מיקרוסקופ אור גיליונות זריחה כדי ללכוד תמונות 4-מימדי של השפעות להתכוונן גזירה על הלב דג זברה המתפתח

Victoria Messerschmidt; Zachary Bailey; Kyung In Baek; Yichen Ding; Jeffrey J. Hsu; Richard Bryant; Rongsong Li; Tzung K. Hsiai; Juhyun Lee

doi:10.3791/57763

מאמר שיטה

מיקרוסקופ אור גיליונות זריחה כדי ללכוד תמונות 4-מימדי של השפעות להתכוונן גזירה על הלב דג זברה המתפתח

DOI:

10.3791/57763

⸱

10 באוגוסט 2018

Victoria Messerschmidt^*¹ , Zachary Bailey^*¹ , Kyung In Baek² , Yichen Ding² , Jeffrey J. Hsu² , Richard Bryant¹ , Rongsong Li³ , Tzung K. Hsiai² , Juhyun Lee¹

¹Department of Bioengineering, The University of Texas at Arlington, ²Department of Medicine (Cardiology) and Bioengineering, UCLA, ³College of Health Science and Environmental Engineering, Shenzhen Technology University

^* These authors contributed equally

במאמר זה

הודעת תיקון

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להמחיש פיתוח לבבות דג זברה 4-ממדים (4-D). הדמיה 4-D, באמצעות מיקרוסקופ אור גיליונות קרינה פלואורסצנטית (LSFM), לוקח תמונות תלת-ממדי (3-D) לאורך זמן, לשחזר לבבות המתפתח. אנו מראים איכותית, באופן כמותי שזה גזירה מפעילה חריץ endocardial איתות במהלך הפיתוח קאמרית, המקדם trabeculation הלב.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כוחות והמודינמיקה מנוסים על ידי השפעה הלב התפתחות הלב, במיוחד trabeculation, המהווה רשת של outgrowths הסתעפות של שריר הלב. פגמים גנטיים תוכנית החריץ איתות אשד מעורבים חדרית פגמים כגון שמאל Non-דחיסת חדרית שריר הלב או התפתחות תסמונת הלב השמאלי. באמצעות פרוטוקול זה, ניתן לקבוע כי trabeculation מונחה מאמץ גזירה והאיתות חריץ קשורים אחד לשני. באמצעות מיקרוסקופ אור גיליונות פלורסצנטיות, ויזואליזציה של הלב דג זברה המתפתח היה אפשרי. כתב יד זה, זה נאמד בין אם כוחות והמודינמיקה לווסת את אתחול של trabeculation דרך חריץ איתות ולהשפיע לפיכך, הפונקציה כויץ מתרחשת. עבור כמותיים להטיה מנתח הלחץ, 4-D (3-D + זמן) תמונות נרכשו במהלך מורפוגנזה לב דג זברה, מיקרוסקופיה זריחה האור-גיליון משולב עם 4-D סינכרון כבשו את התנועה חדרית. צמיגות הדם צומצם ויה gata1a- מורפולינו oligonucleotides (מו) מיקרו-הזרקת כדי להקטין גזירה, ובכך, למטה-ויסות חריץ באיתות, attenuating trabeculation. שיתוף הזרקה של mRNA Nrg1 עם gata1a מו חולץ גנים הקשורים חריץ כדי לשחזר את trabeculation. כדי לאשר גזירה מונע חריץ איתות השפעות trabeculation, התכווצות cardiomyocyte נעצר עוד יותר באמצעות tnnt2a-מו להפחתת כוחות והמודינמיקה, ובכך, מווסת למטה חריץ היעד גנים לפתח שאינם trabeculated שריר הלב. לבסוף, ועיונים דפוסי ביטוי של גנים חריץ גזירה מגיב נערך על ידי העמדת תאי אנדותל זרימה פועמת. לפיכך, מיקרוסקופ אור-גיליון 4-D חשפו כוחות והמודינמיקה שבבסיס חריץ באיתות, trabeculation עם רלוונטיות קלינית ללא דחיסה של שריר הלב.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כוחות ביו-מכני, כגון והמודינמיקה גזירה, מעורבים באופן אינטימי מורפוגנזה הלב. בתגובה כוחות גזירה והמודינמיקה, שריר הלב הרכסים והחריצים לפתח רשת trabecular גל כמו יישור עם הכיוון של גזירה מעבר שסתום atrioventricular (AV)¹. לב trabeculation יש צורך להגדיל את הפונקציה כויץ ו- מסת שריר הלב². מוטציות בגן חריץ מסלולי איתות לגרום מומי לב מולדים בין בני אדם אחרים בעלי חוליות³. לדוגמה, gata1a⁴ ו- tnnt2a⁵ מורפולינו oligonucleotides (מו) הוכחו להפחית אריתרופויזה, בעוד אריתרופויאטין mRNA (EPO)⁶ ו- Isoproterenol (ISO)⁷ להגדיל דם אדום תאים וקצב הלב בהתאמה, ולכן קיר גזירה (WSS). יתר על כן, ErbB2 איתות, במורד הזרם של חריץ, מקדם התפשטות cardiomyocyte ובידול כדי להפיק כוח כויץ, המפעיל בתורו חריץ איתות⁸^,⁹. הוא הציע שכי גזירה מושלת חריץ איתות trabeculation מונע לפיתוח חדרית. כיום, ישנם מחקרים רבים לנסות להבין עוד יותר את האירועים התכנות הגנטי שמוביל מומי לב מולדים (CHD)¹⁰^,¹¹^,¹², אבל מעט מאוד חוקרים כיצד כוחות מכני להשפיע על הלב ויוצרים.

כדי לחקור את הכוחות מכני לפעול לפי endocardium, תצפית קרובה במהלך תקופת התפתחותית צריך להיות מיושם. עם זאת, מאתגר כדי להשיג תמונות באיכות טובה של ויוו להכות דגימות בשל inherence של מיקרוסקופיית מסורתי¹³. על מנת לצפות הפיתוח לאורך זמן בתוך מדגם, חלוקתה פיזיקליות מכתים, לכן, צריך להתרחש¹³^,¹⁴^,¹⁵. למרות מיקרוסקופיה קונפוקלית נעשה שימוש נרחב כדי תמונת המבנה התלת-ממדי של דגימות¹⁴^,¹⁶, הרכישה של מערכות הדמיה אלה עדיין מוגבל על ידי למהירויות סריקה איטי.

מיקרוסקופ אור גיליונות קרינה פלואורסצנטית (LSFM) היא טכניקה דימות ייחודי המאפשר הפריט החזותי של in vivo אירועים דינמיים עם זמן עבודה במרחק¹³. טכניקה זו משתמשת מיקרוסקופ פלואורסצנטי אור גיליונות כדי שטיחות סעיף מדגם¹⁷. עקב תאורה של רק סדין דק של אור על הדגימה, יש ירידה הלבנת-צילום, צילום רעילות¹³^,¹⁸. השדה גדולים של זמן ומרחק עבודה ונוף מאפשר דגימות גדולות כדי להישאר שלמים כמו שהם שבעורך¹³^,¹⁴^,¹⁷. ההגדלה נמוך מאפשר שטח גדול יותר לדימות, בזמן הארוך ומרחק עבודה מאפשר דגימות עבה ליצירת תמונה מבלי להתפשר על יחס אות לרעש. קבוצות רבות השתמשו LSFM כדי התמונה כולה עוברי¹⁷, המוח¹⁴^,¹⁸, השרירים, הלב¹⁹ בין רקמות אחרות, מציג מגוון סוגי והמדגמים יכול לדימות.

למרות מחקרים קודמים הדגימו הטיה והמודינמיקה מופחת כוח מאת occluding המסילה תזרים או יצוא של הלב דג זברה, המידע הוא אך ורק איכותי. זה התוצאה החדר השלישי לא נורמלי, לולאה לב מופחתת, שסתום לקוי היווצרות²⁰. הדימויים LSFM 4-D לתת פרספקטיבה חדשה אל הדרך שהטיה והמודינמיקה כוחות משפיעים על התפתחות רקמת הלב. כוחות אלה מכני עלול להפעיל כוח רגיש מולקולות איתות, לגרום להיווצרות הרכסים trabecular. בשל ההיבט לזמן שהוסף הדמיה 4-D, הוא מסוגל לעקוב אחר שינויים בהתפתחות בזמן אמת, אשר יכול להוביל גילויים חדשים שדלו בעבר. דג זברה היא מודל אידיאלי עבור הדמיה כי מדענים יכולים להתבונן חיה חוליות שלמה לעומת רק תא-תא אינטראקציות. חמצן יכול מפוזר גם דרך העובר כולו, אשר מאפשרת פיתוח להתרחש מבלי בהתאם למערכת כלי הדם, בניגוד בפיתוח יונקים. אף-על-פי הלב דג זברה חסר האברים ריאתי, אשר דורשים לב תאיים ארבע, יש מספר רב של גנים הלב אשר נשמרים בין דג זברה ובני²¹.

כתב יד זה, אנו מתארים כיצד להשתמש במיקרוסקופ אור גיליונות פלורסצנטיות תמונה trabeculae המתפתח בלבבות דג זברה תחת נסיבות שונות. ראשית, הזרקה של⁴ או tnnt2a gata1a⁵ MOs שימשו התחתונה צמיגות הדם, ולכן WSS. לאחר מכן הוקלט המורפולוגיה של הלב. בקבוצה נפרדת של דגים, אנו מוגברת של WSS על ידי ניהול EPO mRNA⁶ או isoproterenol⁷ , בחן את התוצאות. בנוסף ערכנו מחקר תא במחירים שונים זרימה פועמת או מתנדנדות. אחרי הדמיה לכל קבוצה, מצאנו כי WSS חש מאת endocardium דרך חריץ באיתות יוזם trabeculation.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השיטות הבאות בוצעו בהתאם הפרוטוקולים אוטה ו- UCLA IACUC. קבוצות ניסיוני אלה שימשו עם הטרנסגניים Tg(cmlc2:gfp), המוטציות לל (atrium חלש) או שיבוט (cloche) : (א) פראי-סוג (WT) שליטה, (b) gata1a מו ו- (ג) tnnt2a מו זריקות (טבלה 1).

מודל	שם	גנים שהשתנו	גן # מושגים בסיסיים	הפניה
שליטה	פראי סוג	אף אחד	N/A
	Tg(cmlc2:gfp)	שרשרת אור לב צולבות הקישור חוטים שרירן	Flourescence ירוקה במיוחד לידי ביטוי שריר הלב	34
קיר ירד מאמץ גזירה	מוטציה חלש אטריום (לל)	שרשרת heacy ספציפיים אטריום צולבות הקישור חוטים שרירן	אטריום לא חוזה, קומפקטי החדר, הקיר שריר הלב עבה, לומן צר, פתיחה אטריום,	37
	מוטציה cloche (שיבוט)	N/A	הסרה מלאה של endocardium, unaturally האטריום הגדול עם החדר הקטן, cushins לב שאינו קיים	41
	gata1a מו	gata1a	אנמיה מחוסר תאי דם אדומים	4
	tnnt2a מו	tnnt2a		39
קיר מוגברת מאמץ גזירה	EPO mRNA	אף אחד	פוליציטמיה חמורה, עלייה במספר מחזורי כדוריות הדם, גדל צמיגות	6
קיר מוגברת מאמץ גזירה	Isoprotenerol	אף אחד	קצב לב מוגבר	7

טבלה 1: דג זברה תיאורים. הגדרות ותיאורים של דג זברה שימוש בניסויים.

1. לימוד ההתקנה

להכין Nrg1 EPO mRNA לחילוץ trabeculation.
1. להשיג את האדם Nrg1 cDNA ומגבירים מ פלסמיד התורם.
  הערה: CDNA האדם Nrg1 היה מחונן מ ויליאם טלבוט מאוניברסיטת סטנפורד.
  1. להוציא ריאגנטים הדרושות וחומרים, כלומר ה-PCR mastermix (מאוחסן ב-20 ° C) תחל (ראה טבלה 2) (מאוחסן ב-20 ° C), צלחת PCR (מאוחסן בטמפרטורת החדר), על פיפטה 20 μL (מאוחסן בטמפרטורת החדר). עיין בטבלה של חומרים עבור מוצרים לדוגמה.
    
    טבלה 2: צבעי יסוד שיבוט אנושי Nrg1 .
  2. להכין את mastermix כל פריימר להגדיר triplicate באמצעות פיפטה 20 את μL. 1 סט של triplicates, לשימוש 37.5 μL של mastermix, μL 3 של ה-DNA ללא מים, μL 4.5 של פריימר. עבור triplicates יותר, פשוט להכפיל את מספר דוגמאות.
  3. לדלל את הפתרון עובד האדם Nrg1 cDNA (20 ng/μg ריכוז) ברצועת תחל עם מים ללא ה-DNA כדי שלא יהיה 10 μL סה כ כל טוב עבור דגימה.
    הערה: ודא כי כל הפתרונות תחת שלב 1.1.1 מופץ באופן שווה. לעשות זאת על ידי ערבוב כל פתרון על-ידי pipetting למעלה ולמטה. כדי למנוע זיהום צולב, להשתמש עצה פיפטה אחת עבור מדגם אחד בלבד.
  4. Aliquot cDNA Nrg1 עם פיפטה רב ערוצית 10 μL כדי וולס הרצוי בצלחת PCR.
  5. להוסיף 14.5 μL של mastermix cDNA ב הבארות. כיסוי דביק חלות על הצלחת ה-PCR כדי לאטום את הבארות, מקום לתוך המכונה PCR.
  6. . הפעל את המכונה PCR ולהבטיח כי המחזור מגיע לטמפרטורות המתאים על פי אנזימים תחל בשימוש.
2. לשכפל את cDNA Nrg1 לתוך pCS2 פלסמיד⁺ -האתרים BamHI, EcoRI באמצעות אנזימים עודף BamHI, EcoRI כדי להבטיח cDNA הוא מאתרים בתוך כל פלסמידים.
  1. מערבבים cDNA Nrg1 עם התורם פלסמיד pCS2⁺, מאסטר זמינים מסחרית לערבב פתרון תחל (טבלה 2).
    הערה: אמצעי האחסון התגובה הכולל צריך להיות μL 50 עם 25 μL של מיקס מאסטר, μL 3 של צבעי בסיס, μL 1 של 20 ng/μL התורם פלסמיד עם Nrg1 cDNA.
  2. למקם את התמהיל מהשלב 1.1.2.1 המכונה PCR, קבע את הפרמטרים כדי לפגוש את המפרטים הבאים: 98 ° C עבור 10 s, 55 ° C עבור s 5 או 15 ו- 72 ° C עבור s 5/kb.
  3. לטהר את מוצר ה-PCR באמצעות ערכת טיהור ההוראות של היצרן. Elute המוצר לתוך μL 50 • תנאי המאגר.
  4. לעכל את המוצר PCR מטוהרים ו 5 μg של pCS2⁺ עם BamHI, EcoRI בנפרד ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים באמצעי אחסון התגובה 200 μL. לטהר את העיכול וכתוצאה מכך עם ערכת מסחרי, elute 20 μL, μL 100 של טריס-HCl (pH 8.5), בהתאמה.
  5. מאתרים ומפסיקים μL 4 של Nrg1 cDNA וμl 2 של pCS2 מתעכל⁺ פלסמיד בתגובה 25 μL עם 1 μL של זרז ליגאז ב 16 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
    הערה: ההליך יכול להיות עצר כאן. כבר לילה הדגירה.
  6. השתמש μL 2 של הפתרון מצדו מהשלב 1.1.2.5, שינוי צורה לתוך μL 50 של e. coli חיידקים תאים מתאים שיבוט (ראה טבלה של חומרים).
3. לאשר השינוי התרחש על ידי הקרנה ש-cdna Nrg1 שיבוטים באמצעות PCR. לבחור שיבוטים באקראי ולהוסיף את הפתרון של צבעי יסוד מסוים, פולימראז deoxyribonucleotide triphosphates (dNTPs).
  הערה: הפקדים היו וקטור (pCS2⁺) עם או בלי את תותב (cDNA אנושי). לא גדול מדי של מושבה כי חיידקים מופרז יכול לעכב PCR.
  1. לבחור 8 מושבות של pCS2 שינוי, מסך⁺-Nrg1 שיבוטים באמצעות תחל את ה-PCR בטבלה2.
  2. תרבות אחד שיבוט עם cDNA Nrg1 כדי לבודד את pCS2⁺-Nrg1 פלסמיד ה-DNA. לחסן עם 100 μL של e. coli חיידקים עם pCS2⁺-Nrg1 פלסמיד לתוך 100 מ ל LB מדיה, והתרבות ע י ניעור (160-225 RPM) ב 37 º C.
4. Transfect pCS2 מטוהרים⁺-Nrg1 פלסמיד לתוך HEK-293 תאים בצלחת 6-ובכן באמצעות ריאגנט תקנים מסחרי ההוראות של היצרן.
5. 24 שעות לאחר תרביות תאים, lyse התאים באמצעות מאגר פירוק לרוץ דרך של ג'ל מרחביות-דף, להעביר את קרום ג'ל ו ואז כתם עם אנטי-נוגדןNrg1 ²². ודא Nrg1 חלבון הביטוי תוך שימוש מערבי של כתם.
  הערה: הפקד נמצא pCS2 ריקה⁺ פלסמיד. ניתן להשהות כאן אם ג'ל ממברנה העברה מתרחשת בין לילה.
6. לסנתז mRNA Nrg1 באמצעות מוצר מסחרי דומה לזה את הטבלה של חומרים ובצע הוראות היצרן.
  1. . קח 5 μL של pCS2⁺-DNA Nrg1 מן התרבות חיידקים מבודדים, תקציר עם NotI בתגובה 200 μL עבור 2 h ב 37 ° C כדי linearize את פלסמיד.
  2. לטהר את פלסמיד ליניארית עם ערכת מסחרי, elute, μL 20 של טריס-HCl (pH 8.5).
  3. לנהל את תמלול במבחנה עם ערכת בידוד RNA מסחרי בתגובה 20 μL באמצעות 5 μL של פלסמיד ליניארית ההוראות של היצרן.
  4. הוסף במבחנה עיבד Nrg1 כדי μL 350 מאגר פירוק RNA ולטהר ואז עם ערכת בידוד ה-RNA. Elute את הרנ א לתוך μL 60 של טריס-HCl (pH 8.5).
  5. למדוד את ריכוז ה-RNA ולאחסן ב-80 מעלות צלזיוס לשימוש עתידי.
7. השלבים הבאים 1.1.6.1 - 1.1.6.5 לעיל עבור EPO cDNA mRNA הכנה אבל שיבוט cDNA לתוך פלסמיד pCS2 + EcoRI, XhoI אתרי במקום.
מזריקים מורפולינו לתוך דג זברה
1. עיצוב²³ זריקות מו באמצעות כלי מקוון (טבלה של חומרים) נגד ATG רצף gata1a⁴ (יונקות-CTGCAAGTGTAGTATTGAAGATGTC-3′) ו- tnnt2a⁵ (יונקות-CATGTTTGCTCTGATCTGACACGCA-3′).
2. הוסף gata1a tnnt2a מו בנפרד למים ללא נוקלאז כדי להפוך את הסופי ריכוזי ng 8/nL 4 ng/nL, בהתאמה. חזור עם EPO mRNA עם ריכוז סופי של 20 pg/nL. ודא כי אמצעי האחסון הסופי 1 מ"ל.
3. להזריק 1 nL של ng/nL 8 של gata1a מו ו- 1 nL של ng/nL 4 של tnnt2a מו לתוך דג זברה נפרד עוברי ב 1 לשלב 4 תאים כדי להפחית את הקיר חדרית גזירה (WSS)²⁴. כדי להגדיל WSS, להזריק 1 nL של 20 pg/nL של EPO mRNA⁶ לתוך העוברים דג זברה בשלב 1 - ל 4 תאים.
מבחינה כימית לטיפול דג זברה לעכב trabeculation
1. באמצעות פיפטה 20 מ"ל, לדלל את 10 מ"ג/מ"ל AG1478 ב דימתיל סולפוקסיד 1% ב- E3 בינוניים עד ריכוז סופי של μM 5 וחצי hpf לתוך צינור 15 מ"ל. כפקד, להתייחס לכל דג עם דימתיל סולפוקסיד 1% בלבד.
2. להוסיף N-[N-(3,5-Difluorophenactyl)-L-Alanyl]-S-Phenylglycine t-בוטיל אסתר (DAPT) ב 1% דימתיל סולפוקסיד (100 μM) לבינונית E3 בצינור 15 mL כדי לעכב את חריץ איתות בגיל 40 hpf באופן דומה. כפקד, פנקו עם דימתיל סולפוקסיד 1% בלבד.

2. טכניקות הדמיה

4-D הלב LSFM הדמיה עם אלגוריתם סינכרון
1. להשתלט תמונות דו-ממד של העובר דג שלם מרובות הלב פועם מחזורים באמצעות השלבים להלן (איור 1). ודא כי העובי אור גיליונות כ 5 μm. לקחת 500 x-y מסגרות עם מועד החשיפה של גב' 10 ערכת z-הסריקה μm 1 עבור דגימה דיגיטלית ללא אובדן נתונים על-פי עקרון הדגימה נייקוויסט²⁵.
  1. יצירת ג'ל agarose 1% (w/v) על-ידי הוספת 1 גר' agarose 100 מ ל חימום זה עד agarose כל היא התפרקה. לטעון צינור פלסטיק קטן עם העובר, agarose באמצעות פיפטה 20 μL ואבטח אותו על הבמה.
  2. פתחו את התמונה במלונות התוכנה ולחצו על ' חי כדי לראות את התצוגה בשידור חי של המדגם. להתאים את המטרה באמצעות הידית כך המדגם יהיה בפוקוס. באופן דומה, להזיז את הבמה כך התצוגה בשידור חי של המדגם מציגה העליון של העובר.
  3. תמונות פי 500 עבור 5 s ב 10 X הגדלה באמצעות תוכנה של המיקרוסקופ²⁶.
  4. להזיז את הבמה באמצעות המנוע בשכבה חדשה (1 μm ב ציר z) וחזור על התהליך הדמיה.
  5. חזור על הצעדים 2 שלעיל עד בלב שלם לגמרי עם תמונה.
2. ולהבטיח את שלמות הנתונים על-ידי התעלמות תמונות מחזור הלב הראשון והאחרון. למצוא את התקופה של מחזור הלב על ידי התאמת תמונות שצולמו בנקודת זמן באותו מחזור הלב, אך בתקופות שונות. השתמש במשוואה הבאה שפותחה כדי למצוא את התקופה:
  (1)
  כאשר D הוא הפונקציה עלות לשימוש הולם השערה תקופתי, אני_מ' בתמונה שנלכדה, τ' הזמן התמונה צולמה, x_m z_k z-כיוון האינדקס של התמונה, הוא וקטור של מדד פיקסלים, ו- T' הוא ההשערה תקופתיים.
3. להשתמש במשוואה הבאה כדי למצוא את משמרת יחסי בין שתי התמונות בשלבים דומים:
  (2)
  איפה קיו_{k', k} מציין פונקציה עלות למשמרת היחסי, R היא השכונה המרחבי אפשרי, L הוא הזמן הכולל של לכידת התמונה, x הוא z אינדקס, z_k ו- פיקסל_k' הן הפרוסות z-הכיוון הראשון והשני, טי שווה ו s הוא ההשערה משמרת יחסי.
4. להמיר את משמרת יחסי shift מוחלטת לגבי התמונה הראשונה ולפתור את המשוואה הקווית באמצעות הגישה הופכי מדומים, כדי למצוא את הקשר המוחלט ליישור בסעיף הבא של תמונות כמו שתואר לעיל²⁷.
5. התמונות 4-D הסופי עובדו באמצעות תוכנת עיבוד תמונה (טבלה של חומרים).
  1. תמונות דו-ממד הערימה תלת-ממד
    1. פתחו תמונה מסחרי בתוכנת עיבוד.
    2. לחץ על נתונים פתוח.
    3. בחר את כל התמונות ניתן לערום לתוך תלת מימד > לחץ על טען.
    4. הוסף ב voxel בגודל של 0.65 x 0.65 x 1 > לחץ על אישור.
    5. לחץ על תיבת תצוגה Multi-Planar להמחיש את תמונת תלת-ממדי.
    6. לחץ לחיצה ימנית על התיבה הכחולה slice_1.tiff > בחר תצוגה > בחר Volren.
    7. לחץ על עריכה > בחר אפשרויות > בחר לערוך Colormap.
    8. התאמת צבע בעזרת התיבות במסגרת אדומה > לחץ על אישור.
  2. המרת תלת-ממד ל- 4-D
    1. לחץ על "קובץ > פתח זמן סדרת נתונים.
    2. בחר את tiffs תלת-ממדיים שבוצעו רק > לחץ על טען.
    3. הזן voxel בגודל זהה לפני.
    4. תיבת כחול slice_1.tiff קליק ימני > בחר "תצוגה" > בחר Volren.
    5. לחץ על עריכה > בחר אפשרויות > בחר לערוך Colormap. התאמת צבע בעזרת התיבות > לחץ על אישור.
    6. פקד זמן סדרת קליק ימני > לחץ על הסרטים > לחץ על הפעל כדי לראות את הסרט.
    7. הוספת שם הקובץ, גודל המסגרת, קצב מסגרות, איכות שווה ל- 1, הקלד Monoscopic > לחץ על החל
    8. לייצא את הסרטונים. לפתוח את הוידאו בתוכנה מתאימה.

3. לרביעיית-PCR ניתוח

דג זברה לב RNA בידוד לכמת חריץ ליגנדים, רצפטורים, והקצו הביטויים של גנים
1. להקריב את דג זברה במינים אותם על מנת יתר של tricaine methylate²⁸^,²⁹. באמצעות פרוטוקול שתואר לעיל³⁰, הלבבות דג זברה היו טוחנות ואני מוכן לבידוד RNA.
2. לבודד את הרנ א הכולל, לסנתז את cDNA באמצעות ערכת סינתזה cDNA ההוראות של היצרן.
3. לעצב את תחל PCR על ליגנדים דרגה Jag1, Jag2, Dll4, קולטן Notch1bו איתות הקשורים הגנים Nrg1 ו ErbB2. ראו טבלה 3 תחל השתמשנו.
4. להוסיף את תחל מהשלב 3.1.3 של mRNA מבודד מהשלב 3.1.2, mastermix מסחרי הצלחת ה-PCR. להפעיל את לרביעיית-PCR הטמפרטורה המתאימה והשעות לפי האנזימים בשימוש. לנרמל את התוצאות דג זברה α-אקטין.
  הערה: זה יחשב את רמות ביטוי לכל אחד של ליגנדים, רצפטורים, גנים.

4. ניסויים במבחנה האנושי אבי העורקים אנדותל תא (HAEC)

מודל דינמי מאמץ גזירה
1. תאים HAEC תרבות HAEC תרבות המדיה. ברגע מלא confluent, לחשוף את התאים כדי זרימה שכבתית וזרימה פועמת של 23 x 10^-5 N בקצב של 1 הרץ במשך 24 שעות ביממה.
  1. לחמם EC מדיה/DMEM 10% FBS במים אמבטיה עבור 20 דקות.
  2. לאחזר תאים HAEC מיכל חנקן נוזלי ומניחים את המבחנה לאמבט מים עד נמס.
  3. באמצעות פיפטה 1,000 μL, להסיר תאים המופשרים ולשים אותם בצינור 15 מ"ל עם 3-5 מ של מדיה. Centrifuge הפתרון תא ב g x 53 למשך 3 דקות.
  4. האחות הפתרון מחוץ ומוסיפים מספיק מדיה עבור הנפח הכולל של 10 מ"ל. להוסיף את הפתרון תא בקבוקון T75 סטרילי, קאפ. הבקבוק והפצה התאים באופן שווה על החלק התחתון של הלוח.
  5. סמן את הבקבוק עם ראשי התיבות, תאריך, סוג התא ומספר המעבר. דגירה. הבקבוק ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂, עד שהתאים confluent 80%. זכור לשנות את המדיה כל 2-3 ימים.
  6. באמצעות משאבה מסחרי, לצרף את הצנרור. הבקבוק, והגדר את הפרמטרים שהוזכרו לעיל ב שלב 4.1.1³¹^,³²^,³³.
2. להוסיף GI254023X 50 מ של HAEC בינוני-ריכוז הסופי של 5 μM למשך 30 דקות.
3. עם GI254023X טרום מעורב, מעכב ADAM10 אשר מדכאת את חריץ איתות, לנהל את אותה זרימה שכבתית או זרימה פועמת ניסויים כמו 4.1.1.
4. לכמת ליגנדים דרגה (Jag1, Jag2, ו- Dll4), דרגה היעד גנים (שעיר, וריח של ספליט [הס]) באמצעות PCR לרביעיית עבור ארבע קבוצות של דגימות HAEC (זרימה שכבתית, זרימה שכבתית + GI254023X, זרימה פועמת, זרימה פועמת + GI254023X) תיארו בעבר³².

5. הצלה וביטוי יתר של חריץ איתות

להזריק 1 nL של mRNA Nrg1 מוכן-ריכוז של pg/nL 5 (מתוך שלב 1.1.6) בשלב 1 - ל 4 תאים עם gata1a מו כדי overexpress דרגה היעד גנים²⁴.
להזריק 1 nL של mRNA Nrg1 לתוך לל מוטציה בדרך דומה²⁴.
להכפיל את הריכוז של ה-mRNA Nrg1 (pg 10/nL) ולהזריק²⁴ 1 nL לתוך דג זברה להתבונן המורפולוגיה חדרית.
להזריק 1 nL של pg/nL 20 של EPO mRNA⁶ לתוך העוברים דג זברה בשלב 1-4-לתא להגדיל hematopoiesis להגדיל WSS חדרית כאמור שמוצג²⁴.
להזריק 1 nL של 50 μM Isoproterenol⁷, אשר מגביר את הקצב של contractility, למדיום E3 במשך 24 שעות ביממה תוך דג זברה מתורבתים כפי שמוצג בעבר²⁴.
לבצע הדמיה LSFM 4-D עבור כל קבוצה. בצע את ההוראות המופיעות שלבים 2.1.1-2.1.5.2.8.

6. כימות של קיצור החלקי ועוצמת השינוי לאורך זמן

לבצע הדמיה LSFM 4-D עבור כל קבוצה ב- 50, 75 ו 100 hpf. עקוב אחר ההוראות 2.1.1-2.1.5.2.8 צעדים. מחלקים כל תמונה אז כל הצמתים 600 עבור שכפול של התנועה קיר הלב.
למדוד את השינוי בקוטר של החדר במהלך diastole סיסטולה באמצעות הנוסחה הבאה:
(3)
טעינת תמונות חדרית תלת-ממדי על כל 0.1 s עם תוכנת ויזואליזציה ולמדוד אמצעי האחסון.
מגרש שינוי עוצמת הקול לאורך זמן עבור כל קבוצה ניסיוני ב-75 hpf ו- 100 hpf.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LSFM שימש כתב יד זה על מנת לרכוש תמונות דו-ממד ותלת -ממדיים ברזולוציה גבוהה. כפי שניתן לראות באיור 1A ו- 1B, העדשה תאורה מנחה את הגיליון אור ב המדגם. בגלל דלילות הגיליון אור, מואר רק מטוס בודד. העדשה זיהוי בניצב ממוקם על העדשה תאורה, מתמקדת המטוס מואר (איור 1B). הגיליון אור מן העדשה תאורה סורק את הדגימה משמאל לימין (איור 1C). הסריקה מאפשרת פחות הלבנת-צילום, צילום-רעילות, יש יחס אות ל...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ב פרוטוקול זה, אנחנו הראו כי הדמיה 4-D יכול לשמש כדי לעקוב אחר התפתחות רשת trabecular בתגובה לשינויים בכוחות ביו-מכני. בפרט, הלחץ הטיה מנוסים על ידי תאי אנדותל יוזם את החריץ איתות אשד, אשר בתורו מקדם trabeculation. כתב יד זה, אנחנו הראו כי הזרקת gata1a מו (1) ירידה hematopoiesis, לכן הוא מופחת קיר גזירה, הזרקת tnnt2a מו (2) מעוכבים חדרית הפונקציה כויץ כדי להפחית את הקיר גזירה, ו- (3) לל מוטציות חסרה התכווצות פרפור, ואז להפחתה הכוח והמודינמיקה שהוחל הנוזלים. על-ידי הפחתת הלחץ הטיה על קירות הלב, ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים ברצוננו להביע תודה ויליאם טלבוט מאוניברסיטת סטנפורד למתן את האדם Nrg1 cDNA וכדי דבורה ילון מ UCSD למתן לל מוטציות . המחברים גם רוצה תודה חן סינתיה עוזר עם רכישת התמונה. מחקר זה נתמך על ידי מענקים NIH HL118650 (טי-קיי Hsiai), HL083015 (ל Hsiai טי-קיי), HD069305 (כדי לא מחובר צ'י, טי-קיי Hsiai.), HL111437 (ל Hsiai טי-קיי, לא מחובר צ'י), HL129727 (ל Hsiai טי-קיי), T32HL007895 (כדי פקרד Sevag ר. ר), HL 134613 (ל Messerschmidt (פ')), האוניברסיטה של טקסס מערכת כוכבים מימון (לי).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Clontech Hifi PCR טרום מיקס	טאקרה	639298	PCR mastermix 1.1.1.1, 1.1.1.2, 1.1.1.5, 1.1.2.1, 3.1.4
Nrg1 מתנת cDNA	מוויליאם טלבוט, אוניברסיטת סטנפורד, סטנפורד, קליפורניה, ארה"	N/A	משמש לחילוץ טרבקולציה 1.1.1.3, 1.1.1.4, 1.1.2.1
CFX Connect™ מערכת זיהוי PCR בזמן אמת	Bio-Rad	1855201	מכונת PCR 1.1.1.5, 1.1.1.6, 1.1.2.2, 1.1.3.2
pCS2+	GE Health		Plasmid המשמש לסינתזה mRNA 1.1.2.1, 1.1.2.4, 1.1.2.5
ערכת טיהור נוקלאוספינים	Clontech	740609.25	טיהור DNA 1.1.2.3, 1.1.2.4, 1.1.6.2
T4 DNA ligase	Clontech	2011A	PCR Ligation solution 1.1.2.5
תאים מוכשרים כוכביים	Clontech	636763	E. coli תאים המשמשים לטרנספורמציה 1.1.2.6, 1.1.3.1, 1.1.3.2
מגיב טרנספקציה ליפופקטמין 2000 מגיב טרנספקציה	Life Technologies	11668027	מגיב טרנספקציה 1.1.4
ערכת mMessage SP6	Invitrogen	AM1340	ערכה המשמשת לסינתזה mRNA 1.1.6.3
Aurum Total RNA Mini Kit	Bio-Rad	7326820	מטהר RNA 1.1.6.4, 3.1.2
GeneTools 4.3.8	GeneTools	N/A	תוכנה לעיצוב פריימר 1.2.1, 3.1.3
EPO cDNA	Creative Biogene	CDFH006026	מגדיל WSS 1.2.2, 1.2.3, 1.1.7
AG1478	Sigma-Aldrich	מעכב T4182	ErbB 1.3.1
E3 בינוני			לגידול עוברים 1.3.1, 1.3.2, 5.1.5
DAPT	Sigma-Aldrich	D5942	γ-מעכב סקרטאז 1.3.2
אגרוז	סיגמא-אולדריץ'	A9539	משמש להרכבת עוברים 2.1.1.1
ORCA-Flash4.0 LT מצלמת CMOS דיגיטלית	Hamamatsu Photonics	C11440-42U	משמשת לצילום תמונות 2.1.1.2, 2.1.1.3
תוכנת Amira	תוכנת FEI	N/A	תמונות חזותיות ומנותחות לתלת מימד, ו-4D 2.1.5.1.1-2.1.5.2.8
Tricaone mesylate	סיגמא-אולדריץ'	886-86-2	משמש להרדמה או הקרבה אנושית של עוברים 3.1.1
iScript cDNA Synthesis	Kit Bio-Rad	1708890	מסנתז cDNA 3.1.2
Eppendorf 5424 מיקרו-צנטריפוגה	Eppendorf	05-400-005	Microcentrifuge 4.1.1.3
GI254023X	Sigma-Aldrich	260264-93-5	מעכב ADAM10 4.1.2, 4.1.3
איזופרנלין הידרוכלוריד	סיגמא-אולדריץ'	I5627	איזופרוטרנול מגביר את WSS 5.1.5
MATLAB	Mathworks	N/A	ניתוח מכניקת לב

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lee, J., et al. Moving domain computational fluid dynamics to interface with an embryonic model of cardiac morphogenesis. PLoS One. 8 (8), e72924(2013).
Peshkovsky, C., Totong, R., Yelon, D. Dependence of cardiac trabeculation on neuregulin signaling and blood flow in zebrafish. Dev Dyn. 240 (2), 446-456 (2011).
High, F. A., Epstein, J. A. The multifaceted role of Notch in cardiac development and disease. Nat Rev Genet. 9 (1), 49-61 (2008).
Galloway, J. L., Wingert, R. A., Thisse, C., Thisse, B., Zon, L. I. Loss of Gata1 but Not Gata2 Converts Erythropoiesis to Myelopoiesis in Zebrafish Embryos. Developmental Cell. 8 (1), 109-116 (2005).
Chi, N. C., et al. Cardiac conduction is required to preserve cardiac chamber morphology. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (33), 14662(2010).
Paffett-Lugassy, N., et al. Functional conservation of erythropoietin signaling in zebrafish. Blood. 110 (7), 2718(2007).
De Luca, E., et al. ZebraBeat: a flexible platform for the analysis of the cardiac rate in zebrafish embryos. Scientific Reports. 4, 4898(2014).
Liu, J., et al. A dual role for ErbB2 signaling in cardiac trabeculation. Development. 137 (22), 3867-3875 (2010).
Samsa, L. A., et al. Cardiac contraction activates endocardial Notch signaling to modulate chamber maturation in zebrafish. Development. 142 (23), 4080-4091 (2015).
Li, Y., et al. Global genetic analysis in mice unveils central role for cilia in congenital heart disease. Nature. 521, 520(2015).
Sifrim, A., et al. Distinct genetic architectures for syndromic and nonsyndromic congenital heart defects identified by exome sequencing. Nature Genetics. 48, 1060(2016).
Hu, Z., et al. A genome-wide association study identifies two risk loci for congenital heart malformations in Han Chinese populations. Nature Genetics. 45, 818(2013).
Huisken, J., Stainier, D. Y. R. Selective plane illumination microscopy techniques in developmental biology. Development (Cambridge, England). 136 (12), 1963-1975 (2009).
Panier, T., et al. Fast functional imaging of multiple brain regions in intact zebrafish larvae using Selective Plane Illumination Microscopy. Frontiers in Neural Circuits. 7, 65(2013).
Lee, E., et al. ACT-PRESTO: Rapid and consistent tissue clearing and labeling method for 3-dimensional (3D) imaging. Scientific Reports. 6, 18631(2016).
Kelley, L. C., et al. Live-cell confocal microscopy and quantitative 4D image analysis of anchor-cell invasion through the basement membrane in Caenorhabditis elegans. Nature Protocols. 12, 2081(2016).
Lee, J., et al. 4-Dimensional light-sheet microscopy to elucidate shear stress modulation of cardiac trabeculation. The Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1679-1690 (2016).
Lavagnino, Z., et al. 4D (x-y-z-t) imaging of thick biological samples by means of Two-Photon inverted Selective Plane Illumination Microscopy (2PE-iSPIM). Scientific Reports. 6, 23923(2016).
Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Optical Sectioning Deep Inside Live Embryos by Selective Plane Illumination Microscopy. Science. 305 (5686), 1007(2004).
Hove, J. R., et al. Intracardiac fluid forces are an essential epigenetic factor for embryonic cardiogenesis. Nature. 421 (6919), 172-177 (2003).
Bakkers, J. Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease. Cardiovascular Research. 91 (2), 279-288 (2011).
BioRad. General Protocol for Western Blotting. 6376, http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_6376.pdf (2018).
GeneTools. Gene Tools Oligo Design Website. , https://oligodesign.gene-tools.com/request/ (2018).
Mullins, M. Zebrafish Course. , ed University of Chicago (2013).
Grenander, U. Probability and Statistics: The Harald Cramér Volume. , Alqvist & Wiksell. (1959).
Fei, P., et al. Cardiac Light-Sheet Fluorescent Microscopy for Multi-Scale and Rapid Imaging of Architecture and Function. Scientific Reports. 6, 22489(2016).
Liebling, M., Forouhar , A. S., Gharib, M., Fraser, S. E., Dickinson, M. E. Four-dimensional cardiac imaging in living embryos via postacquisition synchronization of nongated slice sequences. Journal of Biomedical Optics. 10 (5), (2005).
Adeoye, A. A., et al. Combined effects of exogenous enzymes and probiotic on Nile tilapia (Oreochromis niloticus) growth, intestinal morphology and microbiome. Aquaculture. 463, 61-70 (2016).
Matthews, M., Varga, Z. M. Anesthesia and Euthanasia in Zebrafish. ILAR Journal. 53 (2), 192-204 (2012).
Singleman, C., Holtzman, N. G. Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (55), e3165(2011).
Li, R., et al. Disturbed Flow Induces Autophagy, but Impairs Autophagic Flux to Perturb Mitochondrial Homeostasis. Antioxidants & Redox Signaling. 23 (15), 1207-1219 (2015).
Li, R., et al. Shear Stress-Activated Wnt-Angiopoietin-2 Signaling Recapitulated Vascular Repair in Zebrafish Embryos. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 34 (10), 2268-2275 (2014).
Baek, K. I., et al. Flow-Responsive Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-Protein Kinase C Isoform Epsilon Signaling Mediates Glycolytic Metabolites for Vascular Repair. Antioxidants & Redox Signaling. 28 (1), 31-43 (2018).
Huang, C. J., Tu, C. T., Hsiao, C. D., Hsieh, F. J., Tsai, H. J. Germ-line transmission of a myocardium-specific GFP transgene reveals critical regulatory elements in the cardiac myosin light chain 2 promoter of zebrafish. Developmental Dynamics. 228 (1), 30-40 (2003).
Vermot, J., et al. Reversing blood flows act through klf2a to ensure normal valvulogenesis in the developing heart. PLoS Biol. 7 (11), (2009).
Grego-Bessa, J., et al. Notch signaling is essential for ventricular chamber development. Dev Cell. 12 (3), 415-429 (2007).
Berdougo, E., Coleman, H., Lee, D. H., Stainier, D. Y. R., Yelon, D. Mutation of weak atrium/atrial myosin heavy chain disrupts atrial function and influences ventricular morphogenesis in zebrafish. Development. 130 (24), 6121(2003).
Arnaout, R., et al. Zebrafish model for human long QT syndrome. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (27), 11316-11321 (2007).
Chi, N. C., et al. Genetic and physiologic dissection of the vertebrate cardiac conduction system. PLoS Biol. 6 (5), e109(2008).
Liao, W., et al. The zebrafish gene cloche acts upstream of a flk-1 homologue to regulate endothelial cell differentiation. Development. 124 (2), 381-389 (1997).
Stainier, D. Y., Weinstein, B. M., Detrich, H. W. 3rd, Zon, L. I., Fishman, M. C. Cloche, an early acting zebrafish gene, is required by both the endothelial and hematopoietic lineages. Development. 121 (10), 3141-3150 (1995).
Santi, P. A. Light Sheet Fluorescence Microscopy: A Review. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 59 (2), 129-138 (2011).
Engelbrecht, C. J., Stelzer, E. H. Resolution enhancement in a light-sheet-based microscope (SPIM). Optics Letters. 31 (10), 1477-1479 (2006).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תיקון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart
Posted by JoVE Editors on 9/03/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart. Additional author names were added, and an author affiliation was updated.

The author list was updated from:

Victoria Messerschmidt*¹, Zachary Bailey*¹, Kyung In Baek², Richard Bryant¹, Rongsong Li², Tzung K. Hsiai², Juhyun Lee¹

to:

Victoria Messerschmidt*¹, Zachary Bailey*¹, Kyung In Baek², Yichen Ding², Jeffrey J. Hsu², Richard Bryant¹, Rongsong Li², Tzung K. Hsiai², Juhyun Lee¹

The author affiliation for Rongsong Li was updated from:

Department of Medicine (Cardiology) and Bioengineering, UCLA

to:

College of Health Science and Environmental Engineering, Shenzhen Technology University

תגיות

Notch 4D Gata1a mRNA Nrg1 Tnnt2a

מיקרוסקופ אור גיליונות זריחה כדי ללכוד תמונות 4-מימדי של השפעות להתכוונן גזירה על הלב דג זברה המתפתח

במאמר זה

הודעת תיקון

סיכום

תקציר

מבוא

פרוטוקול

תוצאות

דיון

גילויים

תודות

חומרים

מקורות

הדפסות חוזרות והרשאות

תיקון

תגיות

מאמרים קשורים