Method Article

ניתוח מתא בודד של Immunophenotype וייצור ציטוקין בדם כל הפריפריה באמצעות Cytometry המונית

DOI:

10.3791/57780

⸱

June 26th, 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Immunology and Microbiology, University of Colorado School of Medicine, 2OMNI Biomarkers, Development Sciences, Genentech, 3Department of Pediatrics, Division of Allergy and Immunology, University of Colorado School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן נתאר בגישה פרוטיאומיה מבנית תא בודד כדי להעריך את החיסון פנוטיפי ו פונקציונלי (ציטוקינים תאיים אינדוקציה) שינויים בדגימות דם היקפיים, נותחו באמצעות cytometry המוני.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ציטוקינים לשחק תפקיד מרכזי בפתוגנזה של מחלות אוטואימוניות. לפיכך, מדידת רמות ציטוקינים כבר המוקד של מחקרים רבים בניסיון להבין את המנגנונים מדויק להוביל להתמוטטות של self-tolerance ושל הבאים מחלת חיסון עצמי. הגישות כה התבססו על המחקר של היבט מסוים אחד של המערכת החיסונית (יחיד או מספר סוגי תאים או ציטוקינים), ואת לא מציעים הערכה גלובלית של מחלה אוטואימונית מורכבת. בעוד מחקרים מבוססי סרה החולה היה להרשות לעצמו תובנות חשובות מחלת חיסון עצמי, הם אינם מספקים מקור סלולרית מסוימת ציטוקינים dysregulated זוהה. גישה בתא יחיד כוללת כדי להעריך את ייצור ציטוקינים קבוצות משנה מרובות תאים חיסוניים, בהקשר של "מהותי" פלזמה החולה הספציפי במחזור גורמים, מתואר כאן. גישה זו מאפשרת ניטור של פנוטיפ המערכת החיסונית החולה הספציפי (סמני פני השטח) פונקציה (ציטוקינים), או מקורי שלו "מהותי פתוגניים" מחלת המדינה, או הנוכחות של סוכני טיפולית (vivo בתוך או ex-vivo).

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחלות אוטואימוניות הן הגורם העיקרי התחלואה והתמותה המשפיעים על 3-8% מכלל האוכלוסייה. בארצות הברית, הפרעות אוטואימוניות הם בין הגורמים המובילים. למוות אצל נשים בגיל העמידה, צעיר (גילאי < 65 שנה)1,2. הפרעות אוטואימוניות מאופיינים מצגת הטרוגניות קלינית ותהליכים אימונולוגי כבסיס מגוונות. הספקטרום של הטרוגניות מיוצגת היטב על פני הפרעות שונות, כגון משותפת במעורבות דלקת מפרקים שגרונית (RA), מחלה נוירולוגית ב טרשת נפוצה (MS). עם זאת, רמה זו של הטרוגניות היא גם ביטוי תוך הפרעה יחיד, כגון זאבת אדמנתית מערכתית (מירה כהן): חלק מהחולים יכול להציג עם הפתולוגיה הכליה, בעוד שאחרים סובלים מעורבות המטולוגיות או משותפת

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי קולורדו מרובים מוסדיים סקירה לוח (COMIRB) של מאוניברסיטת קולורדו. כל ההליכים המתוארים להלן צריכה להתבצע בשכונה תרביות רקמה עקר אלא אם צוין אחרת, עם טיפים פיפטה מסוננים, ומסונן ריאגנטים כל.

1. הכנה של ריאגנטים לעיבוד דם היקפיים

  1. הכן ruxolitinib מניות aliquots (10-15 μL/מבחנה לשימוש יחיד)-10 מ מ על ידי דילול הכימית lyophilized ב דימתיל סולפוקסיד לפי הוראות היצרן (החנות ב-80 מעלות צלזיוס). שמור דימתיל סולפוקסיד ריכוז כל מבחני כולל פקדי unstimulated להלן 0.2% (vol/כרך).
  2. הכנת R848 (resiquimod) מניות aliquots (10-15 μL/מבחנה לשימוש יחיד) ב 1 μg/μL על ידי דילול הכימית lyophilized במים סטריליים....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

איור 1 מדגים את זרימת העבודה עבור הגירוי ומובילים עיבוד הדגימות דם היקפיים, לרבות הקצאה של דם מדגם aliquots, העיתוי של התוספת של גירוי סוכנים, חלבון מעכב קוקטייל, דגירה פעמים עד פירוק תאי הדם האדומים (RBC) של קיבעון. הבחירה של סוכנים מגרה תלויות המסלולים איתות, ציטוקינים המיועדים להערכה. לדוגמה, בפרוטוקול המתוארים כאן, אגוניסטים TLR משמשים כדי להעריך מולדת מנגנוני חישה מערכת החיסון סוגי תאים מרובים. נציג חוץ-תאית (LPS, אגוניסט TLR4), endoplasmic (R848, TLR7/8.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן נתאר את הרומן, תא בודד, פרוטיאומיה מבנית גישה בו זמנית להעריך מספר סוגי תאים חיסוניים, לזהות חצרו של המטופל הספציפי "פתוגניים" פלזמה דם היקפיים במחזור גורמים לפליטת ציטוקינים שונים שלהם. שיטה זו מעסיקה דם היקפיים ' הרכב אנליטית, וכן cytometry המונית של הכלי על ההערכה של מערכת החיסון התאית חריגות פנוטיפי ופונקציונליים. השיטה בקלות החלים על מחקרים של אדם ועכברים -21, והוא תואם עם אנליזה פונקציונלית חיסוניים אחרים, כגון גילוי מומים איתות14.

המשת.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ברצוננו להודות איימי ששחה-ברנרד שלה קלט רוחני והערות מועילות. עבודה זו נתמכה על ידי וארינג Boettcher קרן וב פרס המחקר הביו-רפואי ופרס שהמספר K23-1K23AR070897 מ- NIH אלנה W.Y. Hsieh. היא גם נתמך על ידי פרס מספר K12-HD000850 מן המכון הלאומי יוניס קנדי שרייבר בריאות הילד ואת ההתפתחות האנושית קרן ולוסיל פקארד בריאות לילדים, סטנפורד CTSA UL1 TR001085 של מחקר בריאות הילד אוניברסיטת המכון של סטנפורד.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
RuxolitinibSanta CruzSC-364729Aמלאי Conc: 10 מ"מ; קונק סופי: 5 μ M
R848Invivogentlrl-r848-5מלאי Conc: 1 μ g/μ L; קונק סופי: 1 μ g/mL
LPS-EKInvivogentlrl-eklpsמלאי Conc: 1 μ g/μ L; קונק סופי: 0.1 μ g/mL
סטרילי PBSLonza17-516F
Lyse/Fix BufferBD biosciences558049מלאי Conc: 5X; Final Conc: 1X (לדלל ב-ddH2O)
BD Phosflow perm/wash buffer IBD biosciences557885מלאי Conc: 10X; Final Conc: 1:10 (דילול ב-ddH2O)
RPMIGibco21870-076
נתרן אזיד (NaN3)Sigma-AldrichS-8032Stock Conc: >99.9%; Final Conc: 0.0002
מעכב הובלת חלבון (PTI)eBiosciences00-4980-93Stock Conc: 500X; Conc סופי: 1X
DNA IntercalatorFluidigm201192Bמלאי Conc: 500 μ M; קונק סופי: 0.1 μ
M Cell Staining Media (CSM)PBS + 0.5% BSA, 0.02% NaN3
MaxPar ברקוד סלסול מאגרנוזלי201057מלאי Conc: 10X; קונס סופי: 1X
20-plex Pd ברקוד סטFluidigmS0014מלאי Conc: n/a; Conc סופי: n/a
EQ TM חרוזי כיול ארבעה אלמנטיםFluidigm201078Stock Conc: 10X; Conc סופי: 1X
16% תמיסת פורמלדהיד ללא MeOHThermo28908Stock Conc: 16% (w/v); Final Conc: 1.6% (w/v)
צינורות פוליסטירן תחתונים עגולים סטרילייםVWR60818-496Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a
צינורות אשכול פוליפרופילןLight LabsA-9001מלאי Conc: n/a; Final Conc: n/a
מכשיר Helios CyTOFFluidigmHeliosכל הפתרונות שישמשו בניתוח CyTOF צריכים להיות נקיים מזיהום מתכת. ddH2O משמש בהכנת כל תמיסות צריכות להיות בעלות התנגדות של לפחות 18.0 MΩ. ס"מ. יש לאחסן ddH2O וכל פתרון בהכנה עצמית בבקבוקי פלסטיק או זכוכית חדשים שמעולם לא עברו חיטוי.
nameCompanyCatalog NumberComments
נוגדנים המשמשים לציטומטריית מסה
סמני פני השטח
CD1cBiolegendL161מסה: 161
CD3BDUCHT1מסה: 144
CD4BiolegendSK3מסה: 174
CD7BDM-T701מסה: 149
CD8BiolegendSK1מסה: 142
CD11bFluidigmICRF44מסה: 209
CD11cBDB-ly6מסה: 152
CD15BDHI98מסה: 115
CD14BiolegendM5E2מסה: 154
CD16eBioscience/ThermoB73.1מסה: 165
CD19סנטה קרוזSJ25C1מסה: 163
CD21BiolegendBu32מסה: 141
CD27BDL128מסה: 155
CD38FluidigmHIT2מסה: 172
CD45 סה"כBiolegendHI30מסה: 89
CD45RABiolegendHI100מסה: 153
CD56MiltenyiREA196מסה: 168
CD66BDB1.1/CD66מסה: 113
CD86FluidigmIT2.2מסה: 150
CD123Fluidigm6H6מסה: 143
CD278/ICOSBiolegendC398.4Aמסה: 156
CD179/PD1BiolegendEH12.2H7מסה: 162
IgDBiolegendIA6-2מסה: 146
IgMBiolegendMHM-88מסה: 151
CXCR5BDRF8B2מסה: 173
HLADRBiolegendL243מסה: 167
<חזק>ציטוקינים
IL-1&אלפא;Biolegend364-3B3-14מסה: 147
IL-1βביולג'נד H1b-98מסה: 169
IL-1RAסנטה קרוז AS17מסה: 157
IL-6BiolegendMQ2-13A5מסה: 164
IL-8BDE8N1מסה: 160
IL-12/IL-23p40Biolegend C8.6משקל: 171
IL-17ABiolegend BL168מסה: 148
IL23p19eBioscience/Thermo23dcdpמשקל: 176
MIP1βBDD21-1351מסה: 158
MCP1BD5D3-F7מסה: 170
IFN αMiltenyi LT27:295מסה: 175
IFNγביולג'נד4S. B3מסה: 165
PTENBDA2B1מסה: 159
TNFαBiolegendMab11מסה: 166
<חזק>הערה: אם היצרן מצוין כ-Fluidigm, נוגדן זה נרכש מ-Fluidigm עם מתכת מצומדת מראש. אם היצרן מצוין כאחר מלבד Fluidigm, נוגדן זה צומד לעצמו באמצעות תיוג MaxPar Multi-Metal  ערכה (Fluidigm Cat: 201300) לפי פרוטוקול היצרן. 

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Walsh, S. J., Rau, L. M. Autoimmune diseases: a leading cause of death among young and middle-aged women in the United States. American journal of public health. 90 (9), 1463-1466 (2000).
  2. Mak, A., Cheung, M. W. -L., Chiew, H. J., Liu, Y., Ho, R. C. -M.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mass CytometryPeripheral BloodCytokine ProductionImmunophenotype AnalysisAutoimmune DiseaseSingle cell AnalysisBlood StimulationBarcoding ProtocolCell Surface MarkersProtein Transport Inhibitor

Related Articles