הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

ניתוח גנטי של Transthyretin Ala97Ser תורשתיות הקשורות עמילואידוזיס

7.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/57743

⸱

9 ביוני 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Traditional Chinese Medicine, Division of Chinese Acupuncture and Traumatology, Chang Gung Memorial Hospital Linkou Medical Center and Chang Gung University College of Medicine, 2Department of Neurology, Chang Gung Memorial Hospital Linkou Medical Center and Chang Gung University College of Medicine

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לאשר הנוכחות של נקודת מוטציה לאבחון של עמילואידוזיס transthyretin תורשתי, Ala97Ser, המוטציה אנדמיים הנפוץ ביותר בטייוואן, כדוגמא.

תקציר

בדיקה גנטית היא הבדיקה האמינה ביותר עבור transthyretin תורשתי הקשורים עמילואידוזיס צריכה להתבצע ברוב המקרים של transthyretin עמילואידוזיס (הפו). הפו היא מחלה נדירה אך קטלנית עם פנוטיפים הטרוגניות; לכן, האבחנה לפעמים מתעכב. עם הגדלת תשומת לב והכרה רחבה יותר על הגילויים המוקדמים של הפו, כמו גם טיפולי המתעוררים, מחקרים האבחון המתאים, כולל את transthyretin (TTR) גנטי לבדוק, כדי לאשר את סוגי, ולכן הם וריאציות של הפו היסוד כדי לשפר את הפרוגנוזה. ניתוח גנטי עם שיטות (PCR) תגובת שרשרת של פולימראז ולאשש את קיומן של מוטציות נקודה TTR הרבה יותר מהר ובטוח יותר מאשר בשיטות המקובלות כגון תספיג דנ א. במסמך זה, נדגים אישור גנטי של המוטציה Ala97Ser הפו, המוטציה אנדמיים הנפוץ ביותר בטייוואן. הפרוטוקול כוללת ארבעה שלבים עיקריים: איסוף דגימות דם, הפקת דנ א, ניתוח גנטי של כל ארבע TTR exons עם PCR, ואת רצפי DNA.

מבוא

Transthyretin (TTR) עמילואידוזיס (הפו) היא הצורה הנפוצה ביותר של עמילואידוזיס מערכתית תורשתי1, עלולה להיגרם כתוצאה מוטציה דומיננטית תורשתית אוטוזומלית ג'ין transthyretin (TTR)2. מוטציות TTR יציבות מבנה החלבון tetrameric, להוביל דיסוציאציה שלה לתוך מונומרים זה ומרכיב לתוך הסיבים עמילואיד2. יותר מ-100 מוטציות TTR amyloidogenic כבר דווח על ברחבי העולם1. ניתוח גנטי עם שיטות (PCR) תגובת שרשרת של פולימראז לאשר הנוכחות של מוטציה נקודת TTR ויש יתרונות כולל הימנעות הטיפול radioactively שכותרתו הגששים בהשוואה תספיג דנ א3. PCR הוא מהיר, קל, זול ואמין טכניקה שהוחלו לשדות רבים מדעי מודרני4.

אבחון מוקדם של המחלה מתקדמת, חמורה הוא מאתגר בהתחשב הטרוגניות פנוטיפי שלה. עם הגדלת תשומת לב והכרה רחבה יותר על הביטויים המוקדמים של הפו, כמו גם טיפולים המתעוררים5, מחקרים האבחון המתאים, כולל בדיקות גנטיות TTR ולכן הם אנושות הבסיסית כדי לשפר את הפרוגנוזה. יתר על כן, מוטציות שונות קשורים עם penetrance שונים של התכונה, הגיל של תחילת, דפוסים של התקדמות, חומרת המחלה, חציון ההישרדות, היעילות של השתלת כבד, או מייצבים TTR2,6, ו מעלות משתנה במעורבות נוירולוגית, תרופות, אשר יש השלכות נהדר על יעוץ גנטי-7,-8,-9. חוץ מזה, בדיקה גנטית ומדויקים הוא הכלי היחיד אשר מבדיל בין שני סוגי הפו ברורים: תורשתי (מוטציה) וסוג הפרוע (טופס שאינו-מוטציה, עמילואידוזיס מערכתית סנילי, הסוכן המיוחד)7. זה הכרחי כדי לאשר את סוגי הפו, כי הטיפולים קיימים הבדלים2. לכן, אין הצורך הגובר לתאר את הפרוטוקול stepwise של הבדיקה הגנטית TTR.

הגישה מולקולרית כדי לזהות את המוטציה יומחשו באמצעות Ala97Ser, המוטציה אנדמיים הנפוץ ביותר בטייוואן, כדוגמה. שינויים בשלב הפקת דנ א להפחית את כמות הפתרונות שלושה בשימוש ותשואות כמות מספקת של ה-DNA. פרוטוקול זה, כל ארבע TTR exons נותחו, בעוד אזורים כולל 5' במעלה הזרם, 3' במורד הזרם, היזמים, אינטרונים, אזורים לא מתורגם (UTR) היו לא רציף.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

בדיקה שבוצעה במעבדה בוצע בהתאם לדרישות של קלינית מעבדה שיפור תיקונים (CLIA) בשנת 1988, התקנות שאושרו על-ידי מוסדיים סקירה לוח של צ'נג קונג אנדרטת החולים ו האוניברסיטה (רשיון מס ' 100 - 4470A3 ו- 104-2462A3). הסכמה מדעת היה המתקבלים לכל החולים.

1. דם דוגמה אוסף

  1. לאסוף דם לתוך צינורות שטופלו EDTA זמינים מסחרית. לערבב בעדינות, לאחסן דגימת דם ב 4 ° C עד עיבוד.

2. DNA החילוץ מדם היקפי

להשתמש ערכת חילוץ DNA להפקת DNA גנומי (ראה טבלה של חומרים).

  1. להוסיף 10 מ של פתרון 1 דגימת הדם 4.0 מ"ל. דגירה המדגם על קרח למשך 10 דקות.
  2. Centrifuge הדגימה ב g x 2,000 דקות 5-4 מעלות צלזיוס. להסיר ולמחוק את תגובת שיקוע בקפידה. Resuspend בגדר ב- 3 מ"ל של פתרון 1.
  3. Centrifuge המדגם-g x 2,000 עבור 5 דקות ב 4 ° C שוב ולמחוק את תגובת שיקוע. Resuspend בגדר ב- 3 מ"ל של פתרון 2.
  4. להוסיף 10 µL של pronase מניות פתרון (225 מ"ג/מ"ל) כדי לקבל ריכוז הסופי של µg 100/מ"ל ומערבבים היטב. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
  5. להרגיע את הצינורית על קרח במשך 10 דקות הוסף 0.8 מ של פתרון 3 לדגימת, היפוך 3 - 5 פעמים. במקום מדגם על קרח למשך 5 דקות.
  6. Centrifuge הדגימה ב 3000 g x למשך 15 דקות ב 4 º C. להעביר בזהירות את תגובת שיקוע שפופרת צנטרפוגה חרוט סטרילי 15 מ"ל.
  7. הוסף µL 6 בפתרון RNase מניות (10 mg/mL) כדי לקבל ריכוז סופי של 20 µg/mL. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
  8. להוסיף 2.5 מ ל אלכוהול איזופרופיל, לערבב היטב על-ידי היפוך בעדינות מספר פעמים, כדי לזרז את הדנ א (קווצות חומר לבן, צימרי, דמויי אניץ יהוו). שימוש pipet נשא גדול, להעביר את precipitant DNA שפופרת צנטרפוגה 1.5 mL החדש.
  9. צנטריפוגה ב 12,000 x g עבור מינימום 3-4 מעלות צלזיוס. תבטל את תגובת שיקוע בקפידה. צניפה לשטוף את הדנ א על-ידי הוספת µL 500 של 70% אתנול.
  10. תגובת שיקוע צנטריפוגה-g x 12,000 עבור 1 דקות וזורקים. האוויר יבש DNA צניפה בטמפרטורת החדר. להוסיף 100 µL של ddH2O, דגירה-65 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות עד resuspend ה-DNA.

3. הדנ א כמת

להשתמש ספקטרופוטומטרים (ראה טבלה של חומרים) כדי לזהות את כמות ואיכות הדנ א הגנומי.

  1. להיכנס לתוך המחשב מחובר למכונה ספקטרופוטומטרים. פתח את התוכנה.
  2. אתחול המכשיר ספקטרופוטומטרים:
    1. לחץ על "חומצת גרעין" על התוכנה ספקטרופוטומטרים.
    2. לנקות את המעמד עם מגבון נייר חד פעמיות, מים מורתחים.
  3. בלנק ספקטרופוטומטרים:
    1. לטעון את 2 µL של מים מטוהרים על הכן.
    2. הנמך את הזרוע העליונה של ספקטרופוטומטרים ולחץ על "ריק" לכיול.
    3. כאשר זה נעשה, להרים את הזרוע ויבש את המעמד עם מגבון.
  4. למדוד את הדגימה:
    1. לחץ על "ה-DNA-50" על סוג הדגימה.
    2. לטעון µL 2 של דנ א על הכן.
    3. להוריד את הזרוע ולחץ על "מדד" כדי למדוד את היחס A260/A280, הריכוז של המדגם.
    4. לנקות את המעמד בין כל הפעלה עם מגבון, מים מורתחים.
  5. לחץ על "Print Screen" כדי לאסוף את הנתונים.

4. גנטית ניתוחים של מוטציות

להגביר את המטרה DNA עם ה-PCR4. לבצע PCR בתגובה 25 µL תערובת באמצעות של ה-DNA פולימראז קיט (ראה טבלה של חומרים). טבלה 1 מציגה הגן TTR תחל intronic.

ג'יןפריימר רצף
Exon1F: 5'-TCAGATTGGCAGGGATAAGC-3'
R: 5'-GCAAAGCTGGAAGGAGTCAC-3'
Exon2F: 5'-TCTTGTTTCGCTCCAGATTTC-3'
R: 5'-TCTACCAAGTGAGGGGCAAA-3'
Exon3F: 5'-GTGTTAGTTGGTGGGGGTGT-3'
R: 5'-TGAGTAAAACTGTGCATTTCCTG-3'
Exon4F: 5'-GACTTCCGGTGGTCAGTCAT-3'
R: 5'-GCGTTCTGCCCAGATACTTT-3'

טבלה 1. ג'ין TTR תחל intronic. (רצף ההתייחסות NCBI: NC_000018.10)

  1. הוסף את ריאגנטים בטבלה מס ' 2 צינור PCR 0.2 מ"ל.
רכיביםנפח (µL)ריכוז סופי
10 x מאגר2.51 x
MgCl2 (25 מ מ)1.51.5 מ מ
משפר GC 3601-
360 DNA פולימראז0.22 U-תגובה
dNTP מיקס (25 מ מ כל אחד)22 מ מ
פריימר F (10 מיקרומטר)1מיקרומטר 0.4
פריימר R (10 מיקרומטר)1מיקרומטר 0.4
דנ א (100 ng)2
כיתה ה-PCR מים13.8-
הנפח הכולל25-

בטבלה 2. תנאי ריאקציה PCR.

  1. לערבב בעדינות, צנטריפוגה בקצרה על צנטריפוגה benchtop כדי לאסוף את כל הרכיבים לתחתית הצינור. הכנס צינור thermocycler.
  2. לבצע PCR 30 מחזורים. כל מחזור מורכב צעד דנטורציה עבור 30 s ב 94 ° C, פריימר חישול ב-30 s-58 ° C ופולימראז סיומת עבור 45 s ב-72 מעלות (ראו טבלה 3).
שלבטמפרטורה (° C)זמןמחזור
דנטורציה הראשונית955 דקות1
שלב דנטורציה דנ א9430 sמחזורים
שלב מחזק פריימר5830 sמחזורים
שלב ההרחבה של פולימראז7245 sמחזורים
שלב התארכות פוסט7210 דקות1
סוף ה-PCR רכיבה על אופניים4לא מוגדר

בטבלה 3. תנאי הרכיבה עבור הגברה מוצרי ה-PCR.

  1. לאמת את המוצר PCR דמיין עם אלקטרופורזה בג'ל:
    1. הכנת ג'ל 1.2% agarose:
      1. מערבבים 1.2 גר' אבקת agarose עם 100 מ של 0.5 x TBE בבקבוקון שניתן לחמם במיקרוגל. מיקרוגל למשך 2 דקות עד agarose זה התפרקה לחלוטין. לקרר את התערובת agarose עד 55 מעלות צלזיוס.
      2. להוסיף התערובת agarose 2 µL של אתידיום ברומיד פתרון (10 mg/mL) ומערבבים בעדינות. שופכים את התערובת agarose לתוך מגש ג'ל שבו כ 5-7 מ מ, ולאחר מכן להוסיף את comb(s) במקום. לאפשר את לחזק (לפחות 30 דקות), הסר בזהירות comb(s).
    2. דוגמיות ולהפעיל של ג'ל agarose:
      1. המקום ג'ל ומגש לתוך התא אלקטרופורזה. למלא את התא אלקטרופורזה 0.5 x TBE עד הג'ל מכוסה.
      2. בזהירות לטעון 2 µL של דנ א. לחץ דם 100 סולם (ראה טבלה של חומרים) לנתיב אחד של הג'ל כמו סמן גודל מולקולרי. עומס לצבוע/מדגם תערובת (5 µL של תמהיל המוצרים PCR עם µL 1 6 x צבע הטעינה) לתוך מסלולים נוספים.
      3. הפעל את אספקת החשמל. הפעל את הג'ל במשך 25 דקות ב- 100 וולט.
      4. להסיר את הג'ל מהתא אלקטרופורזה. דמיינו את שברי DNA תחת אולטרא סגול בכל מערכת הדמיה.

5. רצפי DNA

  1. לטהר PCR מוצרים באמצעות ערכת מסחרי, רצף מסחרית או עם ברצף אוטומטית (ראה טבלה של חומרים).
  2. להגיש רצפי לשרת NCBI הפיצוץ כדי להשוות שהשאילתה נוקלאוטיד מסדי הנתונים של נוקלאוטיד10. לאחר הצגת התוצאות, לבצע רצף היישורים ולזהות את השינוי הצפוי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

Agarose בג'ל של שני חולים, אחת הלהקות חשף בריא בודדים של גודל הצפוי, כולל מוצר ה-PCR bp 454 עבור אקסון 4 של הגן TTR (איור 1).

figure-results-1
איור 1 . אלקטרופורזה בג'ל המתארים PCR מוגבר TTR ג'ין. רגיל: אדם בריא. 100 מ': ליין bp סולם הדנ א כמו סמן גודל מולקולרי. מסלולים 1:246 bp (אקסון 1...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

ישנם שני שלבים קריטיים בתוך הפרוטוקול. ראשית, על מנת לקבל מספר מספיק של כדוריות הדם הלבנות, הדגימה hemodiluted צריך להיות נמנעה11. שנית, השימוש תחל PCR המתאים הוא היסוד כדי להשיג תוצאות אמינות12. השתמשנו בכלי האינטרנט פריימר-הפיצוץ כדי לעצב את4,תחל13; מינימום של 40 בסיסי זוגות בכל צד של exons TTR ארבע שאמור להיות מכוסה. אנחנו גם פועלים הפיצוץ NCBI לבדוק יחודיות של תחל.

כמה שיפורים מבוצעים...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף.

תודות

אנו מאחלים תודה גברת שין-כיף וו לה עזרה בניסויים. מחקר זה נתמך על ידי מענק של תכנית המחקר הרפואי של צ'נג קונג (CMRPG3C0371, CMRPG3C0372, CMRPG3C0373) ו IRB 100-4470A3, 104-2462A3, טייוואן.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צינורות מטופלים ב- EDTA
ערכת מיצוי DNABD Stratagen200600
ספקטרופוטומטר NanoDrop ND2000 Thermo Fisher ScientificNanoDrop 2000
מגבי משימות עדיניםקימברלי-קלארקKimtech Science Kimwipes
AmpliTaq Gold 360 DNA Polymerase ערכתApplied Biosystems4398823
TTR גן פריימרים אינטרוניים Exon1F: 5'-TCAGATTGGCAGGGATAAGC-3'
Exon1R: 5'-GCAAAGCTGGAAGGAGTCAC-3'
אקסון 2F: 5'-TCTTGTTTCGCTCCAGATTTC-3'
אקסון 2R: 5'-TCTACCAAGTGAGGGGCAAA-3'
אקסון 3F: 5'-GTGTTAGTTGGTGGGGGTGT-3'
אקסון3R: 5'-TGAGTAAAACTGTGCATTTCCTG-3'
Exon4F: 5'-GACTTCCGGTGGTCAGTCAT-3'
Exon4R: 5'-GCGTTCTGCCCAGATACTTT-3'
thermocyclerApplied BiosystemsGeneAmp PCR System 9700
תא אלקטרופורזה סולם DNA ADVANCEMupid-2plus
ProtechPT-M1-100
צבעBioLabsB7021
AlphaImager ECAlpha InnotechAlphaImager EC
רצף אוטומטי Applied Biosystems3730XL
מנתח DNA של

מקורות

  1. Planté-Bordeneuve, V., Said, G. Familial amyloid polyneuropathy. The Lancet Neurology. 10 (12), 1086-1097 (2011).
  2. Planté-Bordeneuve, V., et al. Long-term treatment of transthyretin familial amyloid polyneuropathy with tafamidis: a clinical and neurophysiological study. Journal of Neurology. 264 (2), 268-276 (2017).
  3. Nichols, W. C., Benson, M. D. Hereditary amyloidosis: detection of variant prealbumin genes by restriction enzyme analysis of amplified genomic DNA sequences. Clinical Genetics. 37 (1), 44-53 (1990).
  4. Lorenz, T. C. Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998(2012).
  5. Hsu, H. C., et al. Phenotypic expressions of hereditary Transthyretin Ala97Ser related Amyloidosis (ATTR) in Taiwanese. BMC Neurology. 17 (1), 178(2017).
  6. Barroso, F. A., et al. Long-term safety and efficacy of tafamidis for the treatment of hereditary transthyretin amyloid polyneuropathy: results up to 6 years. Amyloid. 24 (3), 194-204 (2017).
  7. Rapezzi, C., et al. Disease profile and differential diagnosis of hereditary transthyretin-related amyloidosis with exclusively cardiac phenotype: an Italian perspective. European Heart Journal. 34 (7), 520-528 (2013).
  8. Mariani, L. L., et al. Genotype-phenotype correlation and course of transthyretin familial amyloid polyneuropathies in France. Annals of Neurology. 78 (6), 901-916 (2015).
  9. Hammarström, P., Jiang, X., Hurshman, A. R., Powers, E. T., Kelly, J. W. Sequence-dependent denaturation energetics: A major determinant in amyloid disease diversity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, suppl 4 16427-16432 (2002).
  10. Johnson, M., Zaretskaya, I., Raytselis, Y., Merezhuk, Y., McGinnis, S., Madden, T. L. NCBI BLAST: a better web interface. Nucleic Acids Research. 36, Web Server issue 5-9 (2008).
  11. Fox, A. J., et al. Next generation sequencing for the detection of actionable mutations in solid and liquid tumors. Journal of Visualized Experiments. (115), (2016).
  12. Date, Y., Nakazato, M., Kangawa, K., Shirieda, K., Fujimoto, T., Matsukura, S. Detection of three transthyretin gene mutations in familial amyloidotic polyneuropathy by analysis of DNA extracted from formalin-fixed and paraffin-embedded tissues. Journal of the Neurological Sciences. 150 (2), 143-148 (1997).
  13. Ye, J., Coulouris, G., Zaretskaya, I., Cutcutache, I., Rozen, S., Madden, T. L. Primer-BLAST: a tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinformatics. 13, 134(2012).
  14. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular cloning: A laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2012).
  15. Buckingham, L., Flaws, M. L. Molecular diagnostics: Fundamentals, methods, and clinical applications. , F.A. Davis Co. Philadelphia. (2012).
  16. Tan, S. C., Yiap, B. C. DNA, RNA, and Protein Extraction: The Past and The Present. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2009, (2009).
  17. Rapezzi, C., et al. Systemic cardiac amyloidoses: disease profiles and clinical courses of the 3 main types. Circulation. 120 (13), 1203-1212 (2009).
  18. Gertz, M. A., Dispenzieri, A., Sher, T. Pathophysiology and treatment of cardiac amyloidosis. Nature Reviews Cardiology. 12 (2), 91-102 (2015).
  19. Vrana, J. A., et al. Clinical diagnosis and typing of systemic amyloidosis in subcutaneous fat aspirates by mass spectrometry-based proteomics. Haematologica. 99 (7), 1239-1247 (2014).
  20. Nakamura, M., et al. Identification of a new transthyretin variant (Ile49) in familial amyloidotic polyneuropathy using electrospray ionization mass spectrometry and nonisotopic RNase cleavage assay. Human Heredity. 49 (4), 186-189 (1999).
  21. Ueda, M., Ando, Y. Recent advances in transthyretin amyloidosis therapy. Translational Neurodegeneration. 3, 19(2014).
  22. Brown, E. E., et al. Genetic testing improves identification of transthyretin amyloid (ATTR) subtype in cardiac amyloidosis. Amyloid. 24 (2), 92-95 (2017).
  23. Tasaki, M., et al. Rapid detection of wild-type and mutated transthyretins. Annals of Clinical Biochemistry. 53 (4), 508-510 (2015).
  24. Plante-Bordeneuve, V., et al. Diagnostic pitfalls in sporadic transthyretin familial amyloid polyneuropathy (TTR-FAP). Neurology. 69 (7), 693-698 (2007).
  25. Hsu, J. L., et al. A prospective, observational study of patients with uncommon distal symmetric painful small-fiber neuropathy. PLoS ONE. 12 (9), 0183948(2017).
  26. Salvi, F., Pastorelli, F., Plasmati, R., Bartolomei, I., Dall'Osso, D., Rapezzi, C. Genotypic and phenotypic correlation in an Italian population of hereditary amyloidosis TTR-related (HA-TTR): Clinical and neurophysiological aids to diagnosis and some reflections on misdiagnosis. Amyloid. 19, suppl 1 58-60 (2012).
  27. Suhr, O. B., Lundgren, E., Westermark, P. One mutation, two distinct disease variants: Unravelling the impact of transthyretin amyloid fibril composition. Journal of Internal Medicine. 281 (4), 337-347 (2017).
  28. Vilà-Rico, M., et al. Quantitative analysis of post-translational modifications in human serum transthyretin associated with familial amyloidotic polyneuropathy by targeted LC-MS and intact protein MS. Journal of Proteomics. 127, 234-246 (2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

PCRDNADNATTRAla97SerATTR
ניתוח גנטי של Transthyretin Ala97Ser תורשתיות הקשורות עמילואידוזיס
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.