מאתגר צעיר הנוירונים באזורים במוח חדש יכול לחשוף תובנות חשובות איך הסביבה מפסל גורל עצביים ועם בגרות. פרוטוקול זה מתאר הליך כדי לקצור מבשרי interneuron מאזורים ספציפיים במוח, השתלת אותם גם homotopically או heterotopically לתוך המוח של הגורים כמחנכת.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
השתלת Homochronic של סימנים מקדימים Interneuron לתוך מוח העכבר כמחנכת מוקדם
במאמר זה
סיכום
תקציר
גורל עצביים נחישות ועם בגרות דורשת מורכבות הגומלין בין הסביבה אותות ותוכניות גנטי. אולם, disentangling את התפקידים של מהותי לעומת חיצוני מנגנונים המסדירים את תהליך בידול זה היא בעיה עבור כל neurobiologists התפתחותית. בעיה זו מוגדל עבור GABAergic interneurons, אוכלוסיה הטרוגנית מאוד תא נולד מתוך מבנים עובריים ארעי, עוברים שלב הנדידה ממושך כדי לפזר ברחבי telencephalon. על מנת לחקור כמה שונה המוח סביבות משפיעים על interneuron הגורל ועם בגרות, פיתחנו פרוטוקול עבור קציר שכותרתו fluorescently interneuron לא בוגר מבשרי מאזורים ספציפיים במוח בעכברים היילוד (P0-P2). בגיל הזה, interneuron ההעברה כמעט מושלם, תאים אלה מתקיימות בסביבות מנוחתו הסופי שלהם עם יחסית מעט שילוב סינפטית. בעקבות אוסף של פתרונות תא בודד באמצעות cytometry זרימה, אלו סימנים מקדימים interneuron מושתלים לתוך P0-P2 wildtype לאחר הלידה הגורים. על ידי ביצוע שני homotopic (למשל, קליפת-כדי-קליפת) או הטרוטופיות (למשל, קליפת-כדי-היפוקמפוס) השתלות, אחד לא יכול להעריך איך מאתגר interneurons ילדותי בסביבות המוח החדש משפיע שלהם הגורל, ההבשלה ושילוב במעגל. המוח יכול להיות שנקטפו בעכברים בוגרים, לבדיקה עם מגוון רחב של ניתוח posthoc על תאי המושתל, כולל immunohistochemical, אלקטרופיזיולוגיות, תעתיק פרופיל. כללי לגישה זו חוקרים עם אסטרטגיה assay סביבות מובחנות איך המוח יכול להשפיע על היבטים רבים של פיתוח נוירון ולזהות אם תכונותיה עצביים מונעים בעיקר על-ידי תוכניות גנטי קשיחה או רמזים סביבתיים.
מבוא
בקליפת המוח לתפקוד תקין דורש איזון בין הנוירונים הקרנה סינאפסות מעכבות GABAergic interneurons, אוכלוסיה הטרוגנית מאוד ברורים מורפולוגיות, מאפייני אלקטרופיזיולוגיות, קישוריות, עצבית סמנים. התפתחות לא תקינה ותפקוד של interneurons (וגם interneuron ספציפיים תת-קבוצות) נקשר את pathobiology של הפרעות פסיכיאטריות כגון סכיזופרניה, אוטיזם, אפילפסיה1,2,3. יתר על כן, גנים רבים מעורבים אלה הפרעות מוח חזק מועשר interneurons צעירים4. לפיכך, הבנה טובה יותר של המנגנונים המווסתים interneuron הגורל נחישות ועם בגרות יש צורך להבין להתפתחות התקינה של פוטנציאל אטיולוגיה של ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל ההליכים ניסיוני נערכו בהתאם להנחיות מכוני הבריאות הלאומיים, אושרו על ידי NICHD חיה על עצמך ועל שימוש הוועדה (ACUC). הפרוטוקול המתואר להלן מנצל Nkx2.1-CreC / +; Ai9+ /- כלבלבים לקצור מבשרי נגזר MGE interneuron, אך ניתן לבצע כל קו העכבר הרצוי כתב פלורסנט. גם זכר וגם נקבה מוקדם כמחנכת עכברים (P0-P2) שימשו ללא הבחנה רקמות התורם ואת המארח.
1. פתרון הכנה
- להכין סוכרוז מלאכותי השדרתי (sACSF) במתכון הבא (יחידת במ מ): NaCl 87, NaHCO 263, 2.5 אשלגן כלורי,2פו ' NaH 1.25 '4, 0.5 CaCl2, 7 MgCl2, גלוקוז 10, 75 סוכרוז רווי 95% O 2, 5% CO2
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
פרוטוקול זה מדגים כיצד הקציר אזורים ספציפיים במוח של המוח כמחנכת מוקדם (איור 1-2) לאסוף dissociations תא בודד של סימנים מקדימים interneuron, השתלת תאים אלה לתוך אזורים שונים במוח,-תמימה WT לאחר הלידה הגורים (איור 3). לניתוח posthoc, המוח שקיבלו שתלי קודמן interneuron נקטפו בין P30-35 לאפיין תא מורפולוגיה, סמני עצבית ומאפיינים אלקטרופיזיולוגיות. סוגים אלה של מבחני מתבצעות לעתים קרובות בין P21-P30 בעכברים נורמלי, א.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
היבט קריטי אחד של פרוטוקול זה הוא למקסם את השרידות של התאים. להבטיח כי רקמות ותאים נמצאים תמיד קר כקרח carboxygenated sACSF יש צורך לקדם את הישרדות cell. זה דורש ניתוח יעיל ואסטרטגיה דיסוציאציה כדי לצמצם את משך הזמן התאים מבלים פתרון שונים והן מחוצה הסביבה המוח. תלוי במספר אזורים במוח להיות גזור, מושתלים, זה יכול להיות מועיל שיש לו שותף סיוע בשלבי ניתוח ו/או השתלת כדי להקטין את משך הניסוי. כדי להבטיח את בריאות והישרדות של הכלבלב, חשוב גם כדי למזער את הזמן הרדמה קרח (< 4 דקות) ולשמור הכלבלב מחוממת עם אור במהלך ההליך השתלת.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים אין לחשוף.
תודות
מחקר זה נתמך על ידי מכוני הבריאות הלאומיים (K99MH104595), את תוכנית המחקר מגזר NICHD כדי T.J.P. אנו מודים Fishell גורד, במעבדה של מי גישה זו הוקמה במקור.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| נתרן כלורי | Sigma | S7653 | |
| נתרן ביקרבונט | Sigma | S6297 | |
| אשלגן כלורי | Sigma | P9541 | |
| נתרן פוספט מונו-בסיסי | Sigma | S0751 | |
| סידן כלורי | Sigma | C5080 | |
| מגנזיום כלוריד | Sigma | M2670 | |
| גלוקוז | Sigma | G7528 | |
| סוכרוז | Sigma | S7903 | |
| מטריצות מוח | Roboz | SA-2165 | נחוץ רק אם קצירת סטריאטום |
| נקודה עדינה Dumont מלקחיים | Roboz | RS-4978 | |
| מספריים מיקרו-חיתוך | Roboz | RS-5940 | |
| סכיני גילוח | ThermoFisher | 12-640 | |
| פיפטות פסטר | ThermoFisher | 1367820C | |
| Nanoject III | Drummond | 3-000-207 | |
| מניפולטור ידני עם מעמד | World Precision Instruments | M3301R/M10 | |
| 5 מ"ל צינורות פלסטיק תחתונים עגולים | ThermoFisher | 149591A | |
| 60 מ"מ צלחות פטרי | ThermoFisher | 12556001 | |
| 100 מ"מ צלחות פטרי | ThermoFisher | 12565100 | |
| Pronase | Sigma | 10165921001 | |
| סרום בקר עוברי (FBS) | ThermoFisher | 16140063 | |
| DNase I | Sigma | 4716728001 | |
| Celltrics 50um פילטרים | Sysmex | 04-0042327 | |
| טריפן כחול | ThermoFisher | 15-250-061 | |
| המוציטומטר | ThermoFisher | 02-671-6 |
מקורות
- Bozzi, Y., Casarosa, S., Caleo, M. Epilepsy as a neurodevelopmental disorder. Front Psychiatry. 3 (19), (2012).
- Takano, T. Interneuron Dysfunction in Syndromic Autism: Recent Advances. Dev Neurosci. , (2015).
- Inan, M., Petros, T. J., Anderson, S. A.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
