Neurosphere Assay כדי להעריך את הפעלת אנדוגני תאי גזע עצביים במודל של עכברים של פגיעה בחוט השדרה מינימלי

Nishanth Lakshman; Wenjun Xu; Cindi M. Morshead

doi:10.3791/57727

מאמר שיטה

Neurosphere Assay כדי להעריך את הפעלת אנדוגני תאי גזע עצביים במודל של עכברים של פגיעה בחוט השדרה מינימלי

DOI:

10.3791/57727

⸱

13 בספטמבר 2018

Nishanth Lakshman¹^,² , Wenjun Xu² , Cindi M. Morshead¹^,²^,³

¹Institute of Medical Science, University of Toronto, ²Department of Surgery, University of Toronto, ³Institute of Biomaterials and Biomedical Engineering, University of Toronto

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

. הנה, נדגים את הביצועים של מודל פגיעה בחוט השדרה מינימלי עכבר למבוגרים זה חוסך הנישה התעלה המרכזית דיור אנדוגני תאי גזע עצביים (NSCs). אנו מראים כיצד ניתן להשתמש וזמינותו neurosphere לכמת הפעלה והעברה של NSCs סופית ופרימיטיבי בעקבות פגיעה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאי גזע עצביים (NSCs) בחוט השדרה יונקים בוגרים הם אוכלוסיה יחסית mitotically השבתה הדרגתית של תאים periventricular, כי יכול להיות למד במבחנה באמצעות וזמינותו neurosphere. זה וזמינותו המושבה יוצרי הוא כלי רב עוצמה כדי ללמוד את התגובה של NSCs גורמים אקסוגניים בצלחת; עם זאת, זה יכול לשמש גם כדי לחקור את השפעת ויוו מניפולציות עם ההבנה נכונה היתרונות והמגבלות של וזמינותו. מניפולציה אחת של הריבית קלינית היא ההשפעה של פגיעה על ההפעלה לבטחון לאומי אנדוגני. המודלים הנוכחיים של פגיעה בחוט השדרה לספק אתגר ללמוד זאת כמו חומרת דגמים נפוצים החבורה, דחיסה, חיתוך לגרום להרס של הגומחה לבטחון לאומי באתר של הפגיעה בו שוכנים תאי גזע. כאן נתאר מודל מינימלי פגיעה הגורמת נזק מקומי על פני דורסולטרלי שטחית של רמת בית החזה התחתון (T7/8) של חוט השדרה העכבר למבוגרים. מודל פציעה זה חוסך את התעלה המרכזית ברמה של פציעה, מאפשרת ניתוח של NSCs השוכנים ברמה של הנגע בנקודות זמן שונות בעקבות פגיעה. . הנה, אנחנו מראים איך וזמינותו neurosphere יכול להיות מנוצל כדי ללמוד את ההפעלה של שתי האוכלוסיות ברורה, lineally הקשורות, של NSCs השוכנים באזור periventricular בחוט השדרה - פרימיטיבי ומוחלטת NSCs (pNSCs ו- dNSCs, בהתאמה). נדגים כיצד לבודד, תרבות אלה NSCs מאזור periventricular ברמה של פציעה ואתר פציעה חומר לבן. ניתוח לאחר ניתוח בחוט השדרה שלנו מראים מספר רב יותר של pNSC, neurospheres dNSC, נגזר מאזור periventricular של מיתרי פצוע לעומת שולט, מדבר עם ההפעלה שלהם באמצעות פגיעה. יתר על כן, בעקבות פציעה, נגזר dNSC neurospheres ניתן לבודד מאתר פגיעה — להפגין את היכולת של NSCs להעביר מ משרה periventricular לאתרים של פציעה.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מערכת העצבים המרכזית מכילה את subpopulation של תאי גזע עצמי המתחדש, multipotent, כי יש את היכולת להצמיח כל תא עצבי בוגרת אחרת סוגים¹^,²^,³^,⁴. אלה בתאי גזע עצביים (NSCs) שוכנים בתוך נישות מיוחדות במוח ובחוט השדרה, יכול להיות מופעל בעקבות פגיעה כדי להתרבות, להעביר וכדי להבדיל לתוך התאים העצביים בוגרים. NSCs, הצאצאים שלהם הוכחו להעברת אתר פגיעה פגיעה בקליפת המוח מודלים⁵^,⁶. במוח, NSCs הוכחו להגר מן החדרים הצדדיים האתר של פגיעה בו הם להתמיין האסטרוציטים שתורמים היווצרות צלקת גליה⁷. בחוט השדרה, עם זאת, מחקרים מעטים נעשו כדי לשאול אם ניתן לשלוט NSCs אנדוגני באותו אלה כדי לקדם את ההחלמה בעקבות פגיעה בחוט השדרה. אכן, אין כיום ויכוח הפעלת הבריכה תאי גזע בחוט השדרה דורשת נזק פיזי ישיר של הגומחה periventricular רירית התעלה המרכזית⁸ או אם הנזק השדרה כבל parenchyma (עוזב את הגבעול גומחת תאי שלם) מספיקה להפעיל את NSCs אנדוגני⁹.

היו בשימוש מספר מודלים פציעה (SCI) בחוט השדרה ללמוד הפתופיזיולוגיה של פציעה אקוטי וכרוני. מודלים אלה שימשו גם לבדוק טיפולים פוטנציאליים לטיפול SCI דרך neuroprotection, immunomodulation, המתפתח תא השתלת/החלפה אסטרטגיות¹⁰^,¹¹^,¹³. המודלים הנוכחיים כוללים פציעות דחיסה ו/או החבורה, אשר לגרום גירעונות פונקציונלי בקנה מידה גדול כמו גם נגעים נרחבים cavitations כבל ה-¹⁴^,¹⁵. צלקות גליה הנובעת יכולה להקיף מספר מקטעים בעמוד השדרה יחד עם הרוב המכריע של ההיקף/הרוחב של השדרה ה-¹⁶. לכן, בעוד אלו הדגמים הם הרלוונטית קלינית, הם יכולים להרשות לעצמם אתגרים משמעותיים כדי ללמוד את התגובה של NSCs אנדוגני בעקבות פגיעה. ישנם דגמים כימי של פציעה זה ניתן להתאים לגרום צורות קלות של פציעה יכול לתת לי את התעלה המרכזית¹⁷. עם זאת, סוגים אלה של פציעה להתמקד demyelination המשויך SCI, הן לא דוגמניות הרלוונטית קלינית נזק גופני ו/או מכני הקשורים לביוטכנולוגיה טראומטי

כדי לטפל המגבלות של המודלים הנוכחיים של פציעה, אנחנו הסתגלו מחט מסלול מינימלי SCI מודל, שפותחה במקור בשנת החולדה⁹, עבור היישום במודל עכברים בוגרים. המודל שלנו פגיעה מותאם ניתן ליצור פגיעה עקבית של אזור דורסולטרלי של חוט השדרה העכבר, לוותר על התעלה המרכזית-level(s) של פגיעה. היתרון של מודל זה הוא כי הוא מאפשר המחקר של המועצה לבטחון לאומי קינטיקה בעקבות פציעות והעברה רדיאלי הפוטנציאליים שלהם לאתר של פציעה. השימוש של מודל עכבר מאפשרת גם שימוש העכברים הטרנסגניים המאפשרים מעקב אחר שושלת היוחסין של NSCs אנדוגני, הצאצאים שלהם בעקבות פגיעה. וצריך להעריך את המאפיינים של NSCs עוד יותר באמצעות הטופס ששונתה של במבחנה neurosphere וזמינותו שהוצגה במאמר פרוטוקול זה.

הבדיקה neurosphere היא במבחנה המושבה יוצרי assay המתיר את ניתוקה של NSCs בנוכחות mitogens. -ציפוי המשובטים צפיפויות, NSCs בודדים להתרבות כדי להצמיח לתרשים כדורית מושבות תאים מורכבות של subpopulation קטן של NSCs, הרוב המכריע של אבות¹⁸^,¹⁹. בפרוטוקול שלנו, נדגים את ניתוקה של שני NSCs נפרדים, הקשורים lineally מאזור periventricular של חוט השדרה — בתנאים בסיסית, בעקבות המודל שלנו-SCI מינימלי. מהווים הסופית עצבית גזע nestin אקספרס תאים (dNSCs) ואת החלבון חומצי fibrillary גליה (GFAP), גדלים בנוכחות גורם הגדילה באפידרמיס (EGF), גורם הצמיחה פיברובלסט (FGF) והפרין (הנקרא יחד EFH)²⁰. DNSCs אלה הם נדירים בחוט השדרה תמימה, והוליד מעט מאוד neurospheres במבחנה. עם זאת, אנו מראים כי dNSCs מופעלים בעקבות SCI מינימלי, מרחיבה את המספרים של neurospheres מבודד את אזור periventricular²¹. תאי גזע עצביים פרימיטיבי (pNSCs) הם הזרם של dNSCs בשושלת תאי גזע עצביים. pNSCs ונדירה, אקספרס רמות נמוכות של דה מרקר pluripotency Oct4, והם לוקמיה מעכבות פקטור (LiF) מגיב²². pNSCs לא עושים בצורת neurospheres כאשר מבודד מן חוט השדרה העכבר למבוגרים בשל נוכחותם של המיאלין הבסיסי חלבון (MBP) בתרבויות הראשי; עם זאת, pNSC neurospheres ניתן לבודד של MBP עכברים לקוי, מספרם הפציעה הבאה המורחב — בדומה dNSCs²¹. לבסוף, נראה כי נגזר dNSC neurospheres ניתן לבודד מהאתר של פגיעה ב מוקדם פעמים בעקבות לביוטכנולוגיה מינימלי ממצאים אלה מדגימים שלנו דגם פציעה, מבחני יכול להעריך את מאפייני ההפעלה של periventricular NSCs כגון היכולת שלהם להתרבות ולהעביר בתגובה לפציעה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה אושרה על ידי הוועדה אכפת לי חיה ב אוניברסיטת טורונטו, תואם "מדריך כדי טיפול, שימוש של ניסיוני החיות" (2^nd Edition, המועצה הקנדית על חיה על עצמך, 2017).

1. ניתוח פגיעה בחוט השדרה מינימלי

הערה: לפני הניתוח לוודא כי כל מכשירי ניתוח והחומרים סטריליים על ידי שיטות המתאימות (איור 1 א').

לבנות קשת תמיכה בית החזה על ידי סיכום 4 – 5 ריבועים של גזה, להדביק אותם ביחד באמצע כדי להשיג את גליל קבוע של גזה.
הנח את העכבר בבית הבליעה אינדוקציה וליזום הרדמה עם 5% איזופלוריין. אשר היעדר רפלקס קמצוץ הבוהן לפני שתמשיך, כמו גם לאורך כל ההליך. ככל שהניתוח יכול לקחת יותר מ 30 דקות כדי להשלים, למטב לחשיפה איזופלוריין מינימלי (5 דקות ב-5%) ואת הזמן הנותר ב 2-3%.
להעביר את העכבר קונוס האף מחובר למכונת הרדמה במינון תחזוקה של 2-3% איזופלוריין. השתמש קוצץ שיער כדי להסיר dorsum של החיה מן אמצע הגב עד הצוואר/האוזניים לחשוף אזור מלבני רחב של העור לניתוח פרווה.
להעביר את העכבר נגינה stereotaxic על-ידי הצבת אפה קונוס האף המצורפת ייצוב הגולגולת עם האוזן ברים. לשמור איזופלוריין ב-5% במהלך ההשמה של הסורגים האוזן והתחתון חזרה ל- 2-3% ברגע העכבר מאובטחת במכשיר stereotaxic.
להזריק תרופות להרגעה לפני הניתוח intraperitoneally — Meloxicam (2.0 mg/kg). בנדיבות להחיל סיכוך עין על גבי העיניים פתוח העכבר כדי למנוע לייבוש הקרנית כאשר תחת הרדמה.
במקום קשת תמיכה בית החזה מתחת בבטן העכבר בעודכם מנסים לסדר את גוף העכבר ואת עמוד השדרה על ידי משיכת בקלילות על בסיס הזנב. השתמש מעבדה תיוג הקלטת כדי לאבטח את הזנב ואת כל האיברים המורחבת בעמדה כמו כוכב. ברגע מאובטח, לדחוף את קשת תמיכה בית החזה rostrally, מהבטן העכבר לכיוון בית החזה העליון — כדי לתמוך בעמוד השדרה החזי (איור 1B).
להכין שדה כירורגי סטרילי וחיטוי באזור העור שנחתכו פרווה מוכן בשלב 1.3 עם 70% אתנול, ואחריו povidone יוד. חזור על פעמיים. החל תלוי כירורגי סטרילי כדי לשמור על שדה רחב סטרילי.
באמצעות סכין #10 אזמל, לבצע חתך אנכי המקביל לציר האורך של בעל החיים מנקודת אמצע של שתי השכמות עקמת בעמוד השדרה החזי. . משכי את העור כדי לחשוף רקמה רכה, את קווי המתאר של עמוד השדרה (איור 1C).
לזהות את הגבול התחתון של משטח השמן suprascapular (זה demarcates את רמת בחוליות של T4/5). עם הלהב #10 באותו, בזהירות, אבל עם כוח, לחתוך לאורך שני צידי העצם בחוליות T5-T8/9 כדי לנתק את הגידים שרירי הגב מן העמודה.
הכנס השיניים של רטרקטורים האתרים החתך משני צדי עמוד השדרה. להתאים את החשיפה על ידי הרחבת רטרקטורים להעלות מספיק את עמוד השדרה מבלי יותר מדי עומס על הרבדים שקועה שריר (איור 1D).
תחת מיקרוסקופ כירורגי, בזהירות לנקות את השריר שיורית, רקמות רכות אחרות המכסים השדרה כדי לחשוף את העצם בחוליות (איור 1E). לזהות את החוליה זה יוסרו על ידי לופתות את תהליכים קוצניים של החוליות עם מלקחיים במיתולגיות והזזתה למעלה ולמטה.
הערה: זה אמור לאפשר זיהוי של המפרקים בין-חולייתי, לחשוף את הפתחים קטנים (בין-חולייתי foramina) מתחת החוליות עניין.
להכניס ראש אחד של המספריים קהות מעוקל משני צידי נקב בין-חולייתי חשוף, סימטרית כדי הנדן בחוליות כדי להוציא החוצה, וחותכים את המפרקים בין-חולייתי חיבור דו צדדיים.
הרם את הנדן כלפי מעלה, לחתוך את הקובץ המצורף העליון של הנדן לבודד ולהסיר את העצם.
הערה: זו תחשוף את קרום השדרה שלם המכיל את חוט השדרה (איור 1F). אולי יש עודף דימום אשר יכול להיות נשלט על ידי הצבת חתוכים 1 ס"מ על 1 ס"מ גזה על האזורים הנגועים ו/או לשטוף עם PBS סטרילי.
עם הווריד של קו האמצע הגבי משמש נקודת ציון, להוסיף מוט כפוף 45° של קצה המחט 30 G (עם מחט המשופעת כלפי מעלה) לתוך השטח דורסולטרלי של חוט השדרה (כ 1 מ מ עמוקה)-כ-0.5 מ מ לרוחב כדי משני צידי הקו האמצעי.
להזיז את המחט ~ 2 מ מ מ סימטרית rostral (מקביל האמצע) כך לכל אורכה של השיקוע של המחט מוכנס לתוך החוט. הסר את המחט על-ידי חזרה על דרך הנתיב של הפוסט (איור 1 ג'י).
הערה: צריך להיות אין דימום, אך ניתן לראות נפיחות של הרקמה בעמוד השדרה בשלב זה.
כדי לסגור את הפצע, להסיר את המדחק, תפר את שרירי הגב משני צדי הפגיעה יחד האמצע באמצעות בתפר שנספג 6-0. השתמש 4-0 בתפר משי סטרילי לסגור לאחר מכן העור שמעליה.
אנטיביוטית חלות על החלק העליון של העור sutured שטחית כדי למנוע זיהום לאחר הניתוח באמצעות קצה ספוגית כותנה. לנהל כאבים לאחר הניתוח של 0.1 mg/kg של הבופרנורפין subcutaneously יחד עם נוזלים (1 מ"ל של תמיסת הרטמן).
כבה את מכשיר אידוי איזופלוריין ואת חמצן. הסר את העכבר המכשיר stereotaxic והמקום בתוך כלוב נקי ללא מצע.
הנח את העכבר בכלוב כ 30 ס מ מן מנורת חימום ההתאוששות מן ההרדמה והתנהגות צג בעקבות ההתעוררות. העכבר צריך להתעורר בתוך 5-10 דקות, יש את הפונקציה הינד-האיבר עם paresis אפשרי ו/או חולשה הזנב עם התעוררותו.
עקוב אחר אופן ההתנהגות של העכבר מעל בימים הקרובים ולספק טיפול לאחר הניתוח, משככי כאבים (קרי, מחית, lactated פתרון נוזלים תת-עורי, 0.1 מ"ג/ק"ג. הבופרנורפין רינגר 2 x מדי יום subcutaneously, 2 – 3 ימים ומעקב משקל מתאים ) בהתאם לתקנות מתקן בעלי חיים המקומי, על בסיס אישי כמו שחזור עשויות להשתנות.

2. Neurosphere Assay לנתיחה

הערה: בצע את ההליכים תרביות רקמה סטרילי המתאים לכל אורך.

פתרון אנזימטי הכנה
1. להוסיף 32 מ"ל מאוזנת מלח פתרון (EBSS של ארל) אלבומין ovomucoid מעכב בקבוק זכוכית המכיל ובעדינות מערבולת עד התפרקה.
2. הוסף 5 מ של EBSS בקבוקון זכוכית פפאין מראש מנות אישיות ומניחים בתוך אמבט מים 37 ° C כדי להמיס. הפתרון יהיה לנקות (פתרון 1).
3. קח 500 µL של EBSS ולהוסיף DNase מראש מנות אישיות שאני זכוכית המבחנה בריכוז של 1 מ"ג/מ"ל (2 פתרון). לערבב בעדינות על ידי הטיית המבחנה הלוך ולהוסיף µL 250 של תערובת זו פתרון 1.
  הערה: כל הפתרונות גרם (פתרון 1 ו- 2) מספיקים לצורך עיבוד של שני חלקי הרקמה. אם עיבוד חלקים נוספים של רקמות, להכיל עם הכנה פתרון נוסף.
ניתוח והכנה של רקמות
1. במקום למחוק מעבדה טבולים איזופלוריין לתוך הכלוב העכבר ולאפשר 2-3 דקות על האדים לחלוטין עזים ומתנגד העכבר. נוקאאוט הבאים, להסיר את העכבר מן הכלוב ואשר העדרו של רפלקס הבוהן-קורט.
2. לבצע פריקה צוואר הרחם עם חפץ מתכת קהה (כלומר, כרטיס כלוב מתכת) כדי להרדימו. תרסיס החיה לאללה מהצוואר שלו אל אמצע הגב בנדיבות עם 70% אתנול.
3. בבסיס הגולגולת, להשתמש במספריים כדי לחתוך את הראש ולמחוק לתוך שקית ביו. עושים חתך קו האמצע של העור לאורך כל הגב כדי לחשוף את השרירים ואת העצם בחוליות מתאר (איור 2 א).
4. הרם את האספקט המדיאלי של כל עצם השכם (כלומר., השכמה — המזוהה על-ידי המכסים fat pad), להשתמש במספריים לחתוך משם רקמות רכות (בין חוליות השכם). נפרדת לחלוטין לחשוף את עמוד השדרה המשמש כבסיס.
5. בעקבות העקמומיות של עמוד השדרה, להכניס אותו זוג מספריים הצמצם בית החזה העליון, לבודד את עמוד השדרה על ידי חיתוך משם צלעות המחוברים השרירים, האיברים הפנימיים (איור 2B).
6. להכניס מספריים סימטרית בחוליות נקב/פתיחת וחותכים את המפרקים בין-חולייתי משני צדי סחוס (המשטח הגבי). לקחת את הטיפול בפרט כדי לא לגרום נזק חוט שלם. המשך בתהליך זה עד הרמה הרצויה ו/או אורך החוט חשוף.
7. לחתוך בזהירות את spinal nerve(s) הרחבת רוחבית של החוט לפני העברת הרקמה חוט השדרה לתוך צלחת פטרי עם נוזל מוחי שדרתי מלאכותי קבוע. שמור את הדגימה על קרח (איור 2C).
8. תחת מיקרוסקופ חיתוך, לחתוך הרקמה חוט השדרה כדי לכלול ~ 2 מ מ rostral וסימטרית לאתר פציעה. להשתמש שני זוגות של מלקחיים להפריד בעדינות את הכבל 2 חצאים longitudinally לאורך סדקים הגבי ו הגחון (איור 2C").
9. עם microscissors, לגזור בחומר הלבן דורסולטרלי פצועים. מניחים את החלק לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל.
10. חצי חוט השדרה למטה עם מלקחיים, אוחזת להקניט ולהסיר חומר לבן באמצעות עוד זוג מלקחיים בסדר לאורך היקף rostrocaudal של חוט השדרה כדי לבודד את האזור הרצוי periventricular. חזור על החצי השני של חוט השדרה.
11. המקום פיסות רקמת periventricular לתוך צינורות חרוט נפרד 15 מ"ל. השתמש microscissors, בעדינות מינצ הרקמה כנגד דפנות הצינורות חרוט.
  הערה: רקמת דיסוציאציה שינויים הם פפאין דיסוציאציה מערכת פרוטוקול²³ ו רקמת שתואר לעיל הכנת נהלים²⁴.
12. להוסיף 2.5 מ של פתרון חדש 1 (שלב 2.1.3) דגימת הרקמות ומניחים על כיסא נדנדה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
13. בעדינות triturate הרקמה בתמיסה עם טיפ פיפטה 1,000 µL. Centrifuge התליה תא מעונן ב x 300 גרם במשך 5 דקות ב- RT.
14. להכין 3 פתרון עם 2.7 מיליליטר של ארל מאוזנת תמיסת מלח, µL 300 של ovomucoid מעכב פתרון (שלב 2.1.1) ו- µL 150 של DNase אני פתרון (שלב 2.1.3).
15. למחוק את תגובת שיקוע מ שלב (שלב 2.2.13), resuspend ב 1.5 מ של פתרון 3 מהשלב הקודם (שלב 2.2.14).
16. שכבת ההשעייה תא חדש (שלב 2.2.15) מעל 5 מ של ovoimucoid פתרון מעכב (שלב 2.1.1) 15מל חרוט צינור כדי ליצור מעבר הדרגתי צפיפות מקוטע. צנטריפוגה ב x 300 גרם במשך 5 דקות ב- RT.
17. למחוק את תגובת שיקוע, resuspend ב 2 מ"ל של המדיה neurobasal. צנטריפוגה ב x 300 גרם במשך 3 דקות ב- RT.
18. למחוק את תגובת שיקוע, resuspend ב 1 מ"ל של המדיה neurobasal. לסנן את המתלים. באמצעות מסננת תא 20 מיקרומטר ואחריו 4 מ"ל של מדיה עבור הנפח הכולל של 5 מ.
יופיצ
1. להכין תרבות המדיה לצמיחה neurosphere על-ידי שכשהם neurobasal מדיה עם גורם הגדילה באפידרמיס (20 ng/mL) / הצמיחה פיברובלסט גורם (20 ng/mL) / הפרין (2 µg/mL) [עבור NSCs סופית] או leukemina מעכבות פקטור (10 ng/mL) [עבור NSCs פרימיטיבי]. להוסיף 10 מ של מדיה או לתוך בקבוקון תרביות רקמה 25 מ.
2. להשתמש hemocytometer וצבע Trypan blue כדי לחשב את מספר התאים ההשעיה (שלב 2.2.18)²⁵. ברגע מחושב, להוסיף תאים מבחנות תרביות רקמה המבושלות (שלב 2.3.1) כדי צפיפות המשובטים של 10 תאים/µL ומקום תרביות רקמה את הבקבוק עם תאים נוספת לתוך החממה במשך 24 שעות ביממה (37 מעלות צלזיוס, 95% לחות, 5% CO₂).
  הערה: דוגמה לשיטת הספירה הוא כדלקמן: לוקח 10 µL של התא ההשעיה, לערבב עם µL 10 של צבע Trypan blue. להוסיף 10 µL של תערובת זו hemocytometer. תחת 10 X בסיוע מיקרוסקופ אור, לספור את המספרים של תאים חיים, לסכם את כל התאים ספרתי בתוך 4 הרביעים 4 x 4. להשתמש בנוסחה: 100,000/[(X cells/4) x 2 x 10 x 1,000] כדי לתת נפח תא ההשעיה כדי להיות מצופה את הבקבוק תרביות רקמה 25 מ ל כל אחד כדי להבטיח המשובטים צפיפות (10 תאים µL).
3. לאחר 24 שעות, בעדינות מערבולת את הבקבוקון ויוצקים תוכן לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל. צנטריפוגה ב x 300 גרם במשך 5 דקות ב- RT.
4. למחוק את תגובת שיקוע והשהה מחדש את התאים 1 – 2 מ"ל של מדיה neurobasal טריים.
5. חזור על שלב 2.3.2 כדי לספור את מספר התאים בתאים ההשעיה וצלחת -צפיפות המשובטים בצלחת תרביות רקמה 24-ובכן המכיל 500 µL כל המדיה המתאימים mitogen בתוספת שלהם (EFH לצמיחה לבטחון לאומי סופית) ו- LIF לצמיחה לבטחון לאומי פרימיטיבי.
  הערה: השתמש בנוסחה מותאם (5,000 [X / תאים/4) x 2 x 10 x 1,000) לחישוב הנפח של התליה תא כדי להיות מצופה בכל טוב המכיל 500 µL של התקשורת.
6. מניחים צלחות המכיל תאים בחממה (37 מעלות צלזיוס, 95% לחות, 5% CO₂) לגדול במשך 7 ימים.
סופר
1. לאחר 7 ימים בתרבות, להסיר את הלוחות ולהציג תחת מיקרוסקופ אור. לכמת neurospheres על ידי ספירת מושבות כדוריות הנמצאות > 80 מיקרומטר בקוטר של תרבויות dNSCs ו > קוטר 50 מיקרומטר pNSCs תרבויות.
  הערה: אם רצונך בכך, neurospheres יכול להיות עוד יותר passaged²⁶ או הבדיל. אם התאים אינם נחוצים, תשליך על-ידי הוספת מואצת מימן על-חמצני הבארות (כ – 1 מ"ל) במשך 20 דקות כך הצבע של המדיום לצהוב. . ואז להשליך...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בעקבות הניתוח, העכברים צריך לחוות גירעונות מוטורית מינימלית אשר עשויים לכלול הזנב ואת paresis הינד-איבר אפשרי עבור עד 24 שעות. לאחר תקופה זו, העכברים צריך לחוות אין שיתוק גפיים-הינד ו/או paresis ושינויים מינימליים דהירה.

איור 3 מראה תוצאות נציג וזמינותו neurosphere בעקבות הפגיעה בחוט השדרה מינימלית של 5 ימים. מספרים מוחלטים של נגזר dNSC neurospheres (גדלו ב EFH) הוא גדול יותר מספרי pNSC, נגזר neuros...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במהלך ההליך הכירורגי, ישנם כמה צעדים קריטי שבו החוקר צריך תשומת לב מיוחדת על מנת להשיג תוצאות אופטימליות, למזער את השתנות בין בעלי חיים. חייבים להקפיד עם ההרדמה בשאיפה (איזופלוריין) במהלך הניתוח כפי ההרדמה הוכח יש אפקטים neuroprotective עם חשיפה ממושכת²⁷. בהתאם לכך, לומדים יכולת ההתחדשות של חוט השדרה בעקבות פגיעה, לעשות מאמץ כדי לבצע את הניתוח במהירות וביעילות האפשרית כדי למנוע המשתנים מבלבלים. שמירה על איזופלוריין באותו זמן חשיפה לכל העכבר יקטין את השתנות. קצב הנשימה של העכבר צריך להיות במעקב לאו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו ממומנת על ידי קרן Krembil (הפעלה גרנט CMM). WX היה זוכת הפרס סטודנט קרלטון מרגריט סמית. NL קיבל מלגת בוגר אונטריו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Agricola Retractor	Fine Science Tools	17005-04
Moria Vannas-Wolff מספריים קפיציים (מעוקלים)	Fine Science Tools	15370-50	התאמה אישית בעת ההזמנה כדי לקבל טיפים קהים
מלקחיים Graefe (ישרים, 1 x 2 שיניים)	Fine Science Tools	11053-10
מלקחיים עדינים במיוחד של Graefe (מעוקלים, משוננים)	Fine Science Tools	11152-10	או כל מלקחיים אחרים לתפירת
המוסטטים של הרטמן (ישר)	Fine Science Tools	13002-10	או כל התאמה אחרת לתפירת ידית
אזמל #3	Fine Science Tools	10003-12	או כל
קוצץ שיער	amazon.ca	https://www.amazon.ca/Wahl-Professional-8685-Classic-Clipper/dp/B00011K2BA	או כל
סטריאוטקסי מתאים אחר מכשיר	Stoeling	51500	או כל
בופרנורפין			אחר או כל אישור שאושר על ידי מתקן הטיפול בבעלי חיים שלי
Meloxicam			או כל אישור מתאים על ידי מתקן לטיפול בבעלי חיים
Tears Naturale P.M.	Alcon	https://www.amazon.ca/Alcon-Tear-Gel-Liquid-Eye-Gel/dp/B00HHXGUXE	או כל 02225875 DIN מתאים אחר
Isoflurane	Baxter International Inc		או כל אחר המתאים להרדמה
Q-tips Cottom Swabs	amazon.ca
כותנה גזה	פישר סיינטיפיק	13-761-52
30 גרם מחטים	בקטון דיקינסון	305106	לפציעה
25 גרם מחטים	בקטון דיקינסון	305122	להזרקות סמים
מזרקים 1 מ"ל	בקטון דיקינסון	3090659	להזרקות תרופות
3 מ"ל מזרקים	בקטון דיקינסון	309657	להזרקת נוזלים
4-0 תפר	uoftmedstore.com	2297-VS881	לתפירת עור
6-0 תפר	uoftmedstore.com	VS889	לתפירת שרירים
משחת פוליספורין	amazon.ca	102051
וופורייזר איזופלורן	VetEquip	901806
צינורות חרוטיים 15 מ"ל	ThermoFisher		כל
כלי פטרי	ThermoFisher		כל
Trypan Blue	ThermoFisher		כל
המוציטומטר	ThermoFisher		כל
צנטריפוגה	מתאימהThermoFisher		כל
כלי דיסקציה סטנדרטיים	כלי מדע עדין דיסקציה
מיקרוסקופ	Zeiss	Stemi 2000
מיקרוסקופ ספירה	אולימפוס	CKX41
עצבי בזאלי-A בינוני	Invitrogen	10888-022
B27	Invitrogen	17404-044
פניצילין- סטרפטומיצין	ג'יבקו	15070
ליטר- גלוטמין	גיבקו	25030
DMEM	Invitrogen	12100046
F12	Invitrogen	12700075
30% גלוקוז	סיגמא	G6152	1 מ', 9.01 גרם ב-100 מ"ל dH₂O
1 מ' גלוקוז
7.5% NaHCO<תת>3	סיגמא	S5761	155 מ"מ, 1.30 גרם ב-100 מ"ל dH₂O
155 מ"מ NaHCO₃
1 m HEPES	Sigma	H3375	23.83 גרם ב-100 מ"ל dH₂
O Apo-Transferrin	R& די סיסטמס	3188-AT
פוטרסין	Sigma	P7505
אינסולין	Sigma	I5500
סלניום	Sigma	S9133
פרוגסטרון	Sigma	P6149
מערכת דיסוציאציה פפאין	להשתמש בבקבוקון PDS 1 של פפאין של	Worthington Biochemical Corporation
אבקת PMG8041 גורם גדילה אפידרמלי	Invitrogen		שהורכבה מחדש עם תערובת הורמונים של 1 מ"ל ומכוונת לבקבוקונים של 20uL לאחסון במקפיא
Fibroblast Growth Factor	Invitrogen	PHG0226	שהורכבה מחדש עם תערובת הורמונים של 0.5 מ"ל ונקבעה ל-20 μ בקבוקוני L לאחסון במקפיא
Heparin	Sigma	H3149
גורם מעכב לוקמיה	בבית
טריפן כחול
המוציטומטר
24 באר צלחות	NUNC
2 M NaCl	Sigma	S5886	11.69 גרם ב 100 מ"ל dH₂O
1 M KCL	Sigma	P5405	7.46 גרם ב-100 מ"ל dH₂O
1 M MgCl₂	Sigma	M2393	20.33 גרם ב-100 מ"ל dH₂O
108 מ"מ CaCl₂	Sigma	C7902	1.59 גרם ב-100 מ"ל dH₂O

מתאים אחר מתאים שלhttps://www.amazon.ca/Q-Tips-Cotton-Swabs-500-Count/dp/B003M5UO6U/ref=pd_lpo_vtph_194_bs_tr_img_1/140-7113119-8364127?_encoding=UTF8&psc=1&refRID=JC16N542KVRF2N62N3DS מתאימים מתאים מתאימים ניתן עבור 2 דגימותאבקת

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Johansson, C. B., et al. Identification of a neural stem cell in the adult mammalian central nervous system. Cell. 96 (1), 25-34 (1999).
McKay, R. Stem cells in the central nervous system. Science. 276 (5309), 66-71 (1997).
Gage, F. H. Mammalian neural stem cells. Science. 287 (5457), 1433-1438 (2000).
Temple, S., Alvarez-Buylla, A. Stem cells in the adult mammalian central nervous system. Current Opinion in Neurology. 9 (1), 135-141 (1999).
Zhang, R., et al. Activated neural stem cells contribute to stroke-induced neurogenesis and neuroblast migration toward the infarct boundary in adult rats. Journal Of Cerebral Blood Flow And Metabolism. 24 (4), 441-448 (2004).
Komitova, M., Mattsson, B., Johansson, B. B., Eriksson, P. S. Enriched environment increases neural stem/progenitor cell proliferation and neurogenesis in the subventricular zone of stroke-lesioned adult rats. Stroke. 36 (6), 1278-1282 (2005).
Faiz, M., et al. Adult neural stem cells from the subventricular zone give rise to reactive astrocytes in the cortex after stroke. Cell Stem Cell. 17 (5), 624-634 (2015).
Ren, Y., et al. Ependymal cell contribution to scar formation after spinal cord injury is minimal, local and dependent on direct ependymal injury. Science Reports - UK. 7, (2017).
Mothe, A. J., Tator, C. H. Proliferation, migration, and differentiation of endogenous ependymal region stem/progenitor cells following minimal spinal cord injury in the adult rat. Neuroscience. 131 (1), 177-187 (2005).
Thuret, S., Moon, L. D., Gage, F. H. Therapeutic interventions after spinal cord injury. Nature Reviews Neuroscience. 7 (8), 628-643 (2006).
Bethea, J. R., et al. Systemically administered interleukin-10 reduces tumor necrosis factor-alpha production and significantly improves functional recovery following traumatic spinal cord injury in rats. Journal of Neurotrauma. 16 (10), 851-863 (1999).
Donnelly, D. J., Popovich, P. G. Inflammation and its role in neuroprotection, axonal regeneration and functional recovery after spinal cord injury. Experimental Neurology. 209 (2), 378-388 (2008).
Cummings, B. J., et al. Human neural stem cells differentiate and promote locomotor recovery in spinal cord-injured mice. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 102 (39), 14069-14074 (2005).
Beattie, M. S., Hermann, G. E., Rogers, R. C., Bresnahan, J. C. Cell death in models of spinal cord injury. Progress in Brain Research. 137, 37-47 (2002).
Metz, G. A., et al. Validation of the weight-drop contusion model in rats: a comparative study of human spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 17 (1), 1-17 (2000).
Faulkner, J. R., et al. Reactive astrocytes protect tissue and preserve function after spinal cord injury. Journal of Neuroscience. 24 (9), 2143-2155 (2004).
Cheriyan, T., et al. Spinal cord injury models: a review. Spinal Cord. 52 (8), 588-595 (2014).
Deleyrolle, L. P., Reynolds, B. A. Isolation, expansion, and differentiation of adult Mammalian neural stem and progenitor cells using the neurosphere assay. Neural Cell Transplantation: Methods and Protocols. , 91-101 (2009).
Singec, I., et al. Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology. Nature Methods. 3 (10), (2006).
Mignone, J. L., Kukekov, V., Chiang, A. S., Steindler, D., Enikolopov, G. Neural stem and progenitor cells in nestin-GFP transgenic mice. The Journal of Comparative Neurology. 469 (3), 311-324 (2004).
Xu, W., et al. Myelin basic protein regulates primitive and definitive neural stem cell proliferation from the adult spinal cord. Stem Cells. 35 (2), 485-496 (2017).
Sachewsky, N., et al. Primitive neural stem cells in the adult mammalian brain give rise to GFAP-expressing neural stem cells. Stem Cell Reports. 2 (6), 810-824 (2014).
Worthington Biochemical Corporation. Papain Dissociation System. , Available from: http://www.worthington-biochem.com/PDS/default.html (2018).
Mothe, A., Tator, C. H. Isolation of neural stem/progenitor cells from the periventricular region of the adult rat and human spinal cord. Journal of Visualized Experiments. (99), (2015).
Absher, M. Hemocytometer counting. Tissue Culture. , 395-397 (1973).
Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay. Journal of Visualized Experiments. (45), (2010).
Xiong, L., et al. Preconditioning with isoflurane produces dose-dependent neuroprotection via activation of adenosine triphosphate-regulated potassium channels after focal cerebral ischemia in rats. Anesthesia and Analgesia. 96 (1), 233-237 (2003).
Metz, G. A., Merkler, D., Dietz, V., Schwab, M. E., Fouad, K. Efficient testing of motor function in spinal cord injured rats. Brain Research. 883 (2), 165-177 (2000).
Hamers, F. P., Koopmans, G. C., Joosten, E. A. CatWalk-assisted gait analysis in the assessment of spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 23 (3-4), 537-548 (2006).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

Neurosphere Assay כדי להעריך את הפעלת אנדוגני תאי גזע עצביים במודל של עכברים של פגיעה בחוט השדרה מינימלי

במאמר זה

סיכום

תקציר

מבוא

פרוטוקול

תוצאות

דיון

גילויים

תודות

חומרים

מקורות

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

מאמרים קשורים