מאמר שיטה

מעקב ברמת הגנום של שגיאות תיעתוק היצורים האיקריוטים

DOI:

10.3791/57731

⸱

13 בספטמבר 2018

 ,  , 
1Center for Mitochondrial and Epigenomic Medicine, Children's Hospital of Philadelphia, 2Department of Cellular and Molecular Biology, University of Pennsylvania, 3Department of Biological Sciences, Mississippi State University, 4Center for Mechanisms of Evolution, Biodesign Institute, Arizona State University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מספק חוקרים עם כלי חדש כדי לפקח על הנאמנות של שעתוק אורגניזמים דגם מרובים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תמלול מדויק נדרש עבור הביטוי הנאמן של מידע גנטי. באופן מפתיע למרות, מעט מאוד ידוע על המנגנונים השולטים על הנאמנות של שעתוק. כדי למלא את הפער הזה של הידע המדעי, אנחנו לאחרונה ממוטב וזמינותו מעגל-רצף כדי לזהות שגיאות תיעתוק ברחבי transcriptome של האפייה, melanogaster דרוזופילה Caenorhabditis elegans. פרוטוקול זה יספק לחוקרים עם כלי חדש חזק כדי למפות את הנוף של שגיאות תיעתוק התאים האיקריוטים כך מנגנוני בקרה על הנאמנות של שעתוק יכולים להיות הובהר בפירוט חסר תקדים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הגנום מספק שרטוט ביולוגי מדויק של החיים. כדי ליישם תוכנית זו כראוי, חשוב על הגנום יש לשעתק בדייקנות נהדרת. עם זאת, תמלול סביר להיות נטולת שגיאות. לדוגמה, ה-RNA polymerases יש כבר זמן רב ידוע להיות מועדת לטעויות במבחנה1,2, לאחרונה זה הוצג כי הם מבצעים שגיאות ויוו וכן3,5,6, במיוחד כאשר קיימות עם ה-DNA נזק7,8,9,10. יחדיו, תצפיות אלה מציינים כי שגיאות תיעתוק מתרחשים ללא הרף כל התאים החיים, רומז שאולי הם מקור עשיר של חלבונים מוטציה.

התהליך הזה, הנקרא תעתיק מוטגנזה מכוונת, שונה מוטגנזה מכוונת קלאסית בשתי דרכים. ראשית, בניגוד מוטציות גנטיות, שגיאות תיעתוק להשפיע mitotic והן שלאחר mitotic תאים, כפי שהם אינם תלויים שכפול ה-DNA. לומד את המנגנונים להשפיע על הנאמנות של שעתוק, לכן, יספק תובנות בעלות ערך לתוך עומס מוטציה של תאים mitotic והן שלאחר mitotic. . מעניין, שגיאות תיעתוק לאחרונה היו מעורבים בקידום חלבון צבירת11,12,13 , היה שיערו לתרום שני carcinogenesis10 ו התפתחות עמידות לאנטיביוטיקה חיידקים14.

שנית, בניגוד מוטציות גנטיות, שגיאות תיעתוק אינם ארעי בטבע. קיומם הזמני הוא מאתגר במיוחד כי זה עושה שגיאות תיעתוק קשה מאוד לזהות. לדוגמה, בעוד מספר מעבדות המציאו כתב ערך מבחני לחקר מוטגנזה מכוונת תעתיק, מבחני אלה מסוגלים רק למדוד שגיאות תיעתוק במספר מוגבל של ההקשרים, מודל אורגניזמים4,15. כדי להתגבר על מגבלות אלה, חוקרים רבים פנו טכנולוגיה רצפי RNA (RNA-seq), המאפשר תיאורטית שגיאות תיעתוק שיירשמו ברחבי transcriptome של כל מין. עם זאת, מחקרים אלה הם בקלות מבולבל על ידי ספריית הבנייה חפצים, כגון שגיאות תיעתוק הפוכה, PCR הגברה שגיאות הטבע לשגיאות של רצף עצמה. לדוגמה, הפוך transcriptases התחייב כ שגיאה אחת בכל הבסיסים ~ 20,000, בעוד ה-RNA polymerases (RNAPs) צפויים לעשות שגיאה אחת בלבד בכל הבסיסים 300,0005,6. כי שיעור שגיאה של שעתוק במהופך לבד גמדים שיעור שגיאה של RNA polymerases בתוך תאים, זה כמעט בלתי אפשרי להבחין שגיאות תיעתוק האמיתי לבין חפצים הנגרמת על ידי הכנת ספריה בנתוני ה-RNA-Seq המסורתית ( איור 1a).

כדי לפתור בעיה זו, פיתחנו גירסה אופטימיזציה של המעגל-הרצף (Cirseq, או C-seq מעתה ואילך)5,assay16. Assay זה מאפשר למשתמש לזהות שגיאות תיעתוק והווריאנטים נדירים אחרים ב- RNA ברחבי transcriptome5. מעגלי-רצף וזמינותו שיישא את השם הזה כי צעד המפתח assay הזה סובב סביב ה-RNA circularization. פעם אחת המטרות RNA הם circularized, הם הפוכה עיבד באופן מעגל המתגלגל, לייצר מולקולות cDNA לינאריים המכילות עותקים רבים של אותה תבנית הרנ א. אם שגיאה היה נוכח באחת מתבניות אלה, שגיאה זו גם יהיה נוכח בכל חוזר יחיד בתוך המולקולה cDNA. לעומת זאת, טעויות שנעשות על ידי שעתוק במהופך, PCR הגברה או רצף נוטים להיווצר באקראי, ובכך יהיה נוכח חזרה אחד או שניים בלבד. לפיכך, על ידי יצירת רצף קונצנזוס עבור כל מולקולה cDNA, הבחנה שגיאות אקראי של שגיאות כל חזרה, ספריית הבנייה חפצים יכול ביעילות ניתן להפריד בין שגיאות תיעתוק אמיתי (איור 1b).

אם משתמשים בו כראוי, ניתן להשתמש וזמינותו C-seq במדויק לזהות קצב הבסיס החלפות, הוספות ומחיקות RNA ברחבי transcriptome של כל מין (ראה לדוגמה, טרוורס, Ochman17). לדוגמה, השתמשנו וזמינותו C-seq לספק מדידות ברמת הגנום של שיעור שגיאה של שעתוק האפייה, דרוזופילה melanogasterו Caenorhabditis elegans עם רזולוציה בסיס יחיד5 (לא פורסם תצפיות). במקור נהגו במדויק רצף אוכלוסיות וירוס רנ א, גירסה זו אופטימיזציה של C-seq וזמינותו התייעלה כדי למזער בתנאים קשים במהלך הכנת ספריה לתרום חפצים בניית ספריה. בנוסף, באמצעות מספר ערכות זמינים מסחרית, התפוקה של וזמינותו במידה רבה משופרת, כמו גם ידידותיות למשתמש שלה. אם משתמשים בו כראוי, וזמינותו הזה יכול לזהות במדויק אלפי שגיאות תיעתוק לכל שכפול, ובכך מיעיל באופן משמעותי על מחקרים קודמים6. בסך הכל, בשיטה זו מספק כלי רב עוצמה כדי ללמוד מוטגנזה מכוונת תעתיק, יאפשר למשתמש לקבל הרומן תובנות לגבי המנגנונים השולטים על הנאמנות של שעתוק במגוון רחב של אורגניזמים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנה

  1. RNases נמצאים בכל מקום; לכן, לנקות את סביבת העבודה ביסודיות על ידי התזה למטה עם ריאגנט טיהור (למשל, RNase משם) ו-70% אתנול. תרסיס למטה מכל פיפטות, עטים, או ארונות תקשורת צינור כדי להסיר את מקורות RNase זיהום פוטנציאליים.
  2. כדי למנוע עוד יותר RNases של מזהם את הדגימות, ללבוש חלוק המעבדה או שרוולים ארוכים חולצה של במהלך הניסויים. יש למנוע מגע בין הכפפות הפנימי של כל צינורות אשר ישמש, במיוחד כאשר איחזורם מתיבת או שקית.
  3. לפני שעתוק לאחור, משתנים לעתים קרובות כפפות.
    הערה: לקבלת תוצאות אופטימליות, לא להשהות את הניסוי לפני שעתוק לאחור.

2. תא בעלי חיים ותרבות אוסף

  1. אוסף וצמיחה של האפייה
    1. אם ספריית C-seq רצוי של שמרים, תחילה לחסן מושבה בודדת של cerevisiae ס ב- 3 מ"ל של בינוני המכיל תמצית שמרים, אדנין, peptone ו- dextrose (YAPD), דגירה אותו בן לילה ב 30 מעלות צלזיוס תוף המתגלגל.
    2. בבוקר, לחסן מחדש את התרבות ב- 50 מ של YAPD בינוני צפיפות אופטית (OD) של 0.1 ולגדול התאים עד שיגיעו OD של 0.5-0.7 (~ 7 x 106 תאים/mL).
    3. לאסוף את התרבות כולה 50 מ ל (כ- 350 x 106 תאים) צינור חרוטי 50 מ ל, לסובב את התאים עבור 3 דקות ב 2,100 x g. בזהירות להסיר את המדיום YAPD ולשטוף את גלולה פעם אחת עם 1 x PBS.
    4. לאחר מכן, resuspend בגדר µL 480 פירוק המאגר, µL 48 למען חברה דמוקרטית 10%, ו 480 µL באלכוהול פנול: כלורופורם: Isoamyl (25:24:1), pH 6.8. מערבולת המדגם במהירות המרבית עבור 5 s, והעברת לו כובע בורג 1.5 mL צינור עם 750 µL של חרוזי קריסטל קר כקרח (מסופק עם הקיט). המשך לשלב 3 של פרוטוקול זה כדי להפוך את פירוק התא הכולל החילוץ-RNA.
      הערה: כל ריאגנטים הנדרש עבור שלב 2.1.4 הינם מסופקים שמרים מומלץ ערכת חילוץ RNA. נוגדנים אלה לעבוד באותה מידה טוב של שמרים, תולעים וזבובים כך אחרי האוסף של שמרים (שלב 2.1), תולעים (שלב 2.2) או זבובים (שלב 2.3), גישה אחידה יכול לשמש ליצירת ספריות C-seq (שלבים 3-10).
  2. תרבות Caenorhabditis elegans אוסף
    1. אם ספריית C-seq רצוי של תולעים, להפקיד 30 תולעים בוגרות על צלחת אגר עם חיידקים OP50 טריים.
      הערה: חמישה לוחות מספיקים עבור שכפול 1.
    2. תרבות התולעים ארבעה ימים לאסוף את התולעים על ידי בעדינות שטיפת הצלחות עם 5 מיליליטר M9 מדיה ו בריכה התולעים לתוך צינור חרוטי בודד 50 מ.
    3. לסובב את התולעים למטה ב x 100 g למשך 2 דקות ליצור גלולה. להאט לצנטריפוגה במהירות הנמוך ביותר האפשרי לא להפריע בגדר.
    4. בעדינות להזיז את התולעים לתוך צינור 1.5 mL לשטוף אותם פעמיים ב 1.5 מיליליטר M9 מדיה, centrifuge את הצינור ב x 100 g עבור 1 דקות להסיר חיידקים ולהפיק גלולה µL נקי 100 של תולעים.
    5. Resuspend תולעים µL 480 פירוק המאגר, µL 48 למען חברה דמוקרטית 10% ו- 480 µL של פנול: כלורופורם: Isoamyl אלכוהול. מערבולת המדגם במהירות המרבית עבור 5 s והעברת לו כובע בורג 1.5 mL צינור המכיל 750 µL של חרוזי קריסטל קר כקרח. המשך לשלב 3 של פרוטוקול זה עבור פירוק של התולעים, החילוץ RNA הכולל.
  3. דרוזופילה melanogaster תרבות, אוסף
    1. אם ספריית C-seq רצוי מהזבובים, תרבות 20 – 25 זבובים בקבוקונים המכילים דקסטרוז או מדיום מבוסס-מולסה. Aliquot הזבובים מעל 3 שבקבוקי, כי כל בקבוקון מכיל כ 8 זבובים.
    2. כדי לאסוף את הזבובים, מקם את המבחנה לתוך דלי קרח עד הזבובים הם תרופות הרגעה. לאחר מכן, לאסוף אותם עם מכחול בשפופרת 1.5 mL. לא לאסוף הזבובים על ידי טיפול2 CO.
    3. אתן את הזבובים חמים לטמפרטורת החדר (RT), במהירות להוסיף תערובת premade של 500 µL פירוק מאגר µL 50 10% למען חברה דמוקרטית, µL 500 של אלכוהול פנול: כלורופורם: Isoamyl ברכבת התחתית. השתמש micropestle כדי לטחון את הזבובים עם-15 משיכות, מלווה על ידי חברת פיתול תנועה כשאחוז איחדו החלק התחתון של הצינור.
    4. שופכים את התערובת של זבובים, פירוק המדיה לתוך כובע בורג 1.5 mL צינור המכיל 750 µL של חרוזי קריסטל קר כקרח, מערבולת זה במהירות המרבית עבור להמשיך ס' 5 לשלב 3 של פרוטוקול זה עבור פירוק של הזבובים, החילוץ RNA הכולל.

3. טיהור RNA הכולל

הערה: בשלב זה, כל שלושת הפרוטוקולים מתכנסת, גישה אחת מאוחדת יכול לשמש ליצירת ספריות C-seq.

  1. לדפוק את הכובע על בחוזקה, לצרף את הצינור vortexer עם מתאם או סרט דביק. מערבולת הצינור במהירות מקסימלית 10 דקות lyse הדגימות. לאחר מכן, centrifuge את הדגימה ב x 16,100 g למשך 5 דקות להפריד את ממיסים אורגניים השלב מימית.
  2. בזהירות להסיר את µL 400 – 500 של שלב מימית מבלי להפריע את לאטמוספרה לבן, מעונן, ולהוסיף אותו צינור חרוטי 15 מ"ל המכיל 1.9 מ של איגוד מאגר. מערבבים אותם ביסודיות על ידי vortexing.
  3. מוסיפים 1.25 מ ל 100% אתנול ומערבבים את הדגימה על-ידי vortexing. להעביר µL 700 המדגם מחסנית מסנן התאספו בשפופרת איסוף ולסובב את הדגימה ב 14,500 x g ' חזור ' ס' 30 עד כל המדגם הוא עבר את מיכל הדיו.
    הערה: בשלב זה, הדגימה יכול להפעיל כמעצמה. אם תאים רבים מדי, תולעים או זבובים היו lysed, פוחת משקעים יכול להופיע כי ייתכן סותמים את המסנן.
  4. לשטוף את המסנן פעם עם 700 µL של שטיפת פתרון 1, ועם פעמיים 500 µL של שטיפת פתרון 2 או 3. לסיים את שוטף על ידי סחרור הדגימות ב x 14,500 g למשך 2 דקות להסיר את כל העודפים אתנול.
  5. להעביר את מחסנית מסנן צינור דולפין 1.5 מ"ל ולהוסיף µL 108 של פתרון • תנאי prewarmed (65 ° C).
    הערה: אף פעם לא לחשוף RNA דגימות לטמפרטורות גבוהות מ- 65 ° C לפני שעתוק במהופך, כפי עושה כל כך לעורר ציטוזין לאירועים דיאמינציה אורציל שאי אפשר להבחין בין שגיאות תיעתוק.
  6. לבזות את הזיהום DNA ב- RNA מבודד (ראה שלבים 2.1 – 3.4) על-ידי הוספת µL 11 של 10 x DNase אני מאגר µL 2 של RNase מעכב, µL 4 של DNase אני (8 U), דגירה אותם ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
  7. לאחר עיכול, להוסיף µL 11 של ריאגנט איון DNase. מערבולת התערובת ולתת לו לשבת ב RT במשך 5 דקות. לאחר מכן, centrifuge את הדגימה ב x 15,000 g למשך 3 דקות הצניפה הכימית איון ולאסוף µL 110 של תגובת שיקוע מבלי להפריע בגדר. להעביר את תגובת שיקוע צינור 1.5 מ.
    הערה: הכימית איון DNase יכול להיות די קשה pipet כראוי, אז באופן חזותי לבחון את הטיפ פיפטה לאחר כל פעולה pipetting. אם הכימית איון נעשית צמיגה יותר מדי כדי pipet, להוסיף 10 מ מ טריס-HCl (pH 7.4) שווה ל- 1/5 של אמצעי האחסון הנותרת.
  8. (בדיקת איכות) מודדים את ריכוז RNA הכולל שימוש ספקטרופוטומטרים. לאחר מכן להפריש 1 µL של RNA הכולל, למהול אותו כדי ריכוז של 10 ng/µL במים נטולי נוקלאז (NF). הפעל את הרנ א על מכשיר ניתוח נוקלאוטיד המתאים עם קלטת RNA רגישות גבוהה כדי להבטיח הרנ א לא יורד יש ערך ארין לפחות 8.5 או גבוה יותר (איור 2B).

4. mRNA העשרה

  1. לבצע את העשרת mRNA עם miniprep mRNA קיט (ראה טבלה של חומרים). להוסיף µL 140 NF מים לדוגמה עבור הנפח הכולל של 250 µL. לאחר מכן, הוסף 250 µL של 2 x מחייבת מאגר, לערבב את הדגימה ביסודיות על ידי vortexing, והוסף µL 15 של חרוזים oligo (dT).
  2. לערבב את הדגימה על-ידי pipetting זה למעלה ולמטה, דגירה זה ב 65 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות. אז, במקום המדגם-RT למשך 10 דקות. לבסוף, centrifuge את הדגימה ב x 16,100 g למשך 2 דקות הצניפה את מתחמי חרוז: mRNA.
  3. למחוק את תגובת שיקוע, resuspend בגדר ב 500 µL של שטיפת פתרון. להעביר את הפתרון עמודה ספין, תסבני 1 דקות ב 15,000 x g. למחוק את הזרימה דרך ולשטוף את הדגימה עם µL 500 נוספים של שטיפת פתרון. . ואז, לסובב את הדגימה למשך 2 דקות ב x 15,000 g כדי להסיר אתנול עודף כל המסננים ספין.
  4. להעביר את המסנן ספין צינור דולפין, resuspend בגדר בעמודת µL 80 של פתרון • תנאי prewarmed (65 ° C). דגירה המדגם 1.5 דקות ב 65 ° C, elute זה על ידי סחרור זה עבור 1 דקות ב 15,000 x g.
  5. למדוד את הריכוז של RNA מטוהרים באמצעות ספקטרופוטומטרים או כלי דומה המאפשר כימות של RNA ריכוז ואיכות.

5. RNase הפיצול השלישי ו- RNA לנקות

הערה: (חשוב) להכין מולקולות RNA מעגלי המתאים ליצירת ספריות C-seq, הרנ א חייבים להיות מפוצלים בערך 60 – 80 הבסיסים אורך. בעוד שיטות קודמות השתמשו של פיצול כימי למקטע RNA, פיצול כימי עם מתכות כבדות מציג נזקים הדגימות RNA יכול להיות כשייך שגיאות תיעתוק במהלך הניתוח הסופי. כדי לעקוף בעיה זו, מסתמכים במקום על פיצול שימוש RNase השלישי כדי ליצור שברים קטנים. יתרון נוסף של גישה זו אנזימטי הוא שיוצר מסתיים תואם הדרושות מצדו, obviating את הצורך סוף-תיקון לאחר פיצול כימי.

  1. להגדיר את התגובה פיצול RNA עם 1 µg של RNA מטוהרים, µL 10 תגובה מאגר µL 5 RNase השלישי, NF מספיק מים כדי להביא את אמצעי האחסון עד 100 µL (ראה טבלה של חומרים). להוסיף את האנזים האחרון, pipette את התערובת למעלה ולמטה לפחות 10 פעמים כדי לערבב. דגירה המדגם ב 37 מעלות צלזיוס במשך 25 דקות, אשר נוטה לייצר קטעים RNA של-60-80 הבסיסים אורך.
  2. לאחר סיום הדגירה 25 דקות, לנקות את התגובה מיד עם oligo לנקות, רכז קיט (ראה טבלה של חומרים) כדי למנוע כל עיכול נוספות. להוסיף 200 µL מחייב oligo מאגר לדגימת, לערבב את זה ביסודיות על ידי vortexing, ולהוסיף 800 µL של 100% אתנול. לערבב את הדגימה על ידי vortexing והעברתה לעמודה ספין שסופקו בשפופרת איסוף.
  3. Centrifuge הדגימה ב x 10,000 g s 30, לשטוף אותו עם µL 750 מאגר לשטוף כדי להסיר RNase השלישי. Centrifuge הדגימה ב x 10,000 g ב-30 s, למחוק את הזרימה דרך, ולשטוף המדגם עוד פעם עם µL 750 שטיפת מאגר כמתואר לעיל. לאחר הטיפול השני זרימה דרך מושלחת, centrifuge את העמודה ב 15,000 x g למשך 2 דקות להסיר את כל העודפים אתנול.
  4. להעביר את העמודה צינור טריים mL 1.5 ו- elute לדוגמה ב- µL 24 NF מים על ידי סחרור זה ב x 10,000 g עבור 1 דקות.
  5. בדיקת האיכות: לקחת 2 µL של השברים RNA מטוהרים, למהול אותו קיפול כפול על-ידי הוספת 2 µL של מים NF אליו. הפעל את הרנ א מפוצלים על קלטת מסך כדי להבטיח הרנ א מפוצלים בטווח של 50 – 100 בסיסים אורך (איור 2 c).

6. RNA Circularization, מתגלגל מעגל שעתוק במהופך

  1. כדי circularize את מקטעי RNA, חום-denature 20 µL של המדגם ב 65 ° C עבור 1 דקות ומניחים אותו על הקרח מיד למשך 2 דקות. לאחר מכן, להוסיף 4 µL של 10 x מאגר ליגאז T4 RNA, µL 4 10 מ מ ATP, µL 1 של RNase מעכב, 1 µL של מים NF ו 8 µL של 50% פוליאתילן גליקול (PEG).
  2. לערבב את הדגימה ביסודיות על ידי vortexing, ואז להוסיף 2 µL של 10 U µL של T4 רנ א ליגאז אני תמהיל המדגם שוב על-ידי pipetting זה, דגירה זה 25 ° c עבור 2 h ב- thermocycler עם הטמפרטורה של המכסה שוכן בגובה 30 ° C.
  3. לאחר 2 h, להוסיף 10 µL של מים NF המדגם ולנקות את הדגימה עם ערכת ניקיון וריכוז oligo בהתאם למפרט היצרן. Elute הדגימה ב 20 µL של מים NF.
  4. כדי להפוך לתעתק את מולקולות ה-RNA מעגלי, להוסיף 4 µL של 10 מ מ dNTPs µL 4 של 50 ng/µL hexamers אקראי, µL 9 NF מים µL 9 של RNA. לערבב הכל היטב על ידי pipetting, denature את הדגימה ב 65 ° C עבור 1 דקות, ומניחים אותו על קרח 2 דק החנות את הרנ א הנותרות בתור גיבוי.
  5. מוסיפים µL 8 המאגר הראשון-strand סינתזה x 5, µL 2 של 0.1 מ מ DTT ו 4 µL של 200 U/µL רוורס טרנסקריפטאז ומערבבים הכל על-ידי pipetting. דגירה המדגם ב 25 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ואחריו עם הדגירה 20 דקות ב 42 ° C עם המכסה להגדיר ב 5 ° C גבוה יותר מאשר הטמפרטורה הדגירה.
    הערה: רוורס טרנסקריפטאז עם סטרנד הדחק יכולות יש להשתמש בשלב זה כדי לאפשר שעתוק במהופך מתגלגל מעגל.
  6. להוסיף 10 µL של מים NF המדגם, לנקות את זה עם oligo לנקות וריכוז הקיט בהתאם להמלצות היצרן. Elute את מדגם 42 µL של פתרון • תנאי.
  7. בדיקת האיכות: למהול 2 µL של cDNA חד גדילי ב 2 µL של מים NF ולהפעיל את הדוגמית הזו על מכשיר ניתוח נוקלאוטיד עם קלטת RNA רגישות גבוהה. אם שעתוק לאחור עבד כמו שצריך, ספריית cDNA מולקולות, החל בערך 60 – 1,500 הבסיסים אורך, צריך להיות גלוי. באופן אידיאלי, רוב cDNA הוא בטווח של 500-1000 בסיסים (איור דו-ממדי).

7. שני סטרנד cDNA סינתזה ותיקון קצה

  1. להשתמש ערכת סינתזת גדיל השני כדי ליצור ספריית cDNA גדילי כפול. למקם את הדגימות הקרח ולהוסיף µL 30 NF מים µL 38 הדוגמית שלכם. לאחר מכן, להוסיף µL 8 של 10 x מאגר סטרנד השני ו 4 µL של האנזים סטרנד השניה ומערבבים המדגם מאת pipetting עדין לפני שלה הדגירה ב 16 ° C עבור 2.5 h.
  2. לנקות הדגימות עם oligo ניקיון וריכוז קיט על פי ההמלצות של היצרן עבור 100 תגובות µL, elute את הדגימות ב 38 µL של מים NF.
  3. להגדיר את התגובה סוף-תיקון על-ידי הוספת 20 µL של מים NF 35.5 µL של גדילי כפול cDNA, µL 6.5 סוף תיקון התגובה המאגר, 3 µL של סיום ההכנה אנזים מיקס. בזהירות לבדוק המאגר התגובה פוחת משקעים לבן, לפזר אותם על ידי חימום יד אם קיים.
  4. לערבב את התגובה סוף-תיקון על ידי pipetting, דגירה זה ב 20 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, ואחריו דגירה 30 דקות השני ב 65 º C. לקבוע את הטמפרטורה של המכסה thermocycler 5 ° C גבוה יותר מאשר הטמפרטורה הדגירה.

8. מתאם מצדו ובחירת גודל של ספריות מוכן

  1. להשתמש מודול הכנת ספריה רב שלבי ההכנות הסופי בספריה (ראה טבלה של חומרים). ראשית, לדלל את מתאמים עבור רצף 10-fold הדור הבא ב- 10 מ מ טריס-HCl כדי ריכוז סופי של 1.5 מיקרומטר. לאחר מכן, להוסיף 2.5 µL של מתאם מדולל 1 µL של מצדו משפר כל מדגם ומערבבים אותם על-ידי vortexing.
  2. להוסיף µL 15 של בלאנט/ת א ליגאז מאסטר לערבב, לערבב את זה על-ידי pipetting, דגירה זה ב 20 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. לאחר מכן, להוסיף 3 µL של האנזים מגיב ספציפית אורציל כריתה, דגירה זה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. עם השלמת מצדו, להוסיף µL 13.5 NF מים לדוגמה עבור הנפח הכולל של 100 µL והמשך בחירת גודל.
    הערה: מומלץ לבחור גודל עבור cDNA מולקולות הנמצאות בטווח של 600 – 800 הבסיסים אורך. אם מולקולות RNA מפוצלים היו כ- 60 – 80 הבסיסים אורך, בחירת עבור מולקולות שאינן 600 – 800 הבסיסים אורך יבטיח כי רוב המולקולות שנבחרו מכילים לפחות שלושה חזרה טנדם, אשר הינו אידיאלי עבור עיבוד במורד הזרם, ניתוח.
  3. כדי לבחור עבור מולקולות הנמצאות 600 – 800 bp אורך, להוסיף 30 µL של resuspended beads מגנטי (ראה טבלה של חומרים), זמן קצר RT, אחד לטעום ולערבב על-ידי pipetting. להעביר את הדגימה אל צינור 1.5 mL, דגירה זה ב RT במשך 5 דקות.
  4. מניחים את הדגימה על עמדה מגנטי עבור 5 דקות להפריד את החרוזים תגובת שיקוע. להעביר את תגובת שיקוע (המכיל את המולקולות cDNA המבוקש) ל mL 1.5 החדש צינור ולחסל החרוזים מגנטי (אשר מאוגדים גדול cDNA מולקולות).
  5. להוסיף aliquot טריים של 15 µL של beads מגנטי כל דגימות, לערבב ביסודיות על ידי pipetting, ואת תקופת דגירה של 5 דקות במקום RT. את הדוגמאות על מתלה מגנטי דגירה אותם למשך 5 דקות ב- RT. לאחר מכן, בזהירות להסיר, להיפטר supernatants, מוודא שלא להפריע את החרוזים.
    הערה: אל תשליך החרוזים מגנטי, עכשיו להכיל את cDNA היעד הרצוי.
  6. להוסיף 200 µL של 80% להתמחויות אתנול לכל אחת הדגימות מבלי להפריע את החרוזים מגנטי pelleted תקופת דגירה של ביטול ס' 30 האתנול, לשטוף את הדגימות. עוד פעם עם 80% אתנול. ואז, באופן מלא להסיר את עקבות של אתנול מדגימות מילה נהדרת את החרוזים עבור 5 דקות אך יש להקפיד לא לייבש יתר על המידה את החרוזים. אם החרוזים הם overdried, יופיעו סדקים כדורי.
  7. כדי elute דגימות מן החרוזים, להסיר את הצינורות הדוכן מגנטי ולהוסיף µL 19 10 מ מ טריס-HCl. Pipet זה למעלה למטה מספר פעמים כדי resuspended את החרוזים ואת דגירה הדגימות למשך 5 דקות ב- RT. אם החרוזים היו overdried, דגירה אותם > 10 דקות.
  8. למקם את הדגימות חזרה לדוכן מגנטי, דגירה אותם למשך 5 דקות להפריד את החרוזים תגובת שיקוע. בזהירות להסיר את µL 15 של תגובת שיקוע המכילה את הספריות cDNA מטוהרים, שנבחר בגודל של הצינורות, להעביר אותו צינור mL 1.5 טריים.

9. PCR הגברה וטיהור חרוז הסופי

  1. מוסיפים 5 µL של פריימר אוניברסלי 5 µL של פריימר אינדקס ייחודי (ראה טבלה של חומרים) לכל אחד מטוהר ספריית cDNA ומערבבים אותם באופן יסודי על-ידי pipetting. בזהירות לבדוק את התמהיל פולימראז מאסטר קריסטלים, פוחת משקעים אחרים, לחמם את תערובת הבסיס בעבודת יד עד התמוססות פוחת משקעים.
    1. להוסיף 25 µL של המיקס מאסטר פולימראז לדגימת, לערבב אותם על-ידי pipetting ובצע את התנאים אופניים מתחת הגברה PCR. להפעיל את דנטורציה הראשונית ב 98 ° C ל 30 s, ולאחר מכן לבצע צעד כפול PCR תגובה מאת denaturating הדגימות ב 98 ° C עבור 10 s וחישול/הרחבה של מוצרי ה-PCR-65 מעלות צלזיוס במשך 75 s (12 x), ואחריהם סיומת הסופי ב 65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, להחזיק לא מוגדר על 4 מעלות צלזיוס.
  2. לנקות את הספריות סופית על-ידי הוספת 45 µL של resuspended beads מגנטי ישירות אל התגובה PCR, לערבב אותם על-ידי pipetting, ואת דגירה אותם ב RT עבור 5 דק העברת לדוגמה כדי צינור 1.5 mL ומניחים אותו בתבנית עמדה מגנטי. תקופת דגירה זה של 5 דקות, למחוק את תגובת שיקוע, לשטוף אותו פעמיים עם שזה עתה הוכנו 80% אתנול ל 30 s.
  3. לאחר השטיפה השנייה לחלוטין להסיר האתנול מן המדגם, מילה נהדרת בגדר חרוז במשך 5 דקות, elute זה ב µL 35 של 0.1 x טה. Resuspend החרוזים מאת pipetting אותם, דגירה אותם ב RT עבור 5 דק המקום המדגם על הדוכן מגנטי ואחרי 5 דקות, להעביר 30 µL של תגובת שיקוע צינור mL 1.5 טריים. לאחסן את הספריות ב- 80 ° c
  4. בדיקת האיכות: למהול 1 µL של הספרייה הסופי µL 9 NF מים ולהפעיל את הדגימה כלי ניתוח DNA ייעודי עם שבב רגישות גבוהה; הרוב המכריע של cDNA צריך להיות בטווח של 600 – 800 bp אורך (2e איור).
  5. לאחר • תנאי, לשלוח. את הדגימות רצף על פלטפורמה רצף מקביל בנפט באמצעות קריאות לזווג-end bp 250 או 300 bp יחיד-end קריאות.

10. ביו-informatic ניתוח מעגל רצף נתונים

הערה: ניתוח ופרשנות של נתונים גולמיים של C-seq וזמינותו מחייבת צינור ייעודי ביו-informatic. תיאור סכמטי של הצינור ששימש עבור ניתוחים שלנו מתואר באיור3. הורד את הצינור ב- https://github.com/LynchLab/MAPGD.

  1. ראשית, לקצץ את הקריאות כדי להסיר מתאם רצפים ושיחות באיכות נמוכה בסיס עם cutadapt18, באמצעות סף ציון האיכות של 20.
  2. לאחר מכן, לזהות חוזר מקודד על ידי מולקולת RNA concatemerized באמצעות אלגוריתם המתאים כדי לזהות כל חזרה עם גודל מינימלי של 30 נוקלאוטידים וחוזר לכל היותר 2 אי-התאמות בין18. רצף הקונצנזוס שואבים אלה חזרה, לשמור על מעקב אחר של כל שיחות הבסיס ואת איכות המשויך ציונים-לכל תפקיד.
    הערה: כיוון שעתוק במהופך יכולה להתחיל בכל במיקום על מולקולת RNA circularized, תחילת שידור חוזר אינן תואמות בהכרח יונקות-סוף מולקולת RNA מפוצלים (ןלהל הנקודה מצדו). בהתאם לכך, רצף קונצנזוס לא ימפה באופן רציף נגד transcriptome המתאים, אשר מחייבת הזיהוי של הנקודה מצדו.
  3. כדי לזהות את נקודת מצדו, מפה של concatemer של רצף קונצנזוס נגד transcriptome הפניה באמצעות יישור דמוי פיצוץ כלי (בלאט)19.
    1. לשרשר שני מופעים של רצף קונצנזוס על מנת להבטיח כי הרצף ממופה מכיל מופע ללא הפרעה מלאה לפחות אחד של רצף מקטע RNA הראשוני. לאחר מכן, לסובב את רצף קונצנזוס להתחיל במיקום הנקודה מצדו החזוי.
  4. למפות את רצפי הקונצנזוס מסובב נגד הגנום באמצעות TopHat20 ולהשתמש את היישורים כדי לזהות כל פולימורפיזמים נוקלאוטיד יחיד (SNPs) אשר עלולים להיחשד על שגיאות תיעתוק.
  5. קוראים את שגיאות תיעתוק רצפי הקונצנזוס שסובבו ממופה ותבדוק אם השגיאות המועמד לעבור ארבע בדיקות נוספות.
    1. תחילה, ודא כי שגיאת תיעתוק אינו חופף עם הסנ פ (דרישה טיפוסי הוא קורא לפחות 20 צריך לכסות מסוים הבסיס ולא יותר מאשר 5% הקריאות עשויים לתמוך שיחה בסיס חלופי).
    2. שנית, בדוק רצף קונצנזוס נגזרת לפחות 3 חזרה טנדם, שכל אחד מהם קורא את אותו זוג בסיס; שלישית, לוודא כי הסכום על עשרות רבות של איכות של עמדה זו חייבת להיות מעל 100
  6. עבור הרביעית והאחרונה לבדוק, לסובב את רצף הסכמה של כל השילובים האפשריים (הדמיית כל העמדות אפשרי של הנקודה מצדו), למפות כל גירסה נגד הגנום הפניה באמצעות TopHat.
    הערה: אם אחד של הרצף שסובבו מוצא התאמה מושלמת הגנום, הנקודה המתאימה מצדו נחשב כיום הנכונה, יש לדחות את השיחה שגיאת תיעתוק.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כמו כל הגישות רצף מקביל בנפט, ניסוי C-seq מייצרת dataset מסורבל, גדול. עבור משתמשים בפעם הראשונה, זה יכול להיות קשה לטפל datasets אלה; לכן, מומלץ כי כל המשתמשים קשר של informatician-ביו מנוסה לפני הניסויים. בממוצע, הצפי הוא כי המשתמשים יפיק כ 55-70 גיגה בסיסים (Gbases) לכל הפעלה בפלטפורמות רצף מקביל מאסיבית ביותר. עבור פרוטוקול זה, בדרך כלל, 12 – 30 הדגימות היו מרובב לכל הפעלה כך עבור כל דגימה נרכשו כ- 2-6 Gbases. לאחר קיצוץ מתאם רצפים של שיחות הבסיס באיכות נמוכה (< 20) את הנתונים (dat...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מתארים את פרוטוקול ממוטב עבור הכנת C-seq ספריות איתור שגיאות תיעתוק האפייה, דרוזופילה melanogasterו Caenorhabditis elegans. פרוטוקול זה יש יתרונות רבים על פני הפרוטוקולים הקיימים, כמו גם טכניקות חלופיות.

במהלך 15 השנים האחרונות, מערכות כתב רבים פותחו המסתמכים על לוציפראז7,8 או Cre-לקס רקומבינציה3,4,15,<...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרסום זה התאפשר על ידי מימון גרנט T32ES019851 (ל ג Fritsch), R01AG054641, חוקר צעיר עפר להעניק (Vermulst מ').

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
ערכת טיהור RNA של RiboPureThermoFisherAM1926טיהור RNA כולל
ערכת טיהור mRNA של Genelute טיהור mRNASigma-AldrichMRN70-1KTטיהור
מים ללא נוקלאזAM9937סילוק ודילול
אמביון RNase IIIThermoFisherAM2290פיצול RNA
T4 RNA Ligase 1 (ssRNA Ligase)New England BiolabsM0204Sמעגל RNA
RibolockThermoFisherEO0381מעכב RNase
SuperScript III Reverse TranscriptaseThermoFisher18080044מעגל מתגלגל שעתוק הפוך
10 מ"מ dNTP mixThermoFisher18427013מעגל מתגלגל שעתוק הפוך
הקסמרים אקראיים (50 ng/µ L)ThermoFisherN8080127מעגל מתגלגל תמלול הפוך
NEB מודול סינתזה של גדיל שני ניואינגלנד BiolabsE6111Sסינתזת גדיל שני
ערכת הכנה לספריית NEBNext Ultra DNA עבור IlluminaNew England BiolabsE7370Sהכנת ספריית cDNA
NEB פריימרים אינדקס הבאNEBE7335SMultiplex PCR פריימרים
אוליגו קלין & רכזZymo ResearchD4061ניקוי דגימות RNA ו-DNA
DynaMag-2 מגנטThermoFisher12321Dטיהור חרוזים מגנטיים
AMPure XP חרוזיםבקמן קולטרA63881טיהור חרוזים מגנטיים
Eppendorf 5424 מיקרוצנטריפוגהFisherScientific05-403-93צנטריפוגה
INCU-Shaker 10 LBenchmark תרביתתאיםH1010
T100 Thermal CyclerBIO RAD1861096תנאי רכיבה בטמפרטורה בינונית עד גבוהה
PTC-200 Thermal CyclerGMI8252-30-0001 תנאי רכיבה בטמפרטורה נמוכה
RNase Awayמוצרים ביולוגיים מולקולאריים700S-11עיקור
50 מ"ל צינור צנטריפוגהקורנינג430290ללא נוקלאז
15 מ"ל צינור צנטריפוגהקורנינג430052
צינורות אפנדורףארה"ב מדעי1615-5500נוקלאז
4200 מערכת טייפסטישןAgilentG2991AAמכשיר לניתוח נוקלאוטידים לבקרת איכות של RNA ודגימות DNA חד-גדיליות
רגישות גבוהה RNA ScreenTape Agilent5067-5579בקרת איכות של RNA ודגימות DNA חד-גדיליות
RNA ScreenTape Sample BufferAgilent5067-5577בקרת איכות של RNA ודגימות DNA חד-גדיליות
RNA ScreenTapeLadder Agilent5067-5578בקרת איכות של RNA ודגימות DNA חד-גדיליות
2100 מכשיר ביו-אנלייזרAgilentG2939BAבקרת איכות DNA דו-גדילי
ערכת DNA ברגישות גבוההAgilent5067-4626בקרת איכות לדגימות cDNA כפולות
אמבט מיםVWR462-0244דגירה
NanoDrop 2000/2000C ספקטרופוטומטרThermoFisherND-2000Cקביעת ריכוז RNA
מדעית ללא נוקלאז ללא

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kireeva, M. L., et al. Transient reversal of RNA polymerase II active site closing controls fidelity of transcription elongation. Molecular Cell. 30, 557-566 (2008).
  2. Walmacq, C., et al. Rpb9 subunit controls transcription fidelity by delaying NTP sequestration in RNA polymerase II. The Journal of Biological Chemistry. 284, 19601-19612 (2009).
  3. Strathern, J., et al. The fidelity of transcription: RPB1 (RPO21) mutations that increase transcriptional slippage in S. cerevisiae. The Journal of Biological Chemistry. 288, 2689-2699 (2013).
  4. Irvin, J. D., et al. A genetic assay for transcription errors reveals multilayer control of RNA polymerase II fidelity. PLoS Genetics. 10, e1004532(2014).
  5. Gout, J. F., et al. The landscape of transcription errors in eukaryotic cells. Science Advances. 3, e1701484(2017).
  6. Gout, J. F., Thomas, W. K., Smith, Z., Okamoto, K., Lynch, M. Large-scale detection of in vivo transcription errors. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 110, 18584-18589 (2013).
  7. Viswanathan, A., You, H. J., Doetsch, P. W. Phenotypic change caused by transcriptional bypass of uracil in nondividing cells. Science. 284, 159-162 (1999).
  8. Bregeon, D., Doddridge, Z. A., You, H. J., Weiss, B., Doetsch, P. W. Transcriptional mutagenesis induced by uracil and 8-oxoguanine in Escherichia coli. Molecular Cell. 12, 959-970 (2003).
  9. Saxowsky, T. T., Doetsch, P. W. RNA polymerase encounters with DNA damage: transcription-coupled repair or transcriptional mutagenesis. Chemical Reviews. 106, 474-488 (2006).
  10. Saxowsky, T. T., Meadows, K. L., Klungland, A., Doetsch, P. W. 8-Oxoguanine-mediated transcriptional mutagenesis causes Ras activation in mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 105, 18877-18882 (2008).
  11. Vermulst, M., et al. Transcription errors induce proteotoxic stress and shorten cellular lifespan. Nature Communications. 6, 8065(2015).
  12. van Leeuwen, F. W., Burbach, J. P., Hol, E. M. Mutations in RNA: a first example of molecular misreading in Alzheimer's disease. Trends in Neurosciences. 21, 331-335 (1998).
  13. van Leeuwen, F. W., et al. Frameshift mutants of beta amyloid precursor protein and ubiquitin-B in Alzheimer's and Down patients. Science. 279, 242-247 (1998).
  14. Morreall, J. F., Petrova, L., Doetsch, P. W. Transcriptional mutagenesis and its potential roles in the etiology of cancer and bacterial antibiotic resistance. Journal of Cellular Physiology. 228, 2257-2261 (2013).
  15. Strathern, J. N., Jin, D. J., Court, D. L., Kashlev, M. Isolation and characterization of transcription fidelity mutants. Biochimica et Biophysica Acta. 1819, 694-699 (2012).
  16. Acevedo, A., Andino, R. Library preparation for highly accurate population sequencing of RNA viruses. Nature Protocols. 9, 1760-1769 (2014).
  17. Traverse, C. C., Ochman, H. Genome-Wide Spectra of Transcription Insertions and Deletions Reveal That Slippage Depends on RNA:DNA Hybrid Complementarity. mBio. 8, (2017).
  18. Martin, M. Cutadapt Removes Adapter Sequences From High-Throughput Sequencing Reads. EMBnet.journal. 17 (1), 10-12 (2011).
  19. Kent, W. J. BLAT--the BLAST-like alignment tool. Genome Research. 12, 656-664 (2002).
  20. Kim, D., et al. TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biology. 14, R36(2013).
  21. Zhou, Y. N., et al. Isolation and characterization of RNA polymerase rpoB mutations that alter transcription slippage during elongation in Escherichia coli. The Journal of Biological Chemistry. 288, 2700-2710 (2013).
  22. Reid-Bayliss, K. S., Loeb, L. A. Accurate RNA consensus sequencing for high-fidelity detection of transcriptional mutagenesis-induced epimutations. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 114, 9415-9420 (2017).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

RNASaccharomyces cerevisiaeDrosophila melanogasterCaenorhabditis elegansRNAT4 RNAPCR

מאמרים קשורים