מאמר שיטה

ניתוח מתא בודד של Immunophenotype וייצור ציטוקין בדם כל הפריפריה באמצעות Cytometry המונית

DOI:

10.3791/57780

⸱

26 ביוני 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Immunology and Microbiology, University of Colorado School of Medicine, 2OMNI Biomarkers, Development Sciences, Genentech, 3Department of Pediatrics, Division of Allergy and Immunology, University of Colorado School of Medicine

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן נתאר בגישה פרוטיאומיה מבנית תא בודד כדי להעריך את החיסון פנוטיפי ו פונקציונלי (ציטוקינים תאיים אינדוקציה) שינויים בדגימות דם היקפיים, נותחו באמצעות cytometry המוני.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ציטוקינים לשחק תפקיד מרכזי בפתוגנזה של מחלות אוטואימוניות. לפיכך, מדידת רמות ציטוקינים כבר המוקד של מחקרים רבים בניסיון להבין את המנגנונים מדויק להוביל להתמוטטות של self-tolerance ושל הבאים מחלת חיסון עצמי. הגישות כה התבססו על המחקר של היבט מסוים אחד של המערכת החיסונית (יחיד או מספר סוגי תאים או ציטוקינים), ואת לא מציעים הערכה גלובלית של מחלה אוטואימונית מורכבת. בעוד מחקרים מבוססי סרה החולה היה להרשות לעצמו תובנות חשובות מחלת חיסון עצמי, הם אינם מספקים מקור סלולרית מסוימת ציטוקינים dysregulated זוהה. גישה בתא יחיד כוללת כדי להעריך את ייצור ציטוקינים קבוצות משנה מרובות תאים חיסוניים, בהקשר של "מהותי" פלזמה החולה הספציפי במחזור גורמים, מתואר כאן. גישה זו מאפשרת ניטור של פנוטיפ המערכת החיסונית החולה הספציפי (סמני פני השטח) פונקציה (ציטוקינים), או מקורי שלו "מהותי פתוגניים" מחלת המדינה, או הנוכחות של סוכני טיפולית (vivo בתוך או ex-vivo).

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחלות אוטואימוניות הן הגורם העיקרי התחלואה והתמותה המשפיעים על 3-8% מכלל האוכלוסייה. בארצות הברית, הפרעות אוטואימוניות הם בין הגורמים המובילים. למוות אצל נשים בגיל העמידה, צעיר (גילאי < 65 שנה)1,2. הפרעות אוטואימוניות מאופיינים מצגת הטרוגניות קלינית ותהליכים אימונולוגי כבסיס מגוונות. הספקטרום של הטרוגניות מיוצגת היטב על פני הפרעות שונות, כגון משותפת במעורבות דלקת מפרקים שגרונית (RA), מחלה נוירולוגית ב טרשת נפוצה (MS). עם זאת, רמה זו של הטרוגניות היא גם ביטוי תוך הפרעה יחיד, כגון זאבת אדמנתית מערכתית (מירה כהן): חלק מהחולים יכול להציג עם הפתולוגיה הכליה, בעוד שאחרים סובלים מעורבות המטולוגיות או משותפת3.

השיגה הבסיסית הפרעות אוטואימוניות שיקוף של הטרוגניות קלינית, מעורבים, hyper-הפעלה אוטומטית של מספר קבוצות משנה תא החיסון מולדים, גמישים, וייצור dysregulated והמצוות ציטוקין. ואילו ציטוקינים לשחק תפקיד מרכזי בפתוגנזה של מחלת חיסון עצמי, הבנת תפקידם ספציפית את המנגנון של מחלת הוכיחה להיות מאתגרת. ציטוקינים מאופיינים פליאוטרופיה (ציטוקין אחד יכול להיות אפקטים מרובים על סוגי תאים שונים), יתירות (ציטוקינים מרובים יכול להיות אפקט זהה), דואליות (ציטוקין אחד יכול להיות פרו - או אנטי - inflammatory תופעות בתנאים שונים), הפלסטיות (ציטוקינים יכול להיות יצוק לתוך תפקיד שונה מכל אחד "מקורי", בהתאם לסביבת)4,5,6. כתוצאה מכך, האוכלוסיה ברמת שיטות מבדילה הטרוגנית הסלולר התגובות לאותו "ציטוקין סביבה". באופן דומה, לומדים עיצובים להתמקד בהיבט מסוים אחד של המערכת החיסונית (סוג של תא בודד או ציטוקינים), לא מציעים הערכה גלובלית של כל הגורמים המעורבים מחלות אוטואימוניות מורכבות. בעוד מחקרים מבוססי סרה החולה היה להרשות לעצמו תובנות חשובות מחלת חיסון עצמי, הם אינם מספקים מקור סלולרית מסוימת ציטוקינים dysregulated זוהה.

לאחרונה פיתחנו בגישה פרוטיאומיה מבנית תא בודד בו זמנית להעריך מספר סוגי תאים חיסוניים, לזהות חצרו של המטופל הספציפי "פתוגניים" פלזמה דם היקפיים במחזור גורמים לפליטת ציטוקינים שונים שלהם. זרימת העבודה המתוארת כאן מאופיין על ידי השימוש של דגימות דם היקפיים ללא פגע, לעומת תאי תאי דם היקפיים מבודד (PBMCs). דם היקפיים מייצג את הרכב הרלוונטיים ביותר מבחינה פיזיולוגית ללמוד מחלה מערכתית בתיווך החיסון, כולל 1) הלא-תאי תאי דם לעיתים קרובות מעורבים מחלות אוטואימוניות (קרי, נויטרופילים, טסיות דם), ו 2) פלזמה במחזור גורמים, כגון חומצות גרעין, מכלולים חיסוניים ציטוקינים, אשר יש תפקידים הפעלת מערכת החיסון. כדי ללכוד "מהותי פתוגניים" dysregulated ייצור ציטוקינים, דם היקפיים דגימות יעובדו מיד לאחר ההגרלה דם (T0, זמן אפס), ואחרי 6-אייץ ' של דגירה ב 37 מעלות צלזיוס (חום הגוף פיזיולוגיים) עם טרנספורט חלבון מעכב, בהעדר כל אקסוגניים מגרה תנאי (T6, הזמן 6 h), כדי לזהות ייצור ציטוקינים (הצטברות, T6-T0) המשקפים את מצב המחלה "מהותי" (איור 1). ללמוד תהליכים dysregulated המשקפים מעל או מתחת הפעלת איתות המעורבים בתגובות החיסון הרלוונטיים למחלה, בדגימת דם היקפיים שטופלו (6-אייץ ' הדגירה ב 37 ° C עם מעכב תחבורה חלבון) אקסוגני עירור מצב זה משקף בפתוגנזה של המחלה, כגון אגרה-כמו-קולטן (TLR) אגוניסטים במקרה של מירה כהן (T6 + R848, הזמן 6 h עם µg 1/mL R848), כדי לזהות ייצור ציטוקינים שתשקף בתגובה חומצות גרעין (השוואת T0 לעומת T6 לעומת T6 + R848, איור 1). ללמוד immunomodulatory ההשפעות של הרפוי זמין ex-vivo, ובארכיון לתהליכים מדויקים dysregulated המערכת החיסונית לחולים ספציפיים, דגימות דם היקפיים שטופלו JAK מעכב-הרלוונטי טיפולית ריכוז (כאן, 5 אום ruxolitinib; T6 + 5R, זמן 6 שעות עם 5 אום ruxolitinib), כדי לזהות שינויים במצב המחלה "מהותי", בתגובה התרופה (T0 לעומת T6 לעומת T6 + 5R, איור 1). מעכב JAK נבחר במחקר זה כיוון JAK מעכבי הוכחו להיות מוצלח בטיפול של הפרעות אוטואימוניות כגון רה

להעריך בו זמנית את התהליכים dysregulated המתוארים לעיל מספר ערכות המשנה תא החיסון, דגימות דם היקפיים של מירה כהן החולים בקרות בריא היו כמתואר לעיל מעובדים נותחו על ידי cytometry המוני. המוני cytometry, הידוע גם בשם Cytometry-זמן-של-טיסה, מציע ניתוח מתא בודד של פרמטרים מעל 40 בלי בעיות של ספקטרלי חופפים7,8,9. טכניקה זו מנצל איזוטופים נדירים מתכת בצורת יונים מתכתיים מסיסים כמו תגיות מוכרחים נוגדנים, במקום fluorophores10. ניתן למצוא פרטים נוספים על הפלטפורמה הטכנולוגית cytometry המוני (קרי, כוונון, כיול, דוגמת רכישה). Leipold et al. , מקארתי. et al. 11 , 12 הגבוה--ממדיות של cytometry המונים מאפשר מדידה סימולטני של ציטוקינים מרובים לאורך קבוצות משנה תא החיסון מולדים, גמישים עם צפיפות בתא יחיד (טבלה של חומרים).

פרמטרים קליניים ומעבדתיים קונבנציונליים הנוכחי הם לעתים קרובות אינם רגישים או ספציפית מספיק לגילוי פעילות המחלה מתמשך או התגובה immunomodulators ספציפיים13, המשקף את הצורך כדאי ניסחו את החיסון הבסיסי שינויים כי הכונן התלקחויות. נתון את התפשטותו של ציטוקין dysregulation מחלת חיסון עצמי, יש שפע של גישות טיפול להשתמש נוגדנים או מעכבי מולקולרי קטן מיקוד ציטוקינים או איתות החלבונים המעורבים ברגולציה של ייצור ציטוקינים לאחרונה הופיע. בתבנית בסיסית שלו, הגישה האנליטית דם היקפיים המתוארים כאן מספק פלטפורמה כדי לזהות קבוצות משנה ספציפי לחולה dysregulated תא ייצורם ציטוקין חריגה במחלות אוטואימוניות עם ביטויים מערכתית. מתודולוגיה זו מאפשרת התאמה אישית של אפשרויות טיפוליות כמו ציטוקינים dysregulated ספציפי ניתן לזהות, טיפול מיוחד אפשרויות יכול להיות נבדק לשעבר vivo כדי להעריך את היכולת שלהם immunomodulate המחלה הספציפי המטופל תהליך.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי קולורדו מרובים מוסדיים סקירה לוח (COMIRB) של מאוניברסיטת קולורדו. כל ההליכים המתוארים להלן צריכה להתבצע בשכונה תרביות רקמה עקר אלא אם צוין אחרת, עם טיפים פיפטה מסוננים, ומסונן ריאגנטים כל.

1. הכנה של ריאגנטים לעיבוד דם היקפיים

  1. הכן ruxolitinib מניות aliquots (10-15 μL/מבחנה לשימוש יחיד)-10 מ מ על ידי דילול הכימית lyophilized ב דימתיל סולפוקסיד לפי הוראות היצרן (החנות ב-80 מעלות צלזיוס). שמור דימתיל סולפוקסיד ריכוז כל מבחני כולל פקדי unstimulated להלן 0.2% (vol/כרך).
  2. הכנת R848 (resiquimod) מניות aliquots (10-15 μL/מבחנה לשימוש יחיד) ב 1 μg/μL על ידי דילול הכימית lyophilized במים סטריליים כמו לפי הוראות היצרן. חנות ב-80 מעלות צלזיוס.
  3. הכן ליפופוליסכריד (LPS) מניות aliquots (5 μL לכל מבחנה עבור שימוש פעם אחת בלבד)-1 μg/μL על ידי דילול הכימית lyophilized במים סטריליים לפי הוראות היצרן. חנות ב-80 מעלות צלזיוס.
  4. הכינו את תא מכתים מדיה (CSM) באמצעות PBS, BSA 0.5% ו- נאן 0.02%3.
  5. לרכוש ולשמור מוכן את התחבורה מעכב (PTI) הקוקטייל של חלבון (טבלה של חומרים).
  6. להפשיר, לדלל את ruxolitinib מניות מבחנה (10 מ מ) 1:10 ב- PBS סטרילי (1 מ מ). להפריש בטמפרטורת החדר בשכונה תרביות רקמה.
  7. הפשרת ו לדלל המבחנה מניות R848 (1 μg/µL) 1:10 ב- PBS סטרילי (0.1 μg/µL). להפריש בטמפרטורת החדר בשכונה תרביות רקמה.
  8. הפשרת ו לדלל את בטחונות (1 μg/µL) מניות המבחנה LPS ב- PBS סטרילי (0.01 μg/µL). להפריש בטמפרטורת החדר בשכונה תרביות רקמה.
  9. לחמם RPMI סטרילי (אין-גלוטמין) בתוך אמבט מים רגילים-37 מעלות צלזיוס (עבור פחות 10 דקות).
  10. לדלל את המאגר lyse/תיקון על ידי 1:5 ב- ddH המסוננות2O (ריכוז בעבודה)-benchtop (לא צריך להיות סטרילי).
    הערה: 1 מ"ל של דם מלא דורש 20 מ של ריכוז בעבודה מאגר lyse/תיקון.
    1. להפוך מאגר lyse/תיקון 5 התנאים של 1 מ"ל של דם מלא לכל (לפחות 100 מ ל). Aliquot 20 מ של ריכוז העבודה lyse/תיקון מאגר לתוך צינורות חרוט 50 מ לכל מיליליטר של דם מלא (לשמור הפתרון lyse/תיקון ב 37 ° C עד שהוא נדרש). תווית התנאים על הצינורות חרוט המכיל מאגר lyse/תיקון כדלקמן: T0 (זמן 0), T6 + 5R (זמן 6 שעות עם 5 אום ruxolitinib), T6 + R848 (שעה 6 שעות עם 1 μg/mL R848), T6 + LPS (זמן 6 שעות עם 0.1 LPS μg/mL), T6 (שעה 6-אייץ ').
  11. תווית עגול התחתון צינורות פוליסטירן סטרילי עם כמוסות וצינורות microcentrifuge 1 מ"ל באותו המינוח כמו שלב 1.10.

2. גירוי ועיבוד של דם היקפיים (איור 1)

  1. מקם את שכותרתו עגול התחתון פוליסטירן צינורות מהשלב 1.11 (T0, T6 + 5R, T6 + R848, T6 + LPS, T6) על מתלה.
    הערה: כל השלבים הבאים מבוצעות בסוג זה של הרכבת התחתית אלא אם צוין אחרת. קאפ הצינורות בעת העברת בין הוד תרביות רקמה חממה כדי לשמור על עקרות.
  2. להוסיף 1 מ"ל של 37 ° C RPMI (לא-גלוטמין) לכל אחד הצינורות (T0, T6 + 5R, T6 + R848, T6 + LPS, T6). היפוך הצינור אוסף דם מספר פעמים, להוסיף 1 מ"ל של דם מלא כל שפופרת, וכן פיפטה לאורך מספר פעמים לערבב ביסודיות עם RPMI (דילול עם RPMI מונע הצליעה של הדם במהלך תקופת הדגירה 6-אייץ ').
  3. להוסיף 10 μL של ה-1:10 ruxolitinib T6 + 5R. מערבבים היטב עם פיפטה P1000. למקם ארון התקשורת של צינורות בחממה ב 37 מעלות צלזיוס ומתחיל עיתוי הדגירה (T = 0).
  4. תהליך הדגימה T0 כדלקמן.
    1. Pipette את כל התוכן של הצינור T0 לתוך צינור חרוטי שכותרתו המכיל 20 מ של 37 ° C עבודה ריכוז lyse/תיקון מאגר. כדי למטב את שחזור התא, לשטוף את הצינור עם עבודה ריכוז lyse/תיקון מאגר. מערבבים על-ידי היפוך הצינור חרוט.
    2. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות לאפשר פירוק, קיבעון. בעקבות קיבעון, ביצוע כל השלבים הבאים-benchtop. צנטריפוגה תאים ב 500 g x עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    3. Decant את תגובת שיקוע. Resuspend תאי 1 מ"ל של PBS קר קרח להיפרד בגדר ולאחר מכן למלא חרוט לאמצעי 15 מ"ל עם PBS.
    4. Centrifuge התאים ב 500 g x עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר. Decant את תגובת שיקוע. חזור על לשטוף את PBS (צעדים 2.4.3–2.4.4) אם כדוריות אדומות. Resuspend תאי 1 מ"ל של CSM לפרק את צניפה, ולאחר מכן להעביר הצינור microcentrifuge שכותרתו (שלב 1.11) עבור צביעת נוגדן. לקחת דגימה µL 10 לספור תאים באמצעות מונה תא אוטומטית או hemocytometer.
      הערה: מאז כל התאים קבועים בנקודה זו, אין צורך לכלול כתם הכדאיות.
    5. Centrifuge התאים ב 500 g x עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר. וארוקן את תגובת שיקוע, עוזב את צניפה ~ 60 µL אמצעי האחסון שיורית. שמור זה גלולה על הקרח עד דגימות תנאים אחרים השלמת עיבוד.
  5. ב T = 30 דקות, ידענו שזה צינור (שלב 2.3) מכסה המנוע תרביות רקמה ולבצע את הפעולות הבאות.
    1. להוסיף 10 μL של 0.1 μg/μL R848 T6 + R848. מערבבים היטב עם פיפטה P1000.
    2. להוסיף 10 μL של 0.01 μg/μL LPS T6 + LPS. מערבבים היטב עם פיפטה P1000.
    3. להוסיף 4 μL של חלבון התחבורה מעכב (מניות ב-500 X) T6, T6 + 5R, ו- T6 + LPS (אך לא T6 + R848), לחזור הדגימות החממה עד T = 6-אייץ לערבב ביסודיות עם פיפטה P1000 כל שעתיים.
      הערה: R848 הוא אגוניסט TLR endoplasmic, ולכן דורש עיכוב זמני התוספת של החומר המדכא תחבורה חלבון כדי לאפשר גישה אל הקולטן היעד שלו.
  6. ב T = 2 h, להוסיף 4 μL של חלבון התחבורה מעכב קוקטייל (מניות ב-500 X) T6 + R848 צינור. מערבבים את כל הדגימות עם פיפטה P1000 ולחזור המדף החממה עד T = 6-אייץ '.
  7. מערבבים את הדגימות עם P1000 עוד פעם אחת ב- T = 4 שעות.
  8. ב T = 6 h, לעבד T6, T6 + LPS, T6 + R848 ו- T6 + צינורות דגימת דם 5R כפי שמתואר צעד 2.4 עבור המדגם T0.
  9. אחסן את כדורי תא בכרך CSM שיורית ב-80 מעלות צלזיוס לעבד על תאריך עתידי. לחלופין, להמשיך barcoding ונוגדן מכתים ללא אחסון.

3. ברקוד תאי דם Lysed/קבוע

  1. להפשיר את הדגימות תא lysed/קבוע מהמחסן-80 ° C לאט על הקרח; לכל היותר 20 דוגמאות ניתן שכותרתו עם ברקודים ייחודי, איחדו באמצעות מערכת זו. לדלל את המאגר פרם X barcoding 10 ב- 1:10 עם PBS; לעשות מספיק למאגר ~ 3 מ לכל דגימה.
  2. למלא אחד שוקת שאינו סטרילי של CSM ואחד עם המאגר פרם X barcoding 1. להוסיף 1 מ"ל של קרח CSM קר אל דגימות טריות המופשרים, לערבב היטב עם פיפטה, ולהעביר הצינורות בהתאמה מראש שכותרתו אשכול פוליפרופילן.
  3. לקחת דגימה μL 10 לספור תאים באמצעות מונה תא אוטומטית או hemocytometer. לנרמל את ספירת תאים ל- 1.5 – 2 x 106 תאים עבור דגימה בצינור כל אשכול: להסיר ולמחוק את עוצמת הקול של תאים עודף מעל 2 x 106 תאים.
  4. Centrifuge התאים ב- g x 600 עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר. Resuspend תאי 1 מ"ל 1 מאגר פרם X barcoding עם פיפטה רב-ערוצי, צנטריפוגה ב 600 x g עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר. תשאף את תגובת שיקוע.
  5. בשורה הצינורות אשכול על מתלה באותו סדר כמצוין על המפתח ברקוד כך המדגם תואם עם ברקוד שלה. להוסיף μL 800 1 X barcoding פרם המאגר באמצעות פיפטה רב-ערוצי כל דוגמאות בתוך הצינורות האשכול מבלי לגעת בגדר תא עם העצות פיפטה (ללא ערבוב) כדי לצמצם את איבוד תאים. להפריש על האצטבה עם הצינורות אשכול.
  6. הסר 20-פלקס Pd Barcoding ערכת צינור רצועות-20 ° C, להפשיר בטמפרטורת החדר. להוסיף 100 μL 1 X barcoding פרם המאגר, לערבב ביסודיות, להעביר μL 120 של המיקס ברקוד resuspended לתוך הדגימות תא התואם את החצוצרות שלה אשכול.
  7. לערבב ביסודיות על ידי פיפטה רב-ערוצי, שהוא אין זיהום צולב בין דוגמאות לבר-קוד באופן אינדיבידואלי. דגירה אשכול צינורות במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, כדי לאפשר את ברקודים לסמן את התאים.
  8. צנטריפוגה-g x 600 עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר. וארוקן את תגובת שיקוע ולאחר מכן resuspend ב 1 מ"ל של CSM.
  9. צנטריפוגה, resuspend ב CSM שוב כמו שלב 3.8.
    הערה: כל מדגם עכשיו תווית ברקוד ייחודי, דגימות מוכנים להיות איחדו.
  10. צנטריפוגה-g x 600 עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר, וארוקן את תגובת שיקוע. פיפטה של יחיד, משתמש הקצה אותו, להעביר את כל כדורי תא ~ 70 – 80 לאמצעי האחסון שפופרת אחת פוליסטירן שיורית μL. אין להוציא את הטיפ פיפטה; להפריש את פיפטה יחיד עם העצה הזאת.
  11. על פיפטה רב-ערוצי, עצות חדשות, להוסיף ~ 100 μL CSM כל שפופרת האשכול המקורי כדי ששחזור התא. עם הפיפטה יחיד עם קצה זה היה להפריש להעביר כל כדורי תא בכרך שיורית μL ~ 100 הצינור פוליסטירן אותו.
  12. הוסף CSM ולהשלמת הצינור פוליסטירן (~ 3 מ"ל). ספירת ולהקליט מספר הטלפון של הברקוד במאגר להגדיר. צנטריפוגה-g x 600 עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר, וארוקן את תגובת שיקוע. המשך מכתימה את הדגימות לבר-קוד באותו יום.
    הערה: זה נורמלי לצפות איבוד תאים ~ 20 – 30% של תהליך barcoding.

4. כתמים לבר-קוד Lysed/נעוצות כדוריות הדם, הכנה לניתוח Cytometry המוני כלי

הערה: כל 1 X כייל של צביעת נוגדנים (μL 1 של נוגדנים לכל 100 μL מכתים התגובה), בדרך כלל יכול להכתים את 3-4 x 106 תאים. לכן, כאשר כל דוגמאות לבר-קוד הם איחדו לתוך שפופרת אחת, חייב להיות משתנה כמות נוגדנים. אם כמות דגימות לבר-קוד 20 כדי 30 x 106 תאים, כייל נוגדנים 1 לכל X יכול להכתים 3-4 x 106 תאים, המדגם לבר-קוד רק דורש של 10 X כייל נוגדנים, בניגוד מכתים כל דגימה באופן אינדיבידואלי, אשר ידרוש כמות X 20 של נוגדנים (1 X לכל הצינור בודדים). הריכוז של הנוגדן למספר התא צריך להיות טיטרציה בקפידה עבור כל נוגדן בודדים קוקטייל (לא נדון כאן).

  1. כתם התאים באמצעות נוגדנים (טבלה של חומרים) עבור משטח אינדוקציה מכתים, ציטוקינים.
    1. להפוך ההכתמה משטח קוקטייל על-ידי חישוב סכום נוסף וחשבונאות עבור טעות pipetting (קרי, אם צביעת לבר-קוד 20, דוגמאות 2 x 106 תאים בכל מדגם, 10 X כייל נוגדנים הכתם נדרש; עבור חישובי נפח סופי, לפצות על שגיאה pipetting על ידי ביצוע של 10.5 X הסופי מכתים פתרון).
    2. להוסיף 10 X שווה של משטח מכתים לאמצעי האחסון בגדר תא לבר-קוד. כדי לצמצם את איבוד תאים, עם הטיפ אותו, לערבב, למדוד את עוצמת הקול של כתמים השטח, תא גלולה.
    3. בהתבסס על הנפח של תאים, צביעת קוקטייל, להוסיף CSM נפח מכתימים הסופי של μL 50 לכל מספר דגימות תאים (כלומר, אם הרצת סט של 20 דגימות, μL 50 X 20 = 1 מ"ל). תקופת דגירה של 30 דקות ב 4 º C. להתסיס את הדגימה כל 15 דקות כדי לקדם אפילו מכתים.
    4. במהלך הדגירה פני שטח הכתם, הכן המאגר פרם/לשטוף (טבלה של חומרים) על ידי 1:10 המדללת עם ddH המסוננות2O. הכן כרכים של mL 2 עבור permeabilization, ו- 5 מ"ל לרחצה. שמור ב 4 ° C או על קרח.
    5. להתעלות מעל פני השטח מכתים צינור עם CSM, צנטריפוגה ב g x 600 ב 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דק. תשאף את תגובת שיקוע. Resuspend המדגם לבר-קוד ב- 2 מ של 4 ° C, 1:10 דילול שיער מקורזל/שטיפת מאגר. דגירה ב 4 מעלות צלזיוס למשך 20-30 דקות permeabilize באופן מלא את התאים.
    6. צנטריפוגה ב g x 600 ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, וארוקן את תגובת שיקוע.
    7. עבור צביעת תאיים, בצע שלבים דומים מכתימים (לגבי צביעת משטח). עם זאת, להשתמש 4 ° C, 1:10 דילול שיער מקורזל/שטיפת מאגר במקום CSM לעשות סה כ מכתימה את אמצעי האחסון כך התאים נשארים בסביבה permeabilizing ברחבי ההכתמה תאיים.
    8. מוסיפים נוגדן תאיים קוקטייל אל פני השטח צבעונית permeabilized תא גלולה (צעדים 4.1.2–4.1.17). שהכמות הכוללת צביעת לאמצעי האחסון μL 50 לכל מספר דגימות תאים. תקופת דגירה של 60 דקות ב 4 º C. להתסיס את הדגימה כל 15 דקות כדי להבטיח אפילו מכתים.
    9. במהלך ההכתמה תאיים, להכין את הפתרון intercalator: μL 900 של PBS מסוננות + μL 100% 16 מסוננים מחברים (הריכוז הסופי של 1.6% PFA) + 0.2 μL של 500 אום של צבע intercalator (טבלה של חומרים).
    10. בנוסף התא גלולה + קוקטייל עם 1:10 קר תאיים נוגדן מאגר פרם/שטיפה.
    11. צנטריפוגה ב g x 600 ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ולאחר וארוקן את תגובת שיקוע. בנוסף ברכבת התחתית מכתימים עם CSM. לספור ולהקליט את המספר הסלולרי. צנטריפוגה ב g x 600 ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ולאחר וארוקן את תגובת שיקוע. Resuspend תאי 1 מ"ל של פתרון intercalator מהשלב 4.9. תקופת דגירה של פחות 20 דקות בטמפרטורת החדר במשך העיבור מלא, או למשך הלילה ב 4 ° C (דוגמאות בפתרון intercalator יכול להישאר ב 4 ° C עד שבוע לפני הפעלת אותם על הכלי cytometry המוני).
  2. להכין את התאים המכשיר cytometry המוני.
    1. בנוסף את הצינור עם 3 מ"ל של ddH המסוננות2O, צנטריפוגה ב g 600 x דקות 5-4 מעלות צלזיוס. Resuspend התאים 3 מ"ל של ddH המסוננות2א תעבירי ההשעייה דרך מסנן 100 μm כדי להסיר את כל פסולת או אגרגטים כי פוטנציאלי יכול לסתום את המכשיר cytometry המוני.
    2. לספור והקלטה של סינון שלאחר מספר תאים. צנטריפוגה ב 600 x g עבור 5 דקות ב 4 ° C
  3. להכין את הפתרון חרוז כיול (טבלה של חומרים) על ידי דילול זה 1:10 ddH המסוננות2O.
  4. Resuspend את מוכתם בתאי האחסון הנדרש של 1:10 מדולל כיול פתרון חרוז להשגת ריכוז תא ~ 1 x 106 תאים למ"ל.
    הערה: עבור CyTOF1 ב µL 45/דקה, אופטימום המומלץ הוא 5 x 105 תאים למ"ל; עבור Helios ב 30 µL/דקה, 7.5 x 105 תאים למ"ל.
  5. להמשיך להפעיל את הדגימה על מכשיר cytometry המונית9.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

איור 1 מדגים את זרימת העבודה עבור הגירוי ומובילים עיבוד הדגימות דם היקפיים, לרבות הקצאה של דם מדגם aliquots, העיתוי של התוספת של גירוי סוכנים, חלבון מעכב קוקטייל, דגירה פעמים עד פירוק תאי הדם האדומים (RBC) של קיבעון. הבחירה של סוכנים מגרה תלויות המסלולים איתות, ציטוקינים המיועדים להערכה. לדוגמה, בפרוטוקול המתוארים כאן, אגוניסטים TLR משמשים כדי להעריך מולדת מנגנוני חישה מערכת החיסון סוגי תאים מרובים. נציג חוץ-תאית (LPS, אגוניסט TLR4), endoplasmic (R848, TLR7/8...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן נתאר את הרומן, תא בודד, פרוטיאומיה מבנית גישה בו זמנית להעריך מספר סוגי תאים חיסוניים, לזהות חצרו של המטופל הספציפי "פתוגניים" פלזמה דם היקפיים במחזור גורמים לפליטת ציטוקינים שונים שלהם. שיטה זו מעסיקה דם היקפיים ' הרכב אנליטית, וכן cytometry המונית של הכלי על ההערכה של מערכת החיסון התאית חריגות פנוטיפי ופונקציונליים. השיטה בקלות החלים על מחקרים של אדם ועכברים -21, והוא תואם עם אנליזה פונקציונלית חיסוניים אחרים, כגון גילוי מומים איתות14.

המשת...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ברצוננו להודות איימי ששחה-ברנרד שלה קלט רוחני והערות מועילות. עבודה זו נתמכה על ידי וארינג Boettcher קרן וב פרס המחקר הביו-רפואי ופרס שהמספר K23-1K23AR070897 מ- NIH אלנה W.Y. Hsieh. היא גם נתמך על ידי פרס מספר K12-HD000850 מן המכון הלאומי יוניס קנדי שרייבר בריאות הילד ואת ההתפתחות האנושית קרן ולוסיל פקארד בריאות לילדים, סטנפורד CTSA UL1 TR001085 של מחקר בריאות הילד אוניברסיטת המכון של סטנפורד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
RuxolitinibSanta CruzSC-364729Aמלאי Conc: 10 מ"מ; קונק סופי: 5 μ M
R848Invivogentlrl-r848-5מלאי Conc: 1 μ g/μ L; קונק סופי: 1 μ g/mL
LPS-EKInvivogentlrl-eklpsמלאי Conc: 1 μ g/μ L; קונק סופי: 0.1 μ g/mL
סטרילי PBSLonza17-516F
Lyse/Fix BufferBD biosciences558049מלאי Conc: 5X; Final Conc: 1X (לדלל ב-ddH2O)
BD Phosflow perm/wash buffer IBD biosciences557885מלאי Conc: 10X; Final Conc: 1:10 (דילול ב-ddH2O)
RPMIGibco21870-076
נתרן אזיד (NaN3)Sigma-AldrichS-8032Stock Conc: >99.9%; Final Conc: 0.0002
מעכב הובלת חלבון (PTI)eBiosciences00-4980-93Stock Conc: 500X; Conc סופי: 1X
DNA IntercalatorFluidigm201192Bמלאי Conc: 500 μ M; קונק סופי: 0.1 μ
M Cell Staining Media (CSM)PBS + 0.5% BSA, 0.02% NaN3
MaxPar ברקוד סלסול מאגרנוזלי201057מלאי Conc: 10X; קונס סופי: 1X
20-plex Pd ברקוד סטFluidigmS0014מלאי Conc: n/a; Conc סופי: n/a
EQ TM חרוזי כיול ארבעה אלמנטיםFluidigm201078Stock Conc: 10X; Conc סופי: 1X
16% תמיסת פורמלדהיד ללא MeOHThermo28908Stock Conc: 16% (w/v); Final Conc: 1.6% (w/v)
צינורות פוליסטירן תחתונים עגולים סטרילייםVWR60818-496Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a
צינורות אשכול פוליפרופילןLight LabsA-9001מלאי Conc: n/a; Final Conc: n/a
מכשיר Helios CyTOFFluidigmHeliosכל הפתרונות שישמשו בניתוח CyTOF צריכים להיות נקיים מזיהום מתכת. ddH2O משמש בהכנת כל תמיסות צריכות להיות בעלות התנגדות של לפחות 18.0 MΩ. ס"מ. יש לאחסן ddH2O וכל פתרון בהכנה עצמית בבקבוקי פלסטיק או זכוכית חדשים שמעולם לא עברו חיטוי.
nameCompanyCatalog NumberComments
נוגדנים המשמשים לציטומטריית מסה
סמני פני השטח
CD1cBiolegendL161מסה: 161
CD3BDUCHT1מסה: 144
CD4BiolegendSK3מסה: 174
CD7BDM-T701מסה: 149
CD8BiolegendSK1מסה: 142
CD11bFluidigmICRF44מסה: 209
CD11cBDB-ly6מסה: 152
CD15BDHI98מסה: 115
CD14BiolegendM5E2מסה: 154
CD16eBioscience/ThermoB73.1מסה: 165
CD19סנטה קרוזSJ25C1מסה: 163
CD21BiolegendBu32מסה: 141
CD27BDL128מסה: 155
CD38FluidigmHIT2מסה: 172
CD45 סה"כBiolegendHI30מסה: 89
CD45RABiolegendHI100מסה: 153
CD56MiltenyiREA196מסה: 168
CD66BDB1.1/CD66מסה: 113
CD86FluidigmIT2.2מסה: 150
CD123Fluidigm6H6מסה: 143
CD278/ICOSBiolegendC398.4Aמסה: 156
CD179/PD1BiolegendEH12.2H7מסה: 162
IgDBiolegendIA6-2מסה: 146
IgMBiolegendMHM-88מסה: 151
CXCR5BDRF8B2מסה: 173
HLADRBiolegendL243מסה: 167
<חזק>ציטוקינים
IL-1&אלפא;Biolegend364-3B3-14מסה: 147
IL-1βביולג'נד H1b-98מסה: 169
IL-1RAסנטה קרוז AS17מסה: 157
IL-6BiolegendMQ2-13A5מסה: 164
IL-8BDE8N1מסה: 160
IL-12/IL-23p40Biolegend C8.6משקל: 171
IL-17ABiolegend BL168מסה: 148
IL23p19eBioscience/Thermo23dcdpמשקל: 176
MIP1βBDD21-1351מסה: 158
MCP1BD5D3-F7מסה: 170
IFN αMiltenyi LT27:295מסה: 175
IFNγביולג'נד4S. B3מסה: 165
PTENBDA2B1מסה: 159
TNFαBiolegendMab11מסה: 166
<חזק>הערה: אם היצרן מצוין כ-Fluidigm, נוגדן זה נרכש מ-Fluidigm עם מתכת מצומדת מראש. אם היצרן מצוין כאחר מלבד Fluidigm, נוגדן זה צומד לעצמו באמצעות תיוג MaxPar Multi-Metal  ערכה (Fluidigm Cat: 201300) לפי פרוטוקול היצרן. 

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Walsh, S. J., Rau, L. M. Autoimmune diseases: a leading cause of death among young and middle-aged women in the United States. American journal of public health. 90 (9), 1463-1466 (2000).
  2. Mak, A., Cheung, M. W. -L., Chiew, H. J., Liu, Y., Ho, R. C. -M. Global trend of survival and damage of systemic lupus erythematosus: meta-analysis and meta-regression of observational studies from the 1950s to 2000s. Seminars in arthritis and rheumatism. 41 (6), 830-839 (2012).
  3. Kaul, A., Gordon, C., et al. Systemic lupus erythematosus. Nature reviews. Disease primers. 2, 16039(2016).
  4. Annunziato, F., Romagnani, S. Heterogeneity of human effector CD4+ T cells. Arthritis Research & Therapy. 11 (6), 257(2009).
  5. Peck, A., Mellins, E. D. Plasticity of T-cell phenotype and function: the T helper type 17 example. Immunology. 129 (2), 147-153 (2010).
  6. Basso, A. S., Cheroutre, H., Mucida, D. More stories on Th17 cells. Cell research. 19 (4), 399-411 (2009).
  7. Ornatsky, O., Bandura, D., Baranov, V., Nitz, M., Winnik, M. A., Tanner, S. Highly multiparametric analysis by mass cytometry. Journal of Immunological Methods. 361 (1-2), 1-20 (2010).
  8. Ornatsky, O., Baranov, V. I., Bandura, D. R., Tanner, S. D., Dick, J. Multiple cellular antigen detection by ICP-MS. Journal of Immunological Methods. 308 (1-2), 68-76 (2006).
  9. Bendall, S. C., Simonds, E. F., et al. Single-Cell Mass Cytometry of Differential Immune and Drug Responses Across a Human Hematopoietic Continuum. Science. 332 (6030), 687-696 (2011).
  10. Bandura, D. R., Baranov, V. I., et al. Mass Cytometry: Technique for Real Time Single Cell Multitarget Immunoassay Based on Inductively Coupled Plasma Time-of-Flight Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 81 (16), 6813-6822 (2009).
  11. Leipold, M. D., Maecker, H. T. Mass cytometry: protocol for daily tuning and running cell samples on a CyTOF mass cytometer. Journal of visualized experiments : JoVE. (69), e4398(2012).
  12. McCarthy, R. L., Duncan, A. D., Barton, M. C. Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis. Journal of visualized experiments : JoVE. (122), (2017).
  13. Rahman, A., Isenberg, D. A. Systemic lupus erythematosus. The New England journal of medicine. 358 (9), 929-939 (2008).
  14. O'Gorman, W. E., Hsieh, E. W. Y., et al. Single-cell systems-level analysis of human Toll-like receptor activation defines a chemokine signature in patients with systemic lupus erythematosus. The Journal of allergy and clinical immunology. 136 (5), 1326-1336 (2015).
  15. O'Gorman, W. E., Kong, D. S., et al. Mass cytometry identifies a distinct monocyte cytokine signature shared by clinically heterogeneous pediatric SLE patients. Journal of Autoimmunity. 81, 74-89 (2017).
  16. Simonds, E. F., Bendall, S. C., et al. Extracting a cellular hierarchy from high-dimensional cytometry data with SPADE. Nature Biotechnology. , 1-8 (2011).
  17. Amir, E. -A. D., Davis, K. L., et al. viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia. Nature Biotechnology. 31 (6), 545-552 (2013).
  18. Bruggner, R. V., Bodenmiller, B., Dill, D. L., Tibshirani, R. J., Nolan, G. P. Automated identification of stratifying signatures in cellular subpopulations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (26), E2770-E2777 (2014).
  19. Levine, J. H., Simonds, E. F., et al. Data-Driven Phenotypic Dissection of AML Reveals Progenitor-like Cells that Correlate with Prognosis. Cell. 162 (1), 184-197 (2015).
  20. Samusik, N., Good, Z., Spitzer, M. H., Davis, K. L., Nolan, G. P. Automated mapping of phenotype space with single-cell data. Nature Publishing Group. 13 (6), 493-496 (2016).
  21. Spitzer, M. H., Gherardini, P. F., et al. IMMUNOLOGY. An interactive reference framework for modeling a dynamic immune system. Science. 349 (6244), 1259425(2015).
  22. Fienberg, H. G., Simonds, E. F., Fantl, W. J., Nolan, G. P., Bodenmiller, B. A platinum-based covalent viability reagent for single-cell mass cytometry. Cytometry Part A. 81 (6), 467-475 (2012).
  23. Jansen, K., Blimkie, D., et al. Polychromatic flow cytometric high-throughput assay to analyze the innate immune response to Toll-like receptor stimulation. Journal of Immunological Methods. 336 (2), 183-192 (2008).
  24. Zunder, E. R., Finck, R., et al. Palladium-based mass tag cell barcoding with a doublet-filtering scheme and single-cell deconvolution algorithm. Nature Protocols. 10 (2), 316-333 (2015).
  25. Lai, L., Ong, R., Li, J., Albani, S. A CD45-based barcoding approach to multiplex mass-cytometry (CyTOF). Cytometry Part A. , (2015).
  26. Mei, H. E., Leipold, M. D., Schulz, A. R., Chester, C., Maecker, H. T. Barcoding of live human peripheral blood mononuclear cells for multiplexed mass cytometry. The Journal of Immunology. 194 (4), 2022-2031 (2015).
  27. Finck, R., Simonds, E. F., et al. Normalization of mass cytometry data with bead standards. Cytometry Part A. 83 (5), 483-494 (2013).
  28. Takahashi, C., Au-Yeung, A., et al. Mass cytometry panel optimization through the designed distribution of signal interference. Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 91 (1), 39-47 (2017).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Mass CytometryPeripheral BloodCytokine ProductionImmunophenotype AnalysisAutoimmune DiseaseSingle cell AnalysisBlood StimulationBarcoding ProtocolCell Surface MarkersProtein Transport Inhibitor

מאמרים קשורים