWell עם מכסים	Nunc	438733	מכסים יכולים לשמש לייצור רפידות חיתוך סיליקון
נוגדן ארנב נגד GFP	MBL קורפור בינלאומי	PM005	נוגדן ראשוני
עכבר נגד RAT CD2	AbD seroTec	MCA154RHDL	נוגדן ראשוני
ADL195 (אנטי למין, עכבר)	מחקרי פיתוח איסור הידומה	נוגדן
ראשוני ADL195-sאלכסה פלואור&רג; 488 עיזים נגד ארנב IgG (H+L)	invitrogen	A11008	נוגדן משני
Cy3 עז נגד עכבר IgG	Jackson ImmunoResearch	115-166-003	נוגדן משני
Triton X-100, חומר ניקוי בדרגת חלבון, תמיסה 10%,	חומר ניקוי	CALBIOCHEM	648463
מעבדה מסובב	תרמו מדעי		מסובב
נוקלאז מים	Growcells.com	NUPW-0125
מגבי רקמות קלים	במים VWR	82003-822	לניקוי חומרי חיתוך
Superscript II	invitrogen	18064014	Reverse Transcriptase
QIAמגרסה (50)	מיצוי RNA	QIAGEN	79654
Oligo(dT)12-18 Primer	RT	Life Technologies
MinElute ערכת ניקוי (50)	מיצוי RNA	QIAGEN	74204
FASTSTART UNIV SG MASTER (5 מ"ל)(500 RXN)	qPCR	Roche	04913850001-FASTSTART
ESSENTIAL GREEN DNA MASTER	qPCR	Roche	06402712001
LIGHTCYCLER 480 - MULTIWELL PLATE 96	qPCR	Roche	04729692001
NEBNext High-Fidelity 2X PCR Master Mix	qPCR	NEB	M0541S