הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

Fractionation subcellular של דגימות מדרכי העיכול טריים וקפואים

9.5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/57740

⸱

15 ביולי 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Genetics, Physical Anthropology and Animal Physiology, University of the Basque Country (UPV-EHU), Biocruces Health Research Institute, 2Endocrinology and Diabetes Research Group, Biocruces Health Research Institute, UPV-EHU, CIBERDEM

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לביצוע של fractionation סלולרית פשוטה לצורך הקמת מכשול ההפרדה subcellular של חלבונים cytoplasmic וגרעיני ב אנושי ביופסיות מעיים טריים וקפואים.

תקציר

המטרה של פרוטוקול זה היא fractionate רקמה אנושית מעיים מתקבל על ידי אנדוסקופיה לתוך תאים גרעינית, cytoplasmic לניתוח לוקליזציה של חלבונים ספציפיים או חלבון מתחמי במדינות רקמות שונות (קרי, בריא נגד המחלה). שיטה זו שימושית עבור fractionation של שתי דגימות רקמה מעיים טריים וקפואים; זה נגיש עבור כל המעבדות לא זמן רב.

מבוא

חלבונים להשתתף כמעט את כל הפונקציות הביולוגי בתוך תא, כל וריאציה במבנה שלהם, כמות או מיקום יכול להוביל תרחיש פתוגניים. רקמות מדגם fractionation שיטות הן בגישה שימושי כדי להפחית את המורכבות של מחלות הקשורות חלבון ניתוחים. מספר מחקרים להשתמש במידע לוקליזציה חלבון או להעשיר את חלבון מתא סלולרית ספציפית, אז עבור fractionation לשחזור של חלבונים שלמים פרוטוקול זה שימושי לענות על שאלות ביולוגיות מסוימות. לקביעת ההתאמה subcellular של חלבונים וניטור הפצה compartmental או אינטראקציות על הבסיס שלהם תנאים המחלה תסייע לזהות מחלה הקשורה הבדלים תפקודיים1,2. לכן, בשיטה זו שואפת reproducibly fractionate רקמת המעי ביופסיות, טריים וקפואים, לתוך תאים subcellular cytoplasmic וגרעיני.

דגימות הביופסיה מעיים מתקבלים באופן שגרתי במהלך אנדוסקופיה הליכים3 (איור 1), יכול לשמש ביעילות עבור כימות חלבון או לימודים immunoprecipitation. מאז דגימות רקמה מן המעי אפיתל יכיל חלבונים אשר עשויים להיות מעורבים ישירות בפתוגנזה המחלה4, דגימות ביופסיה מעיים הם מקור חשוב מאוד לצורך זיהוי מוצלח מעיים מחלות ספציפיות חלבונים. דגימות רקמה, החולה קפוא מאוחסנים יחד עם המידע הקליני הם משאבים שימושיים עבור חלבונים, הכנה מדגם לשחזור ופשוט הוא סוגיה מרכזית לספק מידע compartmental תא באמצעות הגבלת כמויות קפוא רקמות5.

ישנם מספר ערכות זמינים מסחרית לצורך הקמת מכשול ההפרדה של שברים הסלולר, אבל אלה יקרים יותר, בדרך כלל זמן רב יותר מאשר בפרוטוקול המוצג כאן. פרוטוקולים בהתבסס על צנטריפוגה הדרגתיים מרובים-צעד, מעברי צבע רציף גם בעבר שימשו את fractionation של מגוון התאית בתאים ברקמות שונות6,7. עם זאת, שמירה על מרקם של מעברי צבע רציף לעתים קרובות משימה קשה. פרוטוקולים דומה המבוסס על פירוק רציפים של ממברנות תוארו קודם לכן אבל הם בדרך כלל צריך יותר משני מאגרי, הידיים בזמן הוא עוד8 .

כאשר fractionating דגימות רקמה, לזכור את הרקמה הזאת דגימות נוכח תא התא, התא-מטריקס אינטראקציות כי הן לא נוכח בתאים בתרבית חשוב בעת הליך שאיבת חלבון. פירוט נאותה בין תאים מטריצה חוץ-תאית מבלי להשפיע על איכות החלבון יהיה גורם קריטי ב בידוד חלבון9רקמת המעי. ב פרוטוקול זה, אנשי קשר תא התא, התא-מטריקס הם קודם שבור, משחררים את התאים ומאפשר את המאגר להגיע אל התאים הבודדים. כדי למנוע ערבוב לפני fractionation חלבון-תא, פירוט של אנשי הקשר להתרחש מבלי לשנות את התקינות של התאים או את הקרומים גרעיני.

בשל העשרת של פרוטאזות שונים רירית המעי10, חשוב לשלוט השפלה חלבון במהלך החילוץ. כדי למזער את ההשפלה חלבון פוטנציאליים, מעכבי פרוטאז מרובים חייבים להיכלל במאגרי מיצוי חלבונים. בנוסף, אם תמציות עומדים לשמש עבור מבחני פונקציונלי, זה חיוני כדי למנוע את דנטורציה של חלבונים או proteolysis כמו זה יגרום לאובדן חלבון פעילות11. למטרה זו, הפרוטוקול מבוצע ב 4 ° C, phenylmethylsulfonyl טריים פלואוריד (PMSF) מתווסף המאגרים-ריכוז סופי של 0.1 מ מ רק לפני השימוש כדי לעכב עוד יותר proteolysis.

הצעד הראשון תא fractionation הוא שיבוש רקמות פירוק התא. כאמור, המטרה היא disaggregate את התאים ואת לשבור שאותם לפתוח במינימום נזקים. דגימות רקמה מעיים חייבת להיות הומוגני, התאים lysed כדי להשיג שבירה המרבי של קרום התא. ב פרוטוקול זה, אנו משתמשים במערבל שהעקב ממונע לשבור רקמת המעי אשר הוא הומוגני תוך שניות על-ידי פעולה vortexing במהירות גבוהה. לאחר המגון, תאי הרקמות מודגרת בתוך מאגר היפוטוניק יפרץ קרום התא, אך ימנע הגרעינים שלמים, ואחריו תוספת של חומר ניקוי denaturing (nonyl phenoxypolyethoxylethanol) מערבולת קצר להפרדת הגרעינים מתוך השבר cytoplasmic. לאחר הסרת הציטופלסמה, קרום גרעין התא הוא פרץ לתוך מאגר hypertonic ברעידות.

השיטה המוצגת כאן היא שיטה המתאימה עבור fractionation subcellular של ביופסיות מעיים טריים וקפואים זה הושגו במהלך הליכי אנדוסקופי, נע בין 2 ו- 10 מ"ג במשקל. את הפרוטוקול היא קלה, לשחזור ואת יכולה להתבצע באמצעות מכשור מעבדתי בסיסי, ריאגנטים בתוך פחות משעה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

מחקר זה אושרה על-ידי קרוסס אוניברסיטת אתיקה המנהלים, ניתוחים בוצעו לאחר הסכמה מדעת היה המתקבלים בכל המקצועות או הוריהם.

1. ביופסיה אוסף

הערה: דגימות ביופסיה מן התריסריון דיסטלי של המטופלים מתקבלים במהלך אנדוסקופיה אבחון שגרתי ניהול ביופסיות הטווח בין 2 ו- 10 מ"ג במשקל. הרקמה ביופסיה היא רקמה מורכבת המורכב לסוגי תאים שונים לרבות אפיתל, מערכת החיסון ותאי אנדותל. הגסטרואנטרולוגיה קליניים לבצע אנדוסקופיה את הבאים הוקמה הנחיות קליניות.

  1. הנח את הביופסיה על נייר סינון סטרילי רק לאחר אנדוסקופיה.
  2. להשתמש מלקחיים כדי להעביר את ביופסיות 1.5 mL צינורות, להשרות אותם עם PBS, ולמקם אותו לתוך cryotube.
  3. שמור צינורות על הקרח עד שהם מגיעים במעבדה.
    1. הפעל עיבוד של ביופסיות טריים באופן מיידי.
  4. ביופסיות קפוא, פלאש להקפיא את הביופסיה המכילים צינורות, לאחסן בחנקן נוזלי עד השימוש.
    הערה: חשוב לשמור על המדגם קפוא עד המאגר שהושלם קר 1 נוסף.

2. מאגר הכנה

הערה: לפני שמתחילים, תוספת המאגרים כדלקמן.

  1. להוסיף 1 מ"מ DTT (ריכוז סופי), מאגר פרוטאז, פוספטאז מעכב קוקטייל (1 x ריכוז סופי) למאגר היפוטוניק 1, hypertonic 2 (טבלה 1).
    1. להכין 1.5 מ של מאגר 1 ו- 150 µL מאגר 2 עבור דגימה. DTT יהיה למנוע החמצון של הדגימות.
  2. להכין מאגר שטיפת גרעינים על-ידי הוספת 1% דטרגנט (nonyl phenoxypolyethoxylethanol) כדי ריכוז סופי של 0.1% אל המאגר כבר שהושלם 1. להכין 1 מ"ל גרעינים מאגר שטיפת לדגימה.

3. ביופסיה המגון

  1. ביופסיות טריים
    1. מקום איחדו חד פעמיים את המיקסר ממונע. לוודא איחדו יגיע לתחתית הצינור.
    2. להוציא את הביופסיה מ cryotube ולמקם אותו צינור 1.5 מ עם טיפ פיפטה.
    3. להוסיף 200 µL מאגר שהושלם 1 צינור 1.5 מ.
    4. Homogenize את הביופסיה עם איחדו עד הרקמה מופרת לחלוטין ולשמור אותו בקרח.
    5. לאחר כל והביופסיות הם הומוגני להמשיך בשלב 4.
      הערה: יש לשנות בקווקז חד פעמי בין ביופסיות.
  2. ביופסיות קפוא
    התראה: להתמודד עם חנקן נוזלי בקפידה; מגע של חנקן נוזלי עם העור או העיניים עלול לגרום פגיעה חמורה מקפיא. להגן על כפות הידיים והעיניים תמיד בעת עבודה עם חנקן נוזלי.
    1. קח כמה חנקן נוזלי בתוך קופסה לאחסון את cryotubes שאוחזר למיכל חנקן.
    2. למצוא את הביופסיה במיכל חנקן ולמקם את cryotube בתיבה עם החנקן הנוזלי. חזור על שלב זה עבור כל והביופסיות.
    3. להעביר את הביופסיה cryotube צינור 1.5 מ.
      הערה: ביופסיות תצורף הצינור קפוא. לדחוף את הביופסיה עם טיפ פיפטה סטרילי אז זה הם ינותקו מהצינור.
    4. להוסיף 200 µL מאגר שהושלם 1.
    5. Homogenize הרקמה באמצעות שהעקב ופצצות מרגמה עד הרקמה מופרת לחלוטין, שמירה על הטמפרטורה ב 4 מעלות צלזיוס לאורך כל ההליך.
      הערה: אל תתנו ביופסיות להפשיר לפני הוספת המאגר.

4. ציטופלזמה בידוד

  1. דגירה ביופסיה homogenized על קרח למשך 10 דקות.
  2. להוסיף 10 µL של 1% סבון (nonyl phenoxypolyethoxylethanol) כל דגימה כדי ריכוז סופי של 0.05%.
    הערה: תאים ויוצרים פרץ על ידי פירוק osmotic כמו הנוזל מתון ישבש את קרום התא.
  3. דגירה על קרח למשך 5 דקות.
  4. מערבולת בקצרה, צנטריפוגה ב 400 x g ב- 4 הלעפה תרוטרפמט למשך 2 דקות.
  5. לאחר vortexing, להסיר את תגובת שיקוע, להעביר אותו צינור נקי mL 1.5; זה יהיה השבר cytoplasmic. אל תמחק את גלולה.

5. גרעיני בידוד

  1. Resuspend בגדר מהשלב הקודם עם 200 µL גרעינים שטיפת המאגר.
  2. Centrifuge את הצינור למשך 2 דקות 400 x g ו- 4 מעלות צלזיוס.
  3. למחוק את תגובת שיקוע, חזור על התהליך הכביסה פעמיים נוספות.
    הערה: מנקי יסיר cytoplasmic זיהום בהשבר הגרעין.
  4. לאחר לשטוף את השלישי, resuspend בגדר ב 100 µL מאגר 2.
  5. לנער את הדגימה נמרצות ב 4 הלעפה תרוטרפמט במשך 30 דקות לחלופין, דגירה המדגם על קרח, מערבולת כל 5 דקות.
  6. לאחר טלטולים, centrifuge את הדגימה 10 דקות בשיא המהירות (> 12,000 x g) ו- 4 מעלות צלזיוס.
  7. לאחר vortexing, להעביר את תגובת שיקוע לתוך 1.5 נקי חדש. mL שפופרת. זה יהיה השבר הגרעין.

6. חלבון כמת

הערה: לכמת את החלבונים עם bicinchoninic חומצה (BCA) חלבון assay ערכת. ריכוז חלבונים בהשברים ינוע בין 0.5 ל- 5 µg/µL, להיות נמוך השבר הגרעין (ראו טבלה 2 ריכוז חלבון הנובעת מ- 2 מ ג ביופסיות).

  1. להכין עיקול רגיל עם כמויות (µg) אלבומין שור (BSA) שלהלן12: 0-0.5-1-2-3-4-5-6.
  2. הכינו את ריאגנטים הדרושים לשימוש µL 100 של המיקס הסופי BCA לדגימה.
  3. פיפטה 2 µL של כל שבר חלבון במנת טוב 96, להוסיף את תערובת BCA, בצע את הוראות היצרן עבור הקריאה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

איור 1 מראה של צביעת אאוזין hematoxylin של מקטע המעי ביופסיה עם שלם villi ומבנים הקריפטה.

התוצאות נציג של fractionation גרעינית, cytoplasmic באמצעות פרוטוקול זה מוצגים נתוני 2 ו- 3. בניסוי שמוצג באיור 2, רעננה (Fh) ו- (Fz) קפוא ביופסיה בעת ובעונה אחת היו fractionated בעקבות פרוטוקול המובאת כאן, אבן חשופה המערבית התבצע בעזרת μg 20 של כל ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הפרוטוקול המתואר כאן משמש את fractionation גרעינית, cytoplasmic של ביופסיות מעיים. החלבונים מטוהרת הם לא שפגע בסימני והוא יכול לשמש לא רק בניתוח תספיג כמוצג באיור 2 ו- 3 אלא גם מבחני הדורשים מקופלת מקורי חלבונים כגון immunoprecipitation, electrophoretic ניידות shift assay (EMSA) או יליד לזיהוי בג'ל (עמוד).

השיטה המתוארת מסתמך על המגון מכני של הרקמה יחד עם פירוק osmotic להתפוצץ קרום התא מבלי להשפיע על קרום גרעיני. התוצאה היא fractionation נקי של שנ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף.

תודות

מחברים להכיר את הסיוע של לופז Ander ו Miren Telletxea הקלטה ועריכה וידאו. ACR ממומן על-ידי התחברות Ikerbasque של פרויקט מחקר שבסיסה Celiacos דה מדריד (ACM). מחדרהמלון הוא ממומן על ידי פרויקט ISCIII-PI16/00258, והיתה שותפה במימון מאת האיחוד האירופי ERDF/ESF "דרך להפוך את אירופה". הוא ממומן על ידי מענק פרוייקט מחקר 2015111068 של מחלקת הבריאות בסקית. IRG מלכה פרחיה נתמכים על ידי מענקים מלגת predoctoral את UPV/EHU והבסקים משרד החינוך, בהתאמה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
HEPESSigma AldrichH4034-1kg
KClSigma AldrichP9333-1kg
EDTASigma AldrichE9884-100G
NaClSigma Aldrich5588886-1kg
DTTSigma Aldrich10197777001
PMSFThermo Scientific36978
מעכבי פרוטאינאז ופוספטאזThermo ScientificA32959
NP-40 Sigma AldrichCA-630חומר ניקוי
BCA מבחן ThermoScientific23227ערכת כימות חלבון
עלי פלסטיק חד פעמייםSigma AldrichZ359947-100EA
Dounce הומוגנייזרVWR431-0100
מיקרוצנטריפוגהEppendorf5415-R
שייקרIKAMS3 בסיסי

מקורות

  1. Cox, B., Emili, A. Tissue subcellular fractionation and protein extraction for use in mass-spectrometry-based proteomics. Nature Protocols. 1 (4), 1872-1878 (2006).
  2. Itzhak, D. N., Tyanova, S., Cox, J., Borner, G. H. Global, quantitative and dynamic mapping of protein subcellular localization. eLife. 5, (2016).
  3. Preedy, V. R., Watson, R. R., Ronald, R. Methods in disease investigating the gastrointestinal tract. , Greenwich Medical Media. (1998).
  4. Alex, P., Gucek, M., Li, X. Applications of proteomics in the study of inflammatory bowel diseases: Current status and future directions with available technologies. Inflammatory bowel diseases. 15 (4), 616-629 (2009).
  5. Ericsson, C., Franzén, B., Nistér, M. Frozen tissue biobanks. Tissue handling, cryopreservation, extraction, and use for proteomic analysis. Acta oncologica (Stockholm, Sweden). 45 (6), 643-661 (2006).
  6. Hoffmann, K., et al. New application of a subcellular fractionation method to kidney and testis for the determination of conjugated linoleic acid in selected cell organelles of healthy and cancerous human tissues. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 381 (6), 1138-1144 (2005).
  7. Foster, L. J., et al. A Mammalian Organelle Map by Protein Correlation Profiling. Cell. 125 (1), 187-199 (2006).
  8. Baghirova, S., Hughes, B. G., Hendzel, M. J., Schulz, R. Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells. MethodsX. 2, e440-e445 (2015).
  9. Börner, A., et al. Subcellular protein extraction from human pancreatic cancer tissues. BioTechniques. 46 (4), 297-304 (2009).
  10. Antalis, T. M., Shea-Donohue, T., Vogel, S. N., Sears, C., Fasano, A. Mechanisms of disease: protease functions in intestinal mucosal pathobiology. Nature clinical practice. Gastroenterology. 4 (7), 393-402 (2007).
  11. Cutler, P. Protein purification protocols. , Humana Press. (2004).
  12. Walker, J. M. The Bicinchoninic Acid (BCA) Assay for Protein Quantitation. The Protein Protocols Handbook. , 11-14 (1996).
  13. McLane, L. M., et al. Differential localization of T-bet and Eomes in CD8 T cell memory populations. Journal of immunology (Baltimore, Md.: 1950). 190 (7), 3207-3215 (2013).
  14. Nguyen, K. T., Holloway, M. P., Altura, R. A. The CRM1 nuclear export protein in normal development and disease. International journal of biochemistry and molecular biology. 3 (2), 137-151 (2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Western BlotHSP90 Tubulin
Fractionation subcellular של דגימות מדרכי העיכול טריים וקפואים
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.