עכברים נחשפים LPS בקרום הבטן מפרישים exosomes בנוזל שטיפה (BAL) Broncho-מכתשי הארוזים עם miRNAs. באמצעות מערכת תרבות משותפת, אנו מראים כי exosomes שוחרר בנוזל BAL לשבש את הביטוי של צומת חזק חלבונים בתאי אפיתל הסמפונות ולהגדיל את הביטוי של ציטוקינים פרו-דלקתיים זה להדגיש פגיעת ריאות.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
Exosomes Bronchoalveolar שטיפה בפציעה ליפופוליסכריד-induced ריאות זיהומית
במאמר זה
סיכום
תקציר
פגיעת ריאות חריפה (עלי), תסמונת מצוקה נשימתית חריפה (ARDS) מייצגים קבוצה הטרוגנית של מחלות ריאה, אשר ממשיכה יש תחלואה גבוהה של תמותה. בפתוגנזה מולקולרית של עלי זה להיות טוב יותר מוגדרים; עם זאת, בשל האופי המורכב של המחלה טיפולים מולקולריים טרם להתפתח. כאן אנו משתמשים דגם העכבר המושרה ליפופוליסכריד (LPS) של פגיעת ריאות זיהומית חריפה על התפקיד של exosomes בתגובה דלקתית. באמצעות מודל זה, הצלחנו להראות כי עכברים נחשפים LPS בקרום הבטן מפרישים exosomes בנוזל שטיפה (BAL) Broncho-מכתשי מהריאות הארוזים עם miRNA, ציטוקינים המסדירה תגובה דלקתית. עוד יותר באמצעות מערכת מודל תרבות משותפת, אנו מראים כי exosomes של מקרופאגים לשבש את הביטוי של צומת חזק חלבונים בתאי אפיתל הסמפונות. תוצאות אלו מראים כי הצלב לדבר 1) בין תאי מערכת החיסון ומבניים מולדת דרך exosomal הליכה הלוך ושוב לתרום התגובה דלקתית, שיבוש המכשול מבנית ואת 2) מיקוד miRNAs אלה עשויים לספק פלטפורמה חדשנית לטיפול עלי, ARDS.
מבוא
עלי ARDS הם הצורות סכנת חיים של כשל נשימתי עם hypoxemia חמורה נגרמת על ידי בצקת ריאות שאינה קרדיוגני אשר משפיע על 1 מיליון אנשים ברחבי העולם מדי שנה1. האטיולוגיה של ARDS כולל פגיעה ישירה אל הריאות מפני זיהומים או שאיפה ועוד מגוון של עלבונות עקיף. בעשור האחרון חלה הבנה מוגברת של מולקולרית בפתוגנזה של ARDS, עם זאת, טיפולים פרטניים יישוב ARDS הם עדיין להיות שפותחה2,3.
מספר מודלים חייתיים של פגיעת ריאות חריפה פותחו המספקות גשר לתרגום טיפולים ניסויים בבני אדם4,5. דגמים נפוצים כוללים התקנה מקומית של חומצה א....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
פרוטוקול הכולל דורש 2 ימים, כולל ביום הראשון של אלח דם אינדוקציה ובידוד של נוזל BAL החיה, ביום השני exosomes בידוד מן העכבר BALF. כל ההליכים נבדקו ואושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה ב אטלנטה VA medical center.
1. עכבר ריאות זיהומית חריפה פציעה מודל
- להשתמש 6-8 שבועות - בן זכר פראי-סוג C57BL/6J עכברים (משקל 20-22 גרם) לבעל החיים מודל, ולבצע כל ההליכים באמצעות טכניקות aseptic וכלי נגינה. אוטוקלב כל מכשירי ניתוח, כולל מלקחיים ומספריים במשך 20 דקות-121 מעלות צלזיוס.
- באופן אקראי להפיץ עכברים לתוך ניסיוני, קבוצת הביקורת. לרסן עכברים על לוח כירורגי. לטפל עכברים עם ליפופוליסכריד Escherichia coli (LPS,....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
כדי לגרום לפציעה ריאות זיהומית, טופלו עכברים LPS בקרום הבטן (15 מ"ג/ק"ג). בתוך 24 שעות של LPS מינהל, זרם neutrophilic נראתה בריאות, כפי שמוצג באיור 1A. העכבר BAL נוזל נמשך, ואחריו בידוד, טיהור של exosomes. המורפולוגיה של BALF exosomes אושר ע י שידור מיקרוסקופ (איור 1B).
ביטוי סלקטיבי miRNAs הפרו דלקתיים miRNA-155 מיר-146a התגלו על ידי q-RT-PCR מ exosomes מטוהרים. רמות ה.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
העכבר מודלים של מחלות משמשות כדי להעריך את תפקוד פיזיולוגי גנים ספציפיים וכדי להפחית את העלות של ניסויים2. הפגיעה ריאות זיהומית חריפה המתוארים כאן מחקה לתגובה דלקתית אצל בני-אדם עם ARDS. מודל זה רלוונטי לחקור בפתוגנזה מולקולרית, פיתוח של סמנים ביולוגיים, לבחון את פוטנציאל טיפולי חדש5.
תרבות משותפת מערכות הם רלוונטיים ללימודי אין ויוו בהקשר של חוקרים מנגנונים פוטנציאל ההעברה של מולקולות ביולוגיות כגון ה-RNA, DNA, ליפידים חלבון ב
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
עבודה זו נתמכה על ידי סקירה ההצטיינות VA 2I01BX001786-06A1 מימון ר'.
תודות
המחברים הכריזו אין ניגוד אינטרסים.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| lipopolysaccharide | Sigma-Aldrich | Escherichia coli 055:B5 | |
| PBS pH7.2(1X) | Life technologies | 20012-027 | |
| mirVana miRNA בידוד | ערכת תרמו פישר | 449774 | |
| TaqMan ביטוי גנים מאסטר מיקס | תרמו פישר | 4369016 | |
| mmu-miR-155 (002571) פריימר | תרמו פישר | 4427975 | |
| has-miR-146a (000468) פריימר | תרמו פישר | 4427975 | |
| פריימר U6snRNA תרמו | פישר | 4427975 | |
| TNF-α( Mm00443258_m1 ) פריימר | תרמו פישר | 4331182 | |
| IL-6 (Mm00446190_m1 פריימר | תרמו פישר | 4331182 | |
| ZO-1 (Mm00493699_m1 )פריימר | תרמו פישר | 4331182 | |
| מדיום חיוני מינימלי (MEM) | Thermo Fisher | 11095-072 | |
| Trysin-EDTA (0.05%) | Thermo Fisher | 25300054 | |
| Exosomes סומנו עם PKH67 עד PKH67 Green Fluorescent Cell Linker Mini Kit | סיגמא-אולדריץ' | MINI67-1KT | |
| עמודי ספין אקסוזום (MW3000) | תרמו פישר | 4484449 | |
| בקמן קולטר אופטימה L-100XP אולטרה-צנטריפוגה | בקמן קולטר | L-100XP | |
| צינורות צנטריפוגה ברורים במיוחד | בקמן קולטר | 344058 | |
| יישומי ביוסיסטמס 7500 מערכת PCR מהירה בזמן אמת | תרמו פישר | ||
| שידור מיקרוסקופים אלקטרונים (TEM) | JEOL Ltd | 120 קילו וולט TEM | |
| אולימפוס BX41 מיקרוסקופ | אולימפוס | BX41 |
מקורות
- Rubenfeld, G. D., Herridge, M. S. Epidemiology and outcomes of acute lung injury. Chest. 131, 554-562 (2007).
- Baron, R. M., Choi, A. J., Owen, C. A., Choi, A. M. Genetically manipulated mouse models of lung disease: potential and pitfalls.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
