Method Article

אופטימיזציה של לכידת לייזר Microdissection עבור בידודו של הגרעינים המעית מרקמות אנושיות מוקפאות

DOI:

10.3791/57762

⸱

June 14th, 2018

 ,  , 
1Vanderbilt University Medical Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המטרה של פרוטוקול זה היא להשיג דגימות RNA גבוהה-שלמות של הגרעינים המעית מבודד מבולבל, resected טריים מעיים רקמה אנושית באמצעות לייזר לכידת microdissection (LCM). פרוטוקול זה כולל הכנת קפואה דגימות של רקמות אנושיות מעיים, cryosectioning, ethanolic מכתים, התייבשות, הפונקציה LCM, והפקת RNA.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מטרת שיטה זו היא להשיג דגימות RNA גבוהה-שלמות של הגרעינים המעית שנאסף מבולבל, resected טריים מעיים רקמה אנושית באמצעות לייזר לכידת microdissection (LCM). זיהינו חמישה שלבים בזרימת העבודה כי הם חיוניים להשגת RNA מבודד מן הגרעינים המעית עם כמות ואיכות גבוהה מספיק בשביל RNA-תת סעיף. ראשית, בעת הכנת רקמת המעי, כל מדגם חייב להיות כל נוזל עודף הוסר על-ידי סופג לפני שיטוח serosa ככל האפשר לרוחב החלק התחתון של תבניות הבסיס גדול. דוגמאות ואז מוקפאים במהירות על גבי slurry של קרח יבש ו- 2-methylbutane. שנית, בעת חלוקתה הרקמה, חשוב למקם cryomolds כך מעיים מקטעים מקבילים המטוס מלא של מקלעת myenteric, ובכך מניב את פני השטח הגדול ביותר של הגרעינים המעית לכל שקופית. שלישית, במהלך LCM, napthalate פוליאתילן (עט)-ממברנה שקופיות מציעים את המהירות ואת גמישות חלוקה לרמות את הצורות לא אחידה של הגרעינים המעית בעת איסוף הגרעינים המעית הגדול ביותר. רביעית, להמחשת ברורים של הגרעינים המעית בתוך המקטעים, צבעים התואמים לאתנול, כמו Cresyl, ויולט, מציעים מעולה לשימור RNA תקינות ביחס צבעי מימית. בסופו של דבר, על החילוץ של RNA מן הגרעינים בשבי, נצפו הבדלים בין מסחרי ערכות חילוץ RNA הניב סופריור RNA כמות ואיכות, תוך צמצום זיהום ה-DNA. אופטימיזציה של גורמים אלה בפרוטוקול הנוכחי מאיץ את זרימת העבודה במידה רבה ותשואות הגרעינים המעית דגימות עם איכות יוצאת דופן של RNA וכמות.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שיטה זו נועדה להשיג דגימות RNA באיכות גבוהה של הגרעינים המעית של רקמה אנושית מעיים באמצעות לייזר לכידת microdissection (LCM). הפרוטוקול המתואר כאן מוטבה כדי לספק מספיק תשואות ואיכות RNA RNA רצף (RNA-seq) והוא נועד לשמש עם רקמת המעי האנושי resected טריים, מבולבל, קפואה.

הפרעות תנועתיות מערכת העיכול, במעיים פונקציונלי להשפיע על אחד של כל ארבעה אנשים בארצות הברית. מערכת העצבים המעית (ENS), המכונה גם השני המוח1, לעתים קרובות במרכז בהפרעות אלה, כפי שהיא משחקת תפקיד מכריע בטן הומאוסטזיס, תנועתיות. מניפולציה של תנועתיות המעיים הוגבלה כלל כריתה כירורגית לרקמות aganglionic/noncontractile, שינוי תזונה כרונית ו/או תרופות. באופן....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הפרוטוקולים המתוארים כאן אושרו על ידי ואנדרבילט אוניברסיטת מוסדיים סקירה לוח (IRB).

1. הכנה לפני ההגעה רקמות

  1. לקבל אישור IRB נאות ולתאם עם סוכנויות תרומת איבר אנושי כדי לקבל את רקמות מעיים resected טריים, מבולבל מתורמים אשר עונות על הקריטריונים מחקר כל הנדרש לצורך המחקר.
    הערה: פרוטוקול זה ניתן להתאים לשימוש עם מודלים אחרים מכרסמים ועכברים.
    1. מיד לאחר כריתה של כל אחד מהמקטעים מעיים, ביסודיות לשטוף לומן עם PBS צונן או באמצעי אחסון רקמות כדי להסיר שאריות חומר luminal או צואה.
    2. לאחר שטיפה, השלכת פסולת קיבול הביולוגי המתאים, להטביע את רקמות נפח מספיק של רקמת אחסון בינוני (כמו 3 - 5 פעמים נפח רקמת המעי) ולאחסן שכותר....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנחנו עשינו מספר שיפורים הפרוטוקולים הקיימים המאפשרים את האוסף מהירה יחסית של הגרעינים המעית מדגימות המעי האנושי באמצעות הפונקציה LCM, עמידה בסטנדרטים ביותר עבור ה-RNA-תת סעיף. ראשית, אנחנו אופטימיזציה ההקפאה המהירה של מקטעי רקמת המעי בתבניות הבסיס גדול להציב בפני השטח של slurry קרח יבש ב- 2 MB (איור 1B). ההצלחה הטובים ביותר במהלך cryosectioning, הפונקציה LCM הבאים היה מתקבל על ידי הנחת מקטעי מעיים שטוח בתוך תבנית בסיס, פונה כלפי רירית-מעלה (.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הליך זה מאפשר את האוסף יעיל של הגרעינים המעית רבים כמקור להפקת RNA עבור ה-RNA-תת סעיף. כאן, אנחנו האיץ את התהליכים המתוארים הפרוטוקולים הקיימים תוך שמירה מקסימאלית RNA שלמות. כמו כל השלבים בהליך זה תלויות זו בזו, זה חשוב כי כל הבעיות ניתן לסלק מן תחילת המחקר, כי כל דוגמאות מוכנות באופן דומה כמו אחד לשני ככל האפשר, כדי להשיג אמין RNA-תת סעיף.

מתחילת ההליך, שלמות RNA יכול מושפעים באופן שלילי אם מרווח הזמן (זמן איסכמי קר) בין אוסף של רקמות בזמנו של תרומת איברים וקבלה של רקמות לצורך עיבוד במעבדה א.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים יש שאין ניגודי אינטרסים לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנחנו אסירי תודה על התורמים ובני משפחותיהם אשר אפשרו את העבודה הזאת אנחנו מעריכים גם הסיוע של צוות המכון הבינלאומי לרפואה, טנסי סיפורים אישיים שעזרת אוסף קואורדינטות של רקמות השתמשו במחקר זה. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מכוני הבריאות הלאומיים, NIH OT2-OD023850 לתמיכה2 וקצבה EMS של NIH T32-DK007673 כדי AMZ. אנחנו מודים לצוות של משאב משותף פתולוגיה ואנדרבילט Translational גישה לכלי LCM, ייעוץ על הכנת הרקמה. ואנדרבילט רקמות פתולוגיה משותפים המשאב נתמך בחלקה על ידי NIH מענקים P30-CA068485-14 ו- U24-DK059637-13. אנו מודים המרכז גישה הגנום טכנולוגיה במחלקה לגנטיקה בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת וושינגטון על העזרה עם אנליזה גנומית. GTAC היא נתמכת באופן חלקי על יד....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10% פורמליןסיגמאHT501128-4L
2-מתילבוטןפישרO3551-4
מ"ל מזרקBD309628
50 מ"ל, פוליפרופילן תבניות בסיס קורנינג05-526B
37x24x5 מ"מ,מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונים5025511
Belzer UW  פתרון אחסון קרגשר לחייםנ.א.
CapSure Macro LCM מכסיםArcturus, ThermoFisherLCM0211
ניילון נצמד, עיתונות' n חותם     שמחה   נ.א. 
קרזיל סגול אצטטאקרוס אורגניקרש
מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית63308
אתנול, 190 הוכחהPharmco-AAPER111000190
אתנול, 200 הוכחהPharmco-AAPER111000200
זכוכית מיקרוסקופ שקופיותפישר12-550-343
כפפות, שרוול מורחבMicroflex 
19010144 שמלות,קימברלי-קלארק 19-088-2116
מגש, 20 ליטר (מחבת עיקור פוליפרופילן גדולה)Nalgene   1335920B
קימוויפס (גדול)קימברלי-קלארק 34120
קימוויפס (קטן)קימברלי-קלארק 34133
מערכת מיקרו-דיסקציה ללכידת לייזר (ArcturusXT)ThermoFisherNA
צ'אק Leica Cryostat גדול,  40 מ"מ שירות מכשירים לפתולוגיה דרום-מזרחיתNA 
מיקרוסקופ אוראולימפוסCX43
מיקרוסקופ אובייקטיבי (20X)אולימפוס UPlanFl 20X/0.50, ∞/0.17N.A.
מיקרוסקופ אובייקטיבי (10X)אולימפוס UPlanFl 10X/0.25, ∞/-N.A. 
מסננות מולקולריותAcros OrganicsAC197255000
מים ללא נוקלאזאמביוןAM9937
PicoPure ערכת מיצוי RNAApplied Biosystems12204-01
עלי גלולהKimble Kontes4621973
ממברנת PEN LCM שקופיותArcturus, ThermoFisherLCM022
צינורות ללא RNase, 1.5 מ"לאמביוןAM12400
RNaseZAP SigmaSigma-R2020
"A" (PicoPure)Applied Biosystems12204-01
ערכת מיצוי RNA "B" (RNeasy  ערכת מיקרו)Qiagen74004
שיטת מיצוי RNA "C" (TRIzol)Invitrogen15596-026
ערכת מיצוי RNA "D" (ערכת RNeasy PLUS Mini)Qiagen74134
Splash Shield, מגן פנים חד פעמיFisher17-310
מספריים, כירורגי, 14.5 ס"מ "חד-חד"כלימדע עדינים14002-14
מסנן מזרק, אצטט תאית (0.2 μ m)Nalgene   190-2520
הקפאת רקמות בינוניתנתונים כלליים בריאותTFM-5
קסילניםפישרX3P1GAL
3 חד פעמיים חיתוך AC405760025 ערכת מיצוי RNA

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gershon, M. D. The second brain : the scientific basis of gut instinct and a groundbreaking new understanding of nervous disorders of the stomach and intestine. , HarperCollinsPublishers. 1st edn (1998).
  2. Grundmann, D., Klotz, M., Rabe, H., Glanemann, M., Schafer, K. H. Isolation of high-purity myenteric plexus from adult human and mouse ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Laser Capture MicrodissectionEnteric Ganglia IsolationHuman Intestinal TissueRNA Extraction OptimizationPEN Membrane SlidesCresyl Violet StainingCryostat SectioningMyenteric Plexus LocalizationTFM EmbeddingRNA Integrity Assessment

Related Articles