קציר ארס מרעלים חרקים טורפים וחרקים אחרים Heteropteran

Heteropteran venoms הם חומרים מנע בעוצמה ביו¹. לדוגמה, ההפרשות ארס/רוק של מדם פשפשים באגים לנשק (Triatominae) ו באגים המיטה (Cimicidae) מקלה על האכלה באמצעות שיבוש hemostasis². רעלנים אלה venoms יעד מרובים מסלולים כולל קרישת דם, הצטברות של vasoconstriction, כמו גם את הכאב, לגרד מסלולים. Venoms של רוב המינים heteropteran אחרים מותאמים כדי להקל על טריפה יותר מאשר האכלה דם. Venoms שלהם לגרום לשיתוק, מוות ניזול רקמות כאשר הוא מוזרק חסרי חוליות^3,4. כאשר הוא מוזרק חולייתנים, הארס שלהם יכול להיות גם השפעות דרסטית. לדוגמה, הזרקה של ארס של הבאג מתנקש Holotrichius innesi לתוך חולייתנים גורם לשיתוק שרירים וכאב, דימום; עכברים envenomated בחיידק הזה למות במהירות עקב שיתוק נשימה⁵.

מחקרים Transcriptomic פרוטיאומיה מבנית נחשפו הרכב החלבון של כמה venoms heteropteran. Venoms של מינים בריתרן עשירים פרוטאזות, אחרים אנזימים, ופפטידים וחלבונים של המבנה לא ידוע של פונקציה-^6,-^7,-⁸. נשיקות באגים ארס הוא עשיר משפחת חלבון triabin, שחבריה להשפיע עמוקות על קרישת דם, הצטברות של טסיות דם,^2,vasoconstriction⁹. עם זאת, לא ידוע איזה רעלים מושתתות רוב bioactivities של ארס. לדוגמה, ארס של באג נשיקות תפוחי האדמה Triatoma דווחה לעכב נתרן ערוצים¹⁰ולהיות שיכוך כאב, אבל הרכיבים אחראי להישאר להיות הובהר. כמו כן, לא ידוע איזה רכיבים של מתנקש באג ארס לגרום לשיתוק או כאב. תנאי הכרחי לזיהוי רעלים ממונה על שיועמדו bioactivities, ועל אפיון של מבנה ותפקוד של רעלים ארס הרומן, היא קבלת ארס.

ארס התקבל מ heteropterans על ידי electrostimulation^{5,6,7,8,11,12,13}, פרובוקציה של ההגנה תגובות^4,8, מכנית לסחוט את החזה^12,14,15,16, לנתח את ארס בלוטות^{8,17 ,18,19,20,21,22}, ויישום של אגוניסטים של קולטני אצטילכולין מוסקריניים²³. אם לשפוט את פוטנציאל היתרונות והחסרונות של כל שיטה, זה מורכב על ידי המורפולוגיה של בלוטות ארס heteropteran, אשר מורכב בלוטה הראשי עם שני לומן נפרד, בלוטת הראשי הקדמי (AMG) ואת בלוטת הראשי האחורי (PMG), כמו גם בלוטת אביזר המשויך (AG). אלו תאי בלוטת שונים מייצרים חלבונים שונים הפרשות, אשר עשוי להיות מתמחה עבור תפקודים ביולוגיים שונים, לרבות לכידת הטרף, הגנה, עיכול אקסטרה אוראלי^8,17. חרקים טורפים peiratine ו- ectrichodiine, AMG כבר קשור ללכידת טרף את PMG עם אקסטרה אוראלי עיכול¹⁷. עם זאת, ב- harpactorine באג Pristhesancus plagipennis PMG מתמחה עבור לכידת הטרף ועיכול ואילו AMG המשוערות להפריש ארס הגנתית⁸. היועץ המשפטי לממשלה תואר כבעל תפקוד הפרשה הקטנה ב חרקים טורפים⁸ או כאתר העיקרי של אחסון פרוטאז באגים מים ענק²³. . בבירור, עבודה נוספת נדרשת כדי להבהיר את הפונקציה של כל תא בלוטת בין תת-קבוצות heteropteran שונים, וכן לקבוע את הפונקציה של רוב הרעלים ארס. בדו ח זה נתאר פרוטוקולים עבור קציר ארס רעלים מן heteropterans לקראת מטרה זו.

פרוטוקול זה תואם מדיניות של אוניברסיטת קווינסלנד שנקבעו טיפול אחראי ובעלי חיים להשתמש של הוראה ומחקר (PPL 4.20.11) וכן הבריאות הלאומיים למחקר רפואי של המועצה קוד אוסטרלי על הטיפול ואת השימוש בעלי חיים למטרות מדעיות (8^th מהדורה 2013).

התראה: להקפיד כדי לא להיות envenomated בעת טיפול חרקים טורפים. לטפל כדי להגן על העיניים בעת טיפול מינים יורק ארס באופן הגנתי. . שמור על עצמך בכל רחבי לא לפגוע החיות ניסיוני. זה כולל ניטור לחץ על ריסון כגון גומיות ולהבטיח כי החדק אינה שבורה.

הערה: לחלופין, להרדים בעלי חיים על ידי חשיפה CO₂ ב 0.5-2 דקות או קירור ל- 4-10 ° C לפני ארס קציר ב שואף 1-3 כדי להקל על העברה בטוחה ואיפוק. Anaesthetization לא נדרשת בקפדנות אך עשוי להקל על איפוק בטוח של דגימות זריז או חזק. עם זאת, בעלי חיים חייב להיות ער כדי לאפשר ארס קציר. כאשר אתה מחליט אם ברצונו להוסיף מעכבי פרוטאז, זכור יישומים במורד הזרם.

1. קצירת ארס רעלים על ידי Electrostimulation

1. להשיג דגימות בשידור חי כדי לקצור רעלים.
2. פינצטה פלסטיק מוכן מראש לשימוש עם אלקטרודות חיוביים ושליליים רכוב על או עצה. להתחבר פינצטה חשמלית של electrostimulator או מקור מתח קבוע המאפשר התאמה של המתח.
   1. קטן (~ 10 מ מ), חרקים טורפים גדולים (~ 25 מ מ), השתמש מתח שיא של 15 ו-25 V בהתאמה.
   2. לשימוש heteropterans גדולים יותר כגון חרקים מים ענק, עד 40 V.
3. לרסן חרקים חיים על ידי חסון אותם כדי פלטפורמה, באמצעות גומייה על פני בית החזה.
4. מניחים בקצה החדק בעצה איסוף מתאימים. לשימוש חרקים טורפים, טיפ פיפטה P200. מחרקים מים ענק, חותכים את הגפיים טיפ P200 כדי להגדיל את גודל הצמצם.
   1. בעדינות להרים את חוטם עם זוג מלקחיים נקי סגור ודחף את הצמצם פתוח של קצה אוסף מעל לקצה של החדק.
   2. אם רצונך בכך, ספיגת ~ 5 µL מים הנדסה גנטית לפני הצבת החדק לתוך איסוף עצה. זה מפחית הפסדים של ארס שנותרו בתוך הטיפ, למרות ארס שנקטפו להיות מדולל.
5. החל electrostimulation. טובלים את האלקטרודות מגרה בג'ל מוליך, כגון גליצרול NaCl/50% 2.5 מטר. האלקטרודות חלות על בית החזה. עבור belostomatids, להחיל את שתי אלקטרודות על המשטח הגבי האחורי. של הראש.
6. חנות ארס כדי למנוע autodegradation. לאחר ארס הנמתח, במהירות להעביר אותו צינור ב-20 ° C או C º 60, או שפופרת המכילה קוקטייל מעכב פרוטאז.
7. חזור על שלבים 1.5 ו- 1.6 עד ארס מספיק נרכשת או ארס נוסף הוא המתקרב.

2. קצירת מרעלים ארס על ידי הטרדה

1. להכין חיות ארס קציר, מניחים בקצה החדק פרוזדור אוסף, כפי שמתואר בסעיפים 1.1 ו- 1.3-1.4.
2. אם ארס הנמתח באופן ספונטני, עבור לשלב 2.3. אם לא, להטריד את בעלי החיים על ידי בעדינות לגעת בה על הרגליים, הבטן אנטנות עם פינצטה עד ארס הוא מיוצר.
3. במהירות העברת ארס צינור ב-20 ° C עד C º 60 או שפופרת המכילה פרוטאז מעכב קוקטייל, אם רצונך בכך.

3. קצירת מרעלים ארס על ידי הטרדה של ארס "יריקה" מינים

1. להרדים, או חלקית להרדים, החרק לפני הסרתו של מארז שלה כדי למנוע כל יריקה הגנתית מוקדמת.
2. לעורר ארס יריקה התנהגות. מכילים ולמקם מחדש את החרק באמצעות המכסה עמוק של תקן 90 x 16 מ מ פטרי. החזק את המכסה האחורי מעט ו- 1-4 ס מ מעל החרק כדי למנוע הטיסה. חרקים ברוב יורק מספר פעמים, לעתים קרובות ברצף מהיר. ודא שכל הארס נאסף על החלק התחתון של המנה.
3. לאסוף את הארס בצד התחתון של הפטרי על ידי שטיפה עם 10 µL של מים הנדסה גנטית. במהירות להעביר אותו צינור ב-20 ° C או C º 60, או שפופרת המכילה קוקטייל מעכב פרוטאז.

4. קצירת ארס רעלים על ידי ניתוח בלוטת

1. להקריב את בעלי החיים. בכבדות להרדים או להרוג בעלי חיים באמצעות > 5 דקות חשיפה CO₂. צינור CO טהור₂ ישירות לתוך החורים-האוויר של מארז דיור של החיה.
2. חרק pin למגש לנתיחה. עבור חרקים טורפים, לנתח דרך השטח הגחון (4.3). מחרקים מים ענק, לנתח דרך המשטח הגבי (4.4).
3. דיסקציה הגחון
   1. הכנס שלושה פינים לתוך הבטן האחורי להחזיק את החרק ללא תקר בלוטות ארס.
   2. חותכים חתך קצר קו האמצע (גחוני) של הבטן בעזרת אזמל מיניאטורי. להשתמש במספריים מיניאטורי להרחיב את החתך קו האמצע anteriorly לראש, מקפיד לא נזק למבנים פנימיים גזורה שלד חיצוני בלבד.
   3. כדי לחשוף את המבנים הפנימיים, להפוך מספר חתכים לרוחב המשתרעת החתך קו האמצע לצד של החרק. לאחר מכן, להצמיד בחזרה כל כנף של שלד הגחון כדי לחשוף את המבנים הפנימיים.
   4. עבור חרקים טורפים גדולים, להפוך ארבעה חתכים לרוחב הבטן הבטן התיכונה, קדמי, בין הרגליים הראשון והשני, ולפני השלב הראשון.
4. דיסקציה הגבי
   1. הסר את הכנפיים בקרבת הבסיס. הכנס שלושה פינים לתוך הבטן האחורי להחזיק את החרק ללא תקר בלוטות ארס.
   2. חותכים חתך קו האמצע מהראש אל הבטן בעזרת מספריים זעירים ואזמל, מקפיד לא נזק למבנים פנימיים גזורה שלד חיצוני בלבד.
   3. לכפות בהפרש את שני החצאים של החרק. במקום מספר סיכות רוחבית לאורכו של החרק לעזוב את חלל פנימי חשוף.
   4. הסר את השרירים טיסה באמצעות פינצטה.
5. להציף את המגש לנתיחה. הוסף PBS עד החרק שקוע כדי לאפשר המבנים הפנימיים לעוף ולהיות דמיינו בקלות רבה יותר.
6. באמצעות פינצטה ומספריים מיקרו, הסר בזהירות החיבור ואת רקמות עצבים וקנה הנשימה. בלוטות ארס מופיעות מוארך, מבנים שקוף המשתרעת לאורך כל צד של הטבעת.
   1. לזהות בלוטת הראשי על פי מראהו האופייני, עם האחורי האונות הקדמיות, שני צינורות נפגשים? hilus.
   2. אם רצונך בכך, לזהות בלוטת אביזר ע י איתור את צינור מ- hilus. חינם בלוטת הראשי על ידי חיתוך צינוריות שני שמקורם hilus.
7. הקציר לומן בלוטת הרצוי. להעביר את בלוטת microcentrifuge על קרח המכילה 30 µL של PBS או PBS פלוס מעכב פרוטאז קוקטייל. לאנס הבלוטות עם סיכה חדה נקייה.
   1. מערבולת עבור 10 s ו צנטריפוגה (1 דקות, 5,000 × g, 4 ° C) כדי לרוקן את לומן בלוטת. הסרת רקמת בלוטות באמצעות פינצטה.
8. להבהיר את תמצית הרעלן. צנטריפוגה (5 דקות, 17,000 × g, 4° C) כדי להסיר את כל חלקיקי מוצק, שמירה על תגובת שיקוע ומחיקת בגדר. לאחסן ב-20 ° C או C º 60 כדי למנוע השפלה autoproteolytic.

מינים מסוימים של heteropteran, את harpactorine plagipennis פ ו reduviine את Platymeris ראדאמאנטיס, תשואה בצורה אמינה כמויות גדולות (5-20 µL) של ארס, בתגובה electrostimulation (טבלה 1). באופן כללי, רוב החרקים peiratine, reduviine ו- harpactorine תשואה ארס בתגובה בשיטה זו. בין חרקים stenopodaine, electrostimulation elicited ארס Oncocephalus sp. אבל לא Thodelmus sp. החרקים holoptiline ו- emesine שנדגמו לא נכנע ארס משמעותית (למשל מספיק לניתוח באמצעות ספקטרומטר מסה) בתגובה electrostimulation. Electrostimulation יכול לשמש גם כדי לקצור ארס belostomatid חרקים, חיפושיות הזבל דורסנית. עם זאת, electrostimulation של המים עקרבים (Nepidae) המושרה שחרור תוכן של בלוטות cephalic בלבד, ולא ארס של החדק. כשל לקצור ארס על ידי electrostimulation במינים מסוימים סביר בשל המורכבות המורפולוגית של בלוטות ארס, המנגנונים הפיזיולוגיים שליטה על שחרורו של ארס8.

בנוסף שחרור ארס electrostimulation, reduviids פ plagipennis, Havinthus rufovarius, ראדאמאנטיס פ וכתוצאה belostomatid את Lethocerus distinctifemur, רצון באופן ספונטני להוציא ארס של החדק במהלך הטיפול. הוצאה ארס כזה מלווה לעתים קרובות מציג הגנתית. ראדאמאנטיס פ גם יורקת ארס באופן הגנתי4, תופעה המתרחשת נחשים24 ו עכבישים25 אבל של אשר אנחנו לא מודעים של כל מיני reduviid אחרים.

ניסויים מרחביות-דף ו פרוטאומיקס מדגימים כי venoms לקצור ידי electrostimulation והטרדות הם עשירים בחלבון6,7,8. חלבונים מהווים אחוז גדול של ההווה החומרי, אך סביר גם כי venoms מכילים יונים אנאורגניים וחומרים אחרים. ארס מתנקש באג מתקבל על ידי electrostimulation והטרדה בדרך כלל מכיל למעלה ממאה פפטידים, חלבונים (איור 1, איור 2). ארס Belostomatid דווחה בעבר להיות עשיר lysophospholipids13. ספיגת אינפרא-אדום ספקטרום של ארס של הבאג מים belostomatine Diplonychus eques הם עקביים עם תוכן של חלבונים וגם lysophospholipids. עבור lethocerine ל' distinctifemur, נמצאו ראיות רק עבור חלבון ולא lysophospholipids6.

כפי שדווח על עכביש venoms26, ארס שנקטפו חרקים heteropteran סביר להניח נבדלים ריכוז והלחנה, בהתאם את החרק המשמש את השיטה שבאמצעותה היא נקצרת. UV ספקטרוסקופיה של ארס מדולל דגימות מציע ספיגת ערכים (280) של 50-250 (10 מ מ אורך נתיב) מדולל ארס, עקבי עם ריכוז חלבון גבוה של ~ 50-250 mg/mL7,12,19. מניעת טרף דווח לגרום עלייה רצופים ארס ריכוז ו המשותק פוטנציאליים3 , כמו גם ירידות רצופים pH27. עם זאת, הרעבה ממושכת תגרום לאובדן תנאי ומוות. כמו גם ריכוז, השיטה שבאמצעותה ארס הוא שנקטפו heteropterans עלול להשפיע על הקומפוזיציה שלה. ההרכב הרעלן של ארס של הבאג מתנקש plagipennis פ שונה במידה ניכרת בהתאם אם זה היה לקצור ידי electrostimulation או הטרדה8. במקרה של plagipennis פ, זה הוצגה להיות עקב electrostimulation מניב בתוכן PMG, ואילו הטרדה הניב את תוכן AMG. ארס מתקבל על ידי electrostimulation, אבל לא הטרדה, הטרף המשותק מנע בעוצמה חרקים (איור 3). עם זאת, לא ברור באיזו מידה תוצאה זו ניתן להכליל Reduviidae אחרים או פשפשים אחרים.

קציר ארס ישירות על-ידי לנתח בלוטות ארס מאפשרת מנגנוני הבקרה של בלוטות הארס בכדי שיפרו, במחיר של זיהום עם רקמת הבלוטות (הלא-ארס) חלבונים. ללא קשר, תמציות המתקבל ביתור חומר יכול לשמש עבור מבחני אתריים/רעילות. לדוגמה, תמציות של PMG, AMG AG של plagipennis פ, שהוכנו באמצעות פרוטוקול לעיל, נותחו באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית/טנדם ספקטרומטר מסה8. תהליך זה ניתן לזהות בסך 182, 114, וחלבונים 71 בסך הכל, מהן 45, 51 ו- 12 סווגו חלבונים בשם ארס בהתבסס על מאפייני רצף חומצות אמיניות, עם החלבונים שנותרו מסווגים חלבונים בשם משק בית. הזרקה של תמציות של PMG, אבל לא AMG או AG, לתוך חרקים גרמו לשיתוק ומוות8.

טבלה 1: טקסון יחודיות של שיטות השתמשו כדי לקצור ארס של heteropterans.

איור 1 : חלבונים זוהה על ידי LC-MS/MS ניתוח של 2D מרחביות-דף כתמים ושברים HPLC של ארס שנאסף פ plagipennis על ידי electrostimulation (פרוטוקול 1), מראה שופע פרוטאזות, גור-תחום חלבונים וחלבונים heteropteran ארס המשפחה 1. (א) 2D מרחביות-דף ג'ל של גולמי ארס plagipennis פ , מציג משפחות חלבון המזוהה על-ידי LC-MS/MS המקומות ג'ל. (B) HPLC chromatogram מן fractionation של ארס plagipennis פ , מציג משפחות חלבון המזוהה על-ידי ניתוח LC-MS/MS של שברים שנאספו. מרובה עם הרשאה7. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 2 : פרופורציה של רצפי השייכים לכל חלבון מרכזי בכיתה הארס של פ plagipennis. מרובה עם הרשאה7. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 3 : Plagipennis פ מתקבל על ידי electrostimulation, אבל לא הטרדה, ארס משתק חרקים. (א) ההשפעה של הזרקת הארס מתקבל על ידי electrostimulation או הטרדה, או מים, קריקט הבריחה. עבור כל תנאי ארס, ארס µL 0.17 המקביל היה מוזרק לתוך הבטן ואת הזמן לברוח עם המכסה הפוכה צלחת פטרי-(ב- s, ל-300 s, זאת אומרת ± SD) היה הבקיע. (B) מנה-תגובה עקומת עבור עיכוב של הצלחה לברוח על ידי ארס המתקבל plagipennis פ על-ידי electrostimulation. מרובה עם הרשאה8. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

המחברים אין לחשוף.