כאן, אנו מציגים פרוטוקול להמחיש פיתוח לבבות דג זברה 4-ממדים (4-D). הדמיה 4-D, באמצעות מיקרוסקופ אור גיליונות קרינה פלואורסצנטית (LSFM), לוקח תמונות תלת-ממדי (3-D) לאורך זמן, לשחזר לבבות המתפתח. אנו מראים איכותית, באופן כמותי שזה גזירה מפעילה חריץ endocardial איתות במהלך הפיתוח קאמרית, המקדם trabeculation הלב.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
מיקרוסקופ אור גיליונות זריחה כדי ללכוד תמונות 4-מימדי של השפעות להתכוונן גזירה על הלב דג זברה המתפתח
* These authors contributed equally
במאמר זה
הודעת תיקון
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
סיכום
תקציר
כוחות והמודינמיקה מנוסים על ידי השפעה הלב התפתחות הלב, במיוחד trabeculation, המהווה רשת של outgrowths הסתעפות של שריר הלב. פגמים גנטיים תוכנית החריץ איתות אשד מעורבים חדרית פגמים כגון שמאל Non-דחיסת חדרית שריר הלב או התפתחות תסמונת הלב השמאלי. באמצעות פרוטוקול זה, ניתן לקבוע כי trabeculation מונחה מאמץ גזירה והאיתות חריץ קשורים אחד לשני. באמצעות מיקרוסקופ אור גיליונות פלורסצנטיות, ויזואליזציה של הלב דג זברה המתפתח היה אפשרי. כתב יד זה, זה נאמד בין אם כוחות והמודינמיקה לווסת את אתחול של trabeculation דרך חריץ איתות ולהשפיע לפיכך, הפונקציה כויץ מתרחשת. עבור כמותיים להטיה מנתח הלחץ, 4-D (3-D + זמן) תמונות נרכשו במהלך מורפוגנזה לב דג זברה, מיקרוסקופיה זריחה האור-גיליון משולב עם 4-D סינכרון כבשו את התנועה חדרית. צמיגות הדם צומצם ויה gata1a- מורפולינו oligonucleotides (מו) מיקרו-הזרקת כדי להקטין גזירה, ובכך, למטה-ויסות חריץ באיתות, attenuating trabeculation. שיתוף הזרקה של mRNA Nrg1 עם gata1a מו חולץ גנים הקשורים חריץ כדי לשחזר את trabeculation. כדי לאשר גזירה מונע חריץ איתות השפעות trabeculation, התכווצות cardiomyocyte נעצר עוד יותר באמצעות tnnt2a-מו להפחתת כוחות והמודינמיקה, ובכך, מווסת למטה חריץ היעד גנים לפתח שאינם trabeculated שריר הלב. לבסוף, ועיונים דפוסי ביטוי של גנים חריץ גזירה מגיב נערך על ידי העמדת תאי אנדותל זרימה פועמת. לפיכך, מיקרוסקופ אור-גיליון 4-D חשפו כוחות והמודינמיקה שבבסיס חריץ באיתות, trabeculation עם רלוונטיות קלינית ללא דחיסה של שריר הלב.
מבוא
כוחות ביו-מכני, כגון והמודינמיקה גזירה, מעורבים באופן אינטימי מורפוגנזה הלב. בתגובה כוחות גזירה והמודינמיקה, שריר הלב הרכסים והחריצים לפתח רשת trabecular גל כמו יישור עם הכיוון של גזירה מעבר שסתום atrioventricular (AV)1. לב trabeculation יש צורך להגדיל את הפונקציה כויץ ו- מסת שריר הלב2. מוטציות בגן חריץ מסלולי איתות לגרום מומי לב מולדים בין בני אדם אחרים בעלי חוליות3. לדוגמה, gata1a4 ו- tnnt2a5 מורפולינו oligonucleotides (מו) הוכחו להפחית אריתרופויזה, בעוד אריתרופויאטין mRNA (EPO)6 ו- Isoproterenol (....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
השיטות הבאות בוצעו בהתאם הפרוטוקולים אוטה ו- UCLA IACUC. קבוצות ניסיוני אלה שימשו עם הטרנסגניים Tg(cmlc2:gfp), המוטציות לל (atrium חלש) או שיבוט (cloche) : (א) פראי-סוג (WT) שליטה, (b) gata1a מו ו- (ג) tnnt2a מו זריקות (טבלה 1).
| מודל | שם | גנים שהשתנו | גן # מושגים בסיסיים | הפניה |
| שליטה | פראי סוג | אף אחד | N/A |
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
LSFM שימש כתב יד זה על מנת לרכוש תמונות דו-ממד ותלת -ממדיים ברזולוציה גבוהה. כפי שניתן לראות באיור 1A ו- 1B, העדשה תאורה מנחה את הגיליון אור ב המדגם. בגלל דלילות הגיליון אור, מואר רק מטוס בודד. העדשה זיהוי בניצב ממוקם על העדשה תאורה, מתמקדת המטוס מואר (איור 1B). הגיליון אור מן העדשה תאורה סורק את הדגימה משמאל לימין (איור 1C). הסריקה מאפשרת פחות הלבנת-צילום, צילום-רעילות, יש יחס אות ל.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
ב פרוטוקול זה, אנחנו הראו כי הדמיה 4-D יכול לשמש כדי לעקוב אחר התפתחות רשת trabecular בתגובה לשינויים בכוחות ביו-מכני. בפרט, הלחץ הטיה מנוסים על ידי תאי אנדותל יוזם את החריץ איתות אשד, אשר בתורו מקדם trabeculation. כתב יד זה, אנחנו הראו כי הזרקת gata1a מו (1) ירידה hematopoiesis, לכן הוא מופחת קיר גזירה, הזרקת tnnt2a מו (2) מעוכבים חדרית הפונקציה כויץ כדי להפחית את הקיר גזירה, ו- (3) לל מוטציות חסרה התכווצות פרפור, ואז להפחתה הכוח והמודינמיקה שהוחל הנוזלים. על-ידי הפחתת הלחץ הטיה על קירות הלב, .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים אין לחשוף.
תודות
המחברים ברצוננו להביע תודה ויליאם טלבוט מאוניברסיטת סטנפורד למתן את האדם Nrg1 cDNA וכדי דבורה ילון מ UCSD למתן לל מוטציות . המחברים גם רוצה תודה חן סינתיה עוזר עם רכישת התמונה. מחקר זה נתמך על ידי מענקים NIH HL118650 (טי-קיי Hsiai), HL083015 (ל Hsiai טי-קיי), HD069305 (כדי לא מחובר צ'י, טי-קיי Hsiai.), HL111437 (ל Hsiai טי-קיי, לא מחובר צ'י), HL129727 (ל Hsiai טי-קיי), T32HL007895 (כדי פקרד Sevag ר. ר), HL 134613 (ל Messerschmidt (פ')), האוניברסיטה של טקסס מערכת כוכבים מימון (לי).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| Clontech Hifi PCR טרום מיקס | טאקרה | 639298 | PCR mastermix 1.1.1.1, 1.1.1.2, 1.1.1.5, 1.1.2.1, 3.1.4 |
| Nrg1 מתנת cDNA | מוויליאם טלבוט, אוניברסיטת סטנפורד, סטנפורד, קליפורניה, ארה" | N/A | משמש לחילוץ טרבקולציה 1.1.1.3, 1.1.1.4, 1.1.2.1 |
| CFX Connect™ מערכת זיהוי PCR בזמן אמת | Bio-Rad | 1855201 | מכונת PCR 1.1.1.5, 1.1.1.6, 1.1.2.2, 1.1.3.2 |
| pCS2+ | GE Health | Plasmid המשמש לסינתזה mRNA 1.1.2.1, 1.1.2.4, 1.1.2.5 | |
| ערכת טיהור נוקלאוספינים | Clontech | 740609.25 | טיהור DNA 1.1.2.3, 1.1.2.4, 1.1.6.2 |
| T4 DNA ligase | Clontech | 2011A | PCR Ligation solution 1.1.2.5 |
| תאים מוכשרים כוכביים | Clontech | 636763 | E. coli תאים המשמשים לטרנספורמציה 1.1.2.6, 1.1.3.1, 1.1.3.2 |
| מגיב טרנספקציה ליפופקטמין 2000 מגיב טרנספקציה | Life Technologies | 11668027 | מגיב טרנספקציה 1.1.4 |
| ערכת mMessage SP6 | Invitrogen | AM1340 | ערכה המשמשת לסינתזה mRNA 1.1.6.3 |
| Aurum Total RNA Mini Kit | Bio-Rad | 7326820 | מטהר RNA 1.1.6.4, 3.1.2 |
| GeneTools 4.3.8 | GeneTools | N/A | תוכנה לעיצוב פריימר 1.2.1, 3.1.3 |
| EPO cDNA | Creative Biogene | CDFH006026 | מגדיל WSS 1.2.2, 1.2.3, 1.1.7 |
| AG1478 | Sigma-Aldrich | מעכב T4182 | ErbB 1.3.1 |
| E3 בינוני | לגידול עוברים 1.3.1, 1.3.2, 5.1.5 | ||
| DAPT | Sigma-Aldrich | D5942 | γ-מעכב סקרטאז 1.3.2 |
| אגרוז | סיגמא-אולדריץ' | A9539 | משמש להרכבת עוברים 2.1.1.1 |
| ORCA-Flash4.0 LT מצלמת CMOS דיגיטלית | Hamamatsu Photonics | C11440-42U | משמשת לצילום תמונות 2.1.1.2, 2.1.1.3 |
| תוכנת Amira | תוכנת FEI | N/A | תמונות חזותיות ומנותחות לתלת מימד, ו-4D 2.1.5.1.1-2.1.5.2.8 |
| Tricaone mesylate | סיגמא-אולדריץ' | 886-86-2 | משמש להרדמה או הקרבה אנושית של עוברים 3.1.1 |
| iScript cDNA Synthesis | Kit Bio-Rad | 1708890 | מסנתז cDNA 3.1.2 |
| Eppendorf 5424 מיקרו-צנטריפוגה | Eppendorf | 05-400-005 | Microcentrifuge 4.1.1.3 |
| GI254023X | Sigma-Aldrich | 260264-93-5 | מעכב ADAM10 4.1.2, 4.1.3 |
| איזופרנלין הידרוכלוריד | סיגמא-אולדריץ' | I5627 | איזופרוטרנול מגביר את WSS 5.1.5 |
| MATLAB | Mathworks | N/A | ניתוח מכניקת לב |
מקורות
- Lee, J., et al. Moving domain computational fluid dynamics to interface with an embryonic model of cardiac morphogenesis. PLoS One. 8 (8), e72924(2013).
- Peshkovsky, C., Totong, R., Yelon, D. Dependence of cardiac trabeculation....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
תיקון
Formal Correction: Erratum: Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart
Posted by JoVE Editors on 9/03/2018. Citeable Link.
An erratum was issued for: Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart. Additional author names were added, and an author affiliation was updated.
The author list was updated from:
Victoria Messerschmidt*1, Zachary Bailey*1, Kyung In Baek2, Richard Bryant1, Rongsong Li2, Tzung K. Hsiai2, Juhyun Lee1
to:
Victoria Messerschmidt*1, Zachary Bailey*1, Kyung In Baek2, Yichen Ding2, Jeffrey J. Hsu2, Richard Bryant1, Rongsong Li2, Tzung K. Hsiai2, Juhyun Lee1
The author affiliation for Rongsong Li was updated from:
Department of Medicine (Cardiology) and Bioengineering, UCLA
to:
College of Health Science and Environmental Engineering, Shenzhen Technology University
