TreadWheel: מרווח אימון פרוטוקול בעדינות המושרה תרגיל דרוזופילה melanogaster

Summary

TreadWheel משתמשת תנועה סיבובית לזירוז תרגיל למבוגרים דרוזופילה melanogaster בעדינות על ידי ניצול geotaxis של הזבובים מולדת, שלילי. היא מאפשרת ניתוח של אינטראקציות בין פעילות גופנית לבין גורמים, כגון גנוטיפ, סקס, תזונה, ועל השפעתם על מבחני מולקולרית, פיזיולוגיים להערכת הבריאות המטבולית.

Abstract

השכיחות של מחלות מטבוליות מורכבת גדל עקב מעבר נרחבת לקראת אורח חיים של צריכת הקלוריות מוגבר, רמות פעילות הוריד. מחלות multifactorial אלו נובעים משילוב של גורמים גנטיים, סביבתיים התנהגותית. מחלה מורכבת אחד כזה הוא תסמונת מטבולית (גרורות), אשר יש מקבץ של הפרעות מטבוליות, כולל יתר לחץ דם, היפרגליקמיה, השמנה של הבטן. תרגיל התערבות תזונתיים העיקרי הטיפולים המומלץ על ידי רופאים כדי להמתיק השמנת יתר ומחלות מטבוליות העוקבים שלה בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. תרגיל התערבות, בפרט אירובי מרווח אימון, מעורר שינויים חיוביים גורמי הסיכון הנפוצים עבור סוכרת סוג 2 (T2DM), מחלות לב וכלי דם (CVD) תנאים אחרים. בשטף של ראיות המתאר את התרגיל האפקט הטיפולי יש על בריאות מטבולית, הקמת מערכת מודלים להתאמן באווירה מבוקרת מספק כלי חשוב להערכת ההשפעות של פעילות גופנית בהקשר ניסיוני. דרוזופילה melanogaster הוא כלי נהדר עבור חוקרים את השינויים הפיזיולוגיים ומולקולרית שנוצרו כתוצאה מהתערבות תרגיל. הזבובים לכלבים קצר ויש מנגנונים דומים של חילוף חומרים מזינים לעומת בני אדם. כדי ליצור תרגיל דרוזופילה, פיתחנו מכונה בשם TreadWheel, אשר מנצל נטייה של הזבוב מולדת, שלילי geotaxis לזירוז בעדינות טיפוס. דבר זה מאפשר לחוקרים לבצע ניסויים על קוהורטות גדולות של הזבובים מגוונת מבחינה גנטית כדי להבין טוב יותר את האינטראקציות גנוטיפ-מאת-הסביבה שבבסיס את ההשפעות של פעילות גופנית על בריאות מטבולית.

Introduction

ילדות והשמנה למבוגרים גדלים מגיפות התרבויות צורכים תזונה קלורי גבוה, בבטלה לתקופות ממושכות של זמן, אשר יכול להוביל השלכות לטווח ארוך חמורות, לרבות תנגודת לאינסולין, דלקת כרונית, דלקת מפרקים ניוונית ^{1 , 2 , 3 , 4}. השכיחות של הפרעות אלה ממשיך לעלות בשל חוסר איזון הגוברת של צריכת הקלוריות וההוצאות מיוחסות הצריכה גבוהות של שומנים, סוכרים, בעיקר ולנהל אורח חיים⁵. בהתאמה, חוסר איזון אנרגיה הוביל עלייה במקרים של סוכרת סוג 2 (T2DM), מחלות לב וכלי דם (CVD)⁵. אנשים נמצאים בסיכון גבוה יותר לפתח הפרעות שני אם הם אובחנו עם הפרעה תסמונת מטבולית (גרורות), אשר התסמינים כוללים השמנה של הבטן, dyslipidemia². המטס מעוצב על ידי מורכבות האינטראקציות בין גנוטיפ וגורמים סביבתיים שונים, כגון דיאטה ופעילות גופנית⁶. לכן, כדי להשיג הבנה מלאה של המנגנון הבסיסי של מחלה מורכבת זו, כל הגורמים הללו יש לשקול.

כאשר מדובר במאבק נגד המטס, הרופאים ממליצים קודם שעברו שינויים באורח החיים הכוללות אכילה תזונה בריאה, מאוזנת, פעילות גופנית-^2,-^7,-⁸. מאז תרופות יעילות מוגבלת, ולא ניתוח מעקף קיבה יקר ומצריך מעקב רפואי לכל החיים, תרופתי וכירורגי התערבות זו מומלצת רק במקרים חמורים ולא רק בשילוב עם אלה שינויים באורח החיים^{3 7, ,8}. בעוד התערבויות באורח החיים, כגון פעילות גופנית ודיאטה, ניתן לייצר ולשמור על המטרות ארוכות הטווח של אובדן משקל, או לא אלה צעדים מתקנת ניתן באופן מלא להפחיתם ההשפעות השליליות הקשורות המטס צריך המשך מחקר^{7, 8}.

העכבר הדגמים השתמשו כדי לבחון את ההשפעה של פעילות גופנית על מחלות מטבוליות במשך שנים; אולם, כניסתה של תרגיל לטוס מחקר על הגרורות הוא יחסית לאחרונה העשייה^9,10,11,12. זבובים לספק את הרכב המושלם ללמוד התעמלות בסביבה מעבדתית מבוקרת, מאז הם בקלות הם מניפולציה, יש אורך חיים קצר, הם זולים לשמור על, ואין מסלולים מטבוליים הקשורה לאנרגיה מאוד נשמרים בין דרוזופילה בני¹³. הגנום melanogaster ד מאופיינים היטב, ויש שפע של כלים גנטיקה זמין לשימוש ב דרוזופילה שיכול לספק תובנה שונים אחרים, אינטראקציות גנוטיפ-מאת-הסביבה יכול לווסת השפעת פעילות גופנית על בריאות organismal¹⁴.

שיטות הנוכחי של פעילות גופנית דרוזופילה להפעיל את הנטייה geotaxis מולדת, שלילי של הזבוב, האינסטינקט התנהגותית לטפס כלפי מעלה, כדי לעורר טיפוס אצל מבוגרים בתוך שלהם מתחמים^11,12,15 . מגדל כוח, שיטה אחת כדי לעורר פעילות גופנית בזבובים, באופן שיטתי מעלה מתחמים לטוס אנכית ומוריד ואז אותם בחזרה אל פני השטח ספסל, יעיל דפיקות הזבובים לתחתית המבחנה, ובכך גרימת geotaxis שלילי האינסטינקטיבית שלהם ^{12 , 16}. ניסויים שנערכו באמצעות מכונה זו הראו כי פעילות גופנית היא גורם מגן מפני מחלות רבות הקשורות לגיל, כולל CVD ו- T2DM, ומקדם את הזדקנות בריאה^12,17,18 . באופן ספציפי, הם הראו כי פעילות גופנית יכולה להפחית את התחלתה של ירידה ניידות הקשורות לגיל זבובים לשפר מרובות הקשורות לגיל סימפטומים, כמו הלב ביצועים, להדגיש תגובה^17,18. עם זאת, שליטה זבובים מעולם לא הניח על המגדל הראה טיפוס ציונים גבוהים יותר מאשר אלה חווים את המכונה, רומז שבכוח הטיפות חוזרות עשויים להיות ופצעו את הזבובים ומשפיע ניידות¹². הדבר מצביע על כי שיטה חלופית של גרימת פעילות מצומצמת יותר, ימנע גרימת טראומה פיזית תהיה שיטה שימושית, משלימים פרוטוקול מגדל כוח¹⁶.

לזירוז בעדינות תרגיל דרוזופילה, פיתחנו מכונת תרגיל שנקרא את TreadWheel (איור 1). TreadWheel של (מעתה ואילך באופן מקוצר כ- TW) תנועה סיבובית מעורר נטייה מולדת, שלילי geotaxis הזבובים על ידי כל הזמן הגדרה מחדש בראש כוח הכבידה הבקבוקונים, אשר, בתורו, מעוררת טיפוס עם הזבובים. בניגוד לשיטות אחרות, תנועת הסיבוב TW הוא מטבעו עדין, אשר תצמצם את מספר לחצים נוספים אשר עשויים להיווצר, להשפיע על התוצאות. לפיכך, המכונה מספק את האמצעים לזירוז תרגיל במספרים גדולים של הזבובים ללא גרימת לחץ, אשר יאפשר לחוקרים לחקור את ההשפעות של פעילות גופנית על בריאות מטבולית (איור 2), הזדקנות, שינה רבים אחרים נושאים¹¹.

השיטה שלנו עוקב אחר של ההופכי כפירמידה, פרוטוקול אימונים מרווח, אשר במידה רבה משלבת היבטים של אירובי מרווח אימון (AIT) עם קצת התמדה תרגיל אימונים. המשטר AIT סטנדרטית היא שונה ב פרוטוקול זה כדי להגדיל בהדרגה את משך כל מרווח במשך חמישה ימים כדי לקדם את הסיבולת. AIT כבר יעילה במיוחד במניעת המטס ביחס שיטות התערבות אחרות, היה יעיל יותר היפוך של תסמונת מטבולית גורמי סיכון מאשר פעילות גופנית מתונה רציף^19,20. עם זאת, חיסרון של TW ביחס למגדל כוח היא זבובים habituate מהר יותר את התנועה מסתובב, ובכך וריאציה של נטייה מולדת habituate בין הזבובים יכול לסבך את הפרשנות של היתרונות של פעילות גופנית. ¹¹ פתרון אלגנטי על מגבלה זו מתוארת על ידי וואטאנאבה, החידה¹⁵ שלהם משלימים סעיף²¹.

Protocol

1. TreadWheel ההתקנה ותפעול

הערה: ראה משלימה איור 1 עבור תוכנית המתאר TW תרגיל מכונות הבנייה. החלקים הדרושים מפורטים בטבלה של חומרים. הביטויים "TW", "TreadWheel", "תרגיל מכונה" ו- "מכונה" משמשים לסירוגין לאורך כל הפרוטוקול.

1. כיול מנוע באמצעות מתג ההפעלה כך תקופה מלאה הסיבוב הוא 15 (4 סל ד). כיילו במהירות סיבוב המכונה לפני הצבת בקבוקונים לעוף לתוך מלחציים מאובטח שמצורף סיבוב הזרועות.
   1. להתאים את מהירות באמצעות סטופר רגיל ואובייקט משותק באופן זמני המחובר למכונה, כגון מכחול קטנות מודבק למכסה מנוע עם המברשת רק נגיעה אחת של הסוגריים מסתובב. בשעה את המספר של סיבובים בדקה אחת באמצעות האובייקט משותק כנקודת התייחסות ולהתאים במהירות על מנת להשיג 15 s המסתובבת תקופה (4 סל ד).

2. לטוס אוסף ותחזוקה

הערה: כל הזבובים נשמרים בחממה 25 ° C עם 50% לחות, מחזור/כהה 12 שעות בין מניפולציות benchtop המתוארים להלן. ניזונים הזבובים דיאטה מעבדה קמח תירס סטנדרטי-מולסה אלא אם נכתב אחרת.

1. להתכונן צ'יימברס הנחת גנוטיפ כל עניין באמצעות פלטות אגר מיץ תפוחים, טיפת שמרים להדביק לכל צלחת, עוז 6 בקבוקי פלסטיק לאסוף ביצים אשר יבקעו לזחלים.
   1. כדי להכין מיץ תפוחים פלטות אגר, ממלאים צלחות פטרי 35 מ"מ x 10 מ"מ ¾-מלא עם אגר 3% מומס לתוך מיץ תפוחים קנוי. חנות צלחות הקרושה במקרר עד לשימוש.
   2. בשפופרת צנטרפוגה חרוט 50 מ ל, לשלב קנוי בשמרים יבשים עם מים מזוקקים ביחס של 2 מ ל מים עבור כל גרם של שמרים. פשוט לערבב עם מים כדי ליצור משחה עם מרקם של קטשופ באמצעות כוס זע רוד... להתאים את הפרופורציות שמרים ומים לפי הצורך, כדי להשיג את המרקם הרצוי.
   3. לאחסן שמרים הדבק מקרר בין שימושים. שמור את הצינורית חופשי כדי לאפשר דה gassing.
   4. השתמש מחט חדה או סכין כדי לתת אגרוף חורים קטנים לתוך עוז 6 בקבוקים בכיכר התחתונה (פוליפרופילן) כמו חורים לאוורור הצ'יימברס הנחת.
   5. כי אמחה קלות נקודה קטנה של רסק שמרים (~ 3 מ מ קוטר) על כל צלחת אגר מיץ תפוחים.
2. במקום הזבוב הבוגר של גנוטיפ הרצוי לתוך הבקבוק עוז 6 פקקי בקבוק עם לוחית אגר מיץ תפוחים. אבטח את הצלחת הבקבוק עם גומי. היפוך, ולמקם באינקובטור כדי לאפשר מבוגרים להטיל ביצים.
3. לשנות מיץ תפוחים פלטות אגר על תא הנחת פעמיים ביום (בוקר וערב). צלחות לעזוב בשימוש בחממה עבור עוד 12 – 24 h לאפשר הראשון instar הזחלים יבקעו.
4. לאסוף קודם instar הזחלים באמצעות דק מכחול או אוסף איסוף (גמיש דק המחט מחוברת ידית). במקום 50 instar ראשית הזחלים של גנוטיפ ספציפי על בקבוקון מזון וסוג המזון ניסיוני הרצוי כדי לפתח מטמורפוזה השלמה בעוד בתוך החממה (איור 2א).
5. לאסוף מבוגרים לטיפול תרגיל (איור 2א).
   1. על התגלמות, איסוף הגלמים עם מברשת קטנה, לח, למקם את הבקבוקונים ריק לפני וגיחתו כדי למנוע נחשפים הדיאטה זחל הזבוב הבוגר.
   2. העברה הזבוב הבוגר מזון צלוחיות של דיאטה מעבדה רגיל כפי שהם eclose. אחד עד חמישה ימים לאחר וגיחתו נפרדים זבובים מבוססת על סקס.
6. הקצאת מחצית שנאספו המבוגרים כל ניסיוני, קבוצות שליטה. לשמור על זבובים צלוחיות של מעבדה סטנדרטיים דיאטה-ריכוז של 50 זבובים לכל מבחנה.
7. העברה מבוגרים מזון טרי הבקבוקונים בכל יומיים כדי למנוע מהם להתקע במהלך פעילות גופנית. להוסיף מספר גרגרי שמרים חיים משלימה המזון החדש מיד לפני החדרת את הזבובים.
   הערה: אמנם זה ניתן לשמור על זבובים ללא תוספת שמרים חיים, מצאנו כי הזבובים הבוגרים לבצע הכי טוב עם תוספי. תוספת שמרים חיים הוא משתנה יכול להיות שונה כדי להתאים מטרות הניסוי של החוקר.

3. תרגיל פרוטוקול

1. ביום הראשון של פעילות גופנית (יום 1), הדחיפה המבחנה המצתים לעזוב 1 ס מ של שטח בקבוקונים שליטה ו 6 ס מ של שטח בין האוכל ואת התקע תרגיל בקבוקונים (איור 1C).
   הערה: הבקבוקונים שליטה מוגבל שטח עבור זבובים לזוז בזמן על המכונה תרגיל, ובכך זבובים יעסקו הרבה פחות תנועה מאשר תרגיל בקבוקונים.
2. מניחים צלוחיות התפסים ולאחר מכן תן את הזבובים 10 דקות להסתגלות על המכונה (איור 1B).
   הערה: פקד חלופי היא לשמור את הזבובים unexercised על benchtop בסמוך למכונה תרגיל עם 6 ס מ של שטח (בבקבוקון) לעבור בדרך כלל. נמצאו תוצאות דומות של פעילות גופנית באופן יחסי את "1 ס מ על TreadWheel" וגם את הפקדים "6 ס מ על benchtop"¹¹.
3. לטפל בשני שליטה והתעמלות זבובים על סיבוב על המכונה בטמפרטורת החדר קבוע במשך 5 ימים רצופים בשבוע עם מתחלפים התקפי של הסיבוב לבין כל השאר (איור 1D).
   הערה: טמפרטורה נדרשת כדי למנוע את השפעת הטמפרטורה על פעילות רמות מבלבלים. ללימודים מניפולציה טמפרטורה, מקם את TW בתוך אינקובטור לשינוי טמפרטורה טיפולים במהלך תרגיל אימון.
   1. להפעיל את המכונה על ארבע התקפי 15 דקות של פעילות גופנית על יום 1. לסירוגין אלה התקפי עם תקופות מנוחה 5 דקות.
   2. כל אחד הימים הבאים, להוסיף 5 דקות של פעילות גופנית באחד הקרבות תרגיל שישנו. לדוגמה, ביום 2, להפוך לתחרות התרגיל הראשון 20 דקות ארוכות, אך לשמור על שאר הקרבות ב 15 דקות ארוכות.
   3. יום 3, פעילות גופנית זבובים עבור 20 דקות במהלך הקרבות הראשונים, 15 דקות עבור שני הקרבות הבאים.
   4. ביום הרביעי, משתמשים התקפי תרגיל 20 דקות עבור כל פרט הקרב הסופי, אשר צריך להיות רק 15 דקות ארוכות.
   5. יום 5, לשמור על פעילות גופנית כל התקפי ארוך 20 דקות.
      הערה: על במהלך תקופות מנוחה, הבקבוקונים המכיל את הזבובים צריכים להישאר בצורה מאובטחת בחוזקה על שנ. הכיוון של הבקבוקונים בתקופות אלה אינה רלוונטית כי כוח הכבידה מנוסים על ידי זבובים כל הבאה מן באותו הכיוון.
4. לאחר השלמת הטיפול תרגיל ליום נתון, להחזיר את השתלים המבחנה מזון לעמדות שלהם נורמלי וחוזרים זבובים חממות שלהם עד למחרת.
5. לאחר סיום המשטר תרגיל מלא, עזים ומתנגד זבובים באמצעות תקן לטוס CO₂ שיטות הרדמה. ואז להעביר זבובים בקבוקונים מזון חדש או צינורות microcentrifuge עבור הערכה של מאפייני פנוטיפי של עניין.
   הערה: דוגמה פנוטיפים כוללים טיפוס היכולת (מזון המבחנה), אחסון טריגליצריד (microcentrifuge tube) או ביטוי גנים (microcentrifuge tube). ניתן להשהות את הפרוטוקול פה עם דגימות מאוחסנים כראוי בהתאם ההערכות שיש לבצע. מבחני מעורבים זבובים חיים צריך להתנהל באופן מיידי על פי מטרות ספציפיות פנוטיפי וזמינותו.

4. טיפוס הערכה

1. אחרי יום אחד של מנוחה לאחר השלמת תהליך של פרוטוקול תרגיל, מטיסים כללי טיפוס הביצועים באמצעות מהיר geotaxis שלילי איטרטיבי (טבעת)-כמו assay טיפוס שלילי geotaxis²².
   1. למקם קבוצות של 10 זבובים בקבוקונים ריקה באמצעות CO₂ הרדמה (או הקשה ישירות מצלוחיות אוכל אם כבר ממוינת) לאטום עם פרפין סרט כדי למנוע בריחה את הזבובים. תן את הזבובים לפחות 10 דקות להסתגלות למבחנה חדש. כדי למנוע והתהפכה בקבוקונים, סרט ~ 5 ס מ קוטר עיגול קרטון לתחתית המבחנה לספק תוספת שטח.
      הערה: תקעים המבחנה לא אמור לשמש כי הם חוסמים חלק המבחנה לקביעת גובה טיפס.
   2. מקום בקבוקונים 20 ס מ מול רשת 1 ס"מ על 1 ס"מ בתצוגה מלאה של מצלמה הנטען, נייח עם מנגון (טלפון חכם עם מצלמת טיימר היישום עובד טוב).
   3. הקש על הבקבוקונים בעדינות על הטיימס מונה שלושה לדפוק כל הזבובים עד לתחתית המבחנה. לאחר הקשה על המבחנה למטה בפעם השלישית, להתחיל מיד את הטיימר מצלמה 4 s כדי ללכוד את התמונה כדי לקבוע את גובה טיפס על ידי כל זבוב.
      הערה: הקשה צריך להיעשות בעוצמה עקבי ועל ידי החוקר אותו בניגוד לכל פעילות גופנית-control כדי למזער את הוריאציה תגובות הזבובים עקב הקשה.
   4. חזור על שלב 4.1.3 פעמיים, לפחות 1 דקות מנוחה בין ניסויים, כדי לייצר בסך הכל שלושה ניסויים לכל מבחנה.
2. כדי לשמר את הזבובים עבור ניתוחים אחרים, מיד לאחר וזמינותו טיפוס הושלמה, פלאש להקפיא את הזבובים על ידי טבילה של חנקן נוזלי.
   1. השתמש בקבוקון דיואר רדוד, ובראשו פתח מלא עד לעומק של ~ 5 ס מ עם חנקן נוזלי.
   2. להעביר זבובים קטנים microcentrifuge צינורות באמצעות הרדמה₂ CO ולאחר מכן מקם צינורות בתוך הבקבוק דיואר מלא עם חנקן נוזלי. לחלופין, אם שניתוח מחייבים הימנעות של CO₂, הצמד להקפיא את הזבובים ישירות בתוך המבחנות טיפוס על-ידי הקשה בעדינות זבובים לתחתית המבחנה שלהם, בעוד החלק התחתון בתוך חנקן נוזלי, ולאחר מכן להעביר את הזבובים קפוא כדי microcentrifuge צינורות באמצעות מלקחיים.
      הערה: חנקן נוזלי הקפאה והיא אמורה לשמש רק עם אוורור חדר וציוד מגן נאות.
3. תהליך תמונות בעזרת כלי הבחירה multi-point²³ ImageJ.
   1. פתחו תמונה עבור עיבוד בתוך ImageJ.
   2. לקבוע קנה מידה 1 ס מ מבוסס על נייר רשת רקע כדי לחשב את המרחק טיפס על ידי כל זבוב. הכלי "קו" מן הבר כלי מעקב בצד אחד של ריבוע² 1 ס מ מהעיתון רשת רקע. לחץ על הכרטיסייה 'נתח' ובחרו "קבע קנה מידה". הגדר "מרחק ידוע" מאחר '1.00' ו "יחידה של אורך" כמו 'ס מ', ודא "גלובל" אינה מסומנת, ולחץ על "אישור".
   3. בחר בסמל "multi-point בחירה" מן הבר כלי ותקריב בתחתית המבחנה בתמונה. הגדר את הנקודה הראשונה בתחתית המבחנה על-ידי לחיצה על החלק הנמוך ביותר של הבקבוקון.
   4. לחץ על מרכז כל זבוב בבקבוקון כדי לסמן אותה נקודת נתונים. שימו לב כי ישנם בסך הכל 11 נקודות לכל מבחנה, סימון לתחתית המבחנה ועוד אחד עבור כל זבוב.
   5. לחץ על הכרטיסייה 'נתח' ובחר "מדידה" כדי ליצור טבלה של ערכים נמדד. שמור טבלה ב קובץ csv.
   6. פתח את קובץ ה-csv בתוכנית גיליון אלקטרוני, לחשב את המרחק המדויק טיפס על ידי כל זבוב על-ידי חיסור ערכי-y של נקודות 2-11 מ נקודה 1 בטבלת ערכים נמדד.
   7. חזור על הצעדים 4.3.1 דרך 4.3.6 ללא כל תמונה.

5. הטריגליצרידים אחסון Assay

הערה: דגימות, תקנים, גליצרול כל פתרון, הפתרון עובד triglycerol בשימוש בכל רחבי וזמינותו יש לשמור בקירור למשך של הפרוטוקול, לאחסן במקרר כאשר אינו בשימוש.

1. הכנת תקנים באמצעות הפתרון הסטנדרטי גליצרול.
   1. להפוך את ריק (B) על-ידי הוספת µL 1,000 המגון מאגר צינור microcentrifuge שכותרתו B.
   2. להפוך רגיל 1 (S1), 2.5 מ"ג/מ"ל לכל טוב, על-ידי הוספת µL 1,000 של הפתרון הסטנדרטי גליצרול צינור microcentrifuge שכותרתו S1.
   3. להכין תקן 2 (S2), 1.25 מ"ג/מ"ל לכל טוב, על-ידי הוספת µL 500 של הפתרון הסטנדרטי גליצרול µL 500 לשכפל₂O צינור microcentrifuge שכותרתו S2.
   4. להכין 3 תקן (S3), 0.625 מ"ג/מ"ל לכל טוב, על-ידי הוספת µL 250 של הפתרון הסטנדרטי גליצרול µL 750 לשכפל₂O צינור microcentrifuge הנקרא S3.
   5. להכין תקן 4 (S4), 0.3125 מ"ג/מ"ל לכל טוב, על-ידי הוספת µL 125 של הפתרון הסטנדרטי גליצרול 875 µL של diH20 microcentrifuge צינור הנקרא S4.
2. להכין את הפתרון עובד triglycerol סרום הטריגליצרידים נחישות הערכה.
   1. להוסיף 40 מיליליטר לשכפל₂O הכימית גליצרול חינם מתוך ערכת ומערבבים על ידי היפוך בקבוק.
   2. להוסיף 10 מ של לשכפל₂O הפתרון הטריגליצרידים מתוך ערכת ומערבבים על ידי היפוך בקבוק.
   3. לשלב ריאגנט גליצרול פתרון הטריגליצרידים ומערבבים על ידי היפוך להכין את הפתרון עובד triglycerol.
      הערה: הפתרון עובד triglycerol טובה למשך 60 יום, יכול להשלים את מבחני 96-ובכן צלחת ארבעה לכל ערכת באמצעות פרוטוקול להלן. אמצעי האחסון המשמש באופן פרופורציונלי בשעת הקטנה הערכה סרום הטריגליצרידים נחישות רשמית לשימוש בתבנית 96-ובכן צלחת.
3. לאמת ריק ותקנים על ידי בקפידה pipetting 5 µL של כל תקן לתוך דירה 96-ובכן, עם תחתית ברורה microplate דולר (או ארבע פעמים על הריק).
   1. להוסיף כל טוב המכילה תקן µL בדיוק 125 של פתרון עובד Triglycerol. לאפשר פתרונות להגיב למשך 30 דקות.
   2. מניחים צלחת 96-ובכן בספקטרופוטומטר ולקרוא את ספיגת-540 nm. השתמש המדידות ספיגת כדי ליצור עקומה תקן ולוודא את הדיוק של סטנדרטים המעריכה את הערך² . אם ה-R² בסטנדרטים של פחות מ- 0.98, מחדש להכין את הסטנדרטים טוב יותר.
4. מתחילים 1 יום של וזמינותו הטריגליצרידים אחסון¹⁴ באמצעות צינורות microcentrifuge המכיל 10 קפוא עף אחד.
   הערה: פיפטה אני חוזר או מרובה ערוצים לא צריך לשמש בשלב זה כי הכמויות של כל ריאגנט בשימוש וזמינותו חייב להיות מאוד מדויקים ועקביים כדי לקבל את התוצאות לשחזור. מניסיוננו, אני חוזר ועם ערוציות פיפטות אין זו מידת דיוק ועקביות. כל aliquot של פיפטה ערוץ אחד אפשר לאמת ויזואלית על ידי הנסיין לבקרת איכות, הטיות פיפטה ספציפיים לכל ערוץ אחד להיות מנוסים על ידי כל דוגמאות באותה מידה.
   1. להכין מלאי 200 מ של מאגר המגון על ידי שילוב של ג' 0.272 ח'₂PO₄, µL 400 של 0.5 M EDTA, mL 199.6 לשכפל₂O בבקבוק זכוכית.
   2. להוסיף µL בדיוק 100 מאגר המגון כל אחד הצינורות microcentrifuge 40 המכיל 10 מבוגרים קפואה לאחר טיפוס וזמינותו. לאחר מכן, צנטריפוגה דגימות ב-30 s ב 18,000 g.
   3. לטחון זבובים באמצעות מטחנה ממונע שהעקב (או צורה אחרת של רקמות המגון) להכין פתרון חלבי. ודא שכבעלי טרי משמש עבור כל דגימה. לאחר מכן, צנטריפוגה דגימות למשך 2 דקות ב 18,000 g
   4. Pipette רק את העליון 75 µL supernatant נוזל מתוך כל שפופרת לתוך צינורות microcentrifuge חדש. ודא כי אין סיביות לטוס מ בגדר מועברות דרך. מניחים צינורות חדשים במקרר למשך הלילה.
5. מתחילים יום 2 של פרוטוקול הטריגליצרידים על-ידי הסרת דגימות יום 1 מהמקרר.
   הערה: שלב 5.5 יכול להתבצע באותו יום כמו 5.4 אבל מצאנו את האות עבור ריכוז הטריגליצרידים להיות עמידים יותר אחרי לילה במקרר. עם זאת, הזמן בין 5.4 צעדים 5.5 לא יעלה 36 h.
   1. (אופציונלי) מערבולת ברכבת התחתית הראשונה עם נוזל supernatant 10 s, פיפטה 5 µL לתוך צינור נקי microcentrifuge. הוסף µL 95 של 0.15 מ' NaCl לתוך הצינור microcentrifuge חדש. חנות subsamples אלה במקפיא-20 ° C וזמינותו מאוחר יותר של חלבון במקרה הצורך.
      הערה: אלה דוגמאות תגובת שיקוע עם הפתרון NaCl נוסף יכול לשמש לקביעת תכולת החלבון שימוש assay המועדפת של החוקר. אנו משתמשים את שיטת ברדפורד²⁴. תכולת החלבון של דרך אחת כדי לתקנן את מידת תוכן הטריגליצרידים, אבל צריך החוקר גם להיזהר לפרש אלה יחסי מאז פעילות גופנית, תזונה יכולים להשפיע גם על חלבון אחסון.
   2. עבור הבקבוקונים supernatant המקורי, משכפל מערבולת ברכבת התחתית הראשונה עם נוזל supernatant s 10, אז פיפטה 5 µL לתוך שתי בארות נפרדים של microplate 96-ובכן לייצר טכני. הקפד הערה בארות אשר משמשים עבור כל דגימה. חזור על שלב זה עבור 39 צינורות אחרים.
   3. פיפטה 5 בדיוק µL של הריק לתוך ארבע בארות microplate, בשביל הבארות הנותרים, פיפטה 5 בדיוק µL של כל תקן דולר.
   4. להוסיף µL 125 בדיוק הפתרון עובד triglycerol מכל קידוח, וכן לאפשר פתרון להגיב למשך 30 דקות.
   5. מקם את הצלחת 96-ובכן בספקטרופוטומטר ולקרוא את ספיגת-540 nm.
   6. המרת ערכים ספיגת לתוך ריכוז (mg/mL) באמצעות עקומת סטנדרטי שמחושבים את הסטנדרטים.

Results

אנו מעוניינים במיוחד בזיהוי הגורמים התורמים לבריאות הכללית מטבולית של הפרט. בעבר נמצאו כי אינטראקציות גנוטיפ-מאת-דיאטה לתרום באופן משמעותי וריאציה ברמת האוכלוסייה תכונות מטבוליות¹⁴. משמעות הדבר היא כי כל גנוטיפ מגיב ההבדלים הסביבתיים בצורה ייחודית ומורכבת. כדי להרחיב את העבודה שלנו על אפקטים גנוטיפ-מאת-הסביבה לכלול פעילות גופנית, פיתחנו את TreadWheel, אשר הוא מסוגל לחשוף מספרים גדולים של אחרים כדי אירובי מרווח אימון (AIT) באופן תפוקה גבוהה.

כדי לקבוע אם פעילות גופנית על TW השפיעו על תכונות מטבוליות, מדדנו אחסון הטריגליצרידים ב אורגון-R (OreR) ו- y¹w¹ טס, wildtype נפוצה זבובים (איור 2B – C), ו מנורמל ערכים אלה נגד הזבובים ריכוז חלבון, כמו במקור דיווח מנדז. et al. ¹¹. ניתחנו את הנתונים על-ידי ניתוח רב משתני השונות (MANOVA) חשבונאות עבור גנוטיפ, סקס, תרגיל טיפול (ואת האינטראקציות שלהם), בלוק ניסיוני אפקטים כגון זמן משכפל ומזון בקבוקון ומצא כי היה משמעותי גנוטיפ-מאת-תרגיל אינטראקציה (p = 0.0017) המשפיעים על אחסון הטריגליצרידים. היה אפקט משמעותי dimorphic מינית בין זכרים ונקבות, עם זכרים אחסון טריגליצרידים יותר מאשר נקבות (p < 0.0001). ראינו כי אצל נקבות, זבובים ממניעים היו רמות טריגליצרידים נמוך משמעותית מאשר מקביליהם unexercised (איור 2B, p < 0.0001). בקרב הזכרים, בזמן הירידה אחסון הטריגליצרידים שנצפתה אורגון-R ממניעים זבובים (לעומת פקדים) לא היה משמעותי סטטיסטית, הבדל משמעותי באחסון הטריגליצרידים נצפתה בין שני הקווים נפרד (איור 2C, p < 0.0001). שים לב כי בעוד האחדת ריכוז הטריגליצרידים כנגד ריכוז חלבון מספק תובנה על הגוף באופן כללי לעוף קומפוזיציה יחסי, השוואה של ריכוז הטריגליצרידים או חלבון ישיר בין קבוצות שונות של זבובים יכולים גם לספק מידע ספציפי על ההשפעה של פעילות גופנית על אלה פנוטיפים בנפרד.

כיוון משתנים כמו פעילות גופנית למבוגרים, סקס, גנוטיפ מוצגים להשפיע על אחסון הטריגליצרידים, זה היה צפוי כי גורמים אלה גם להשפיע על אחרים פנוטיפים ולקיים אינטראקציה עם דיאטה. גידלנו את הזחלים נציג wildtype דרוזופילה בלוח הפניה גנטי קו (DGRP 153)²⁵ או שומן גבוהה או תזונה נורמלית ולא תרגיל המושרה הזבוב הבוגר למשך שבוע (איור 2א). לאחר מכן, ביצענו assay geotaxis שלילי טבעתי כדי למדוד את יכולת טיפוס. טיפוס וזמינותו בשימוש שונה מזו assay סטנדרטי הטבעת; במקום מנגנון הטבעת, צלוחיות עם סרט פרפין כיסוי הפתחים שימשו בית זבובים במהלך וזמינותו. היבטים אחרים של וזמינותו הטבעת המקורית, כגון זמן בין הקשה הזבובים לתחתית המבחנה לוקח את התמונה, היו יתרת²².

כל הטיפולים היו חוזר על עצמו שלוש פעמים נפרדות עם מינימום של 59 זבובים בודדים לכל זמן שכפול וטיפול. נתונים נותחה על ידי MANOVA להתווכח על דיאטה, גנוטיפ, יחסי מין, פעילות גופנית לטיפול (ואת האינטראקציות שלהם), כמו גם בלוק ניסיוני השפעות הזמן שכפול assay המבחנה, בקבוקון assay שכפול. מצאנו כי הנקבות exercised טיפס גבוה יותר באופן משמעותי (p < 0.005) כאשר גדלו על הדיאטה השמן גבוהה יותר מכל הטיפולים האחרים הנשי (איור 2D). לזכרים, זה היה לראות כי פעילות גופנית רק שיפרה טיפוס כאשר זכרים גדלו על תזונה נורמלית, אלו שהועלו על הדיאטה שומן גבוה לא הראה שום שינוי משמעותי (איור 2E). מצאנו גם תופעות מינית dimorphic משמעותיות (p < 0.0001) לעלות עם זכרים לטפס גבוה יותר מאשר נקבות. התוצאה מפתיעה של ירידה טיפוס ביצועי בעקבות פעילות גופנית לנשים מן השורה DGRP 153 (איור 2D) לנשים לצרוך דיאטה רגילה (p < 0.0001) דוגמה של איך זה סוג של פעילות גופנית לא להיות התערבות חיובי בצורה אחידה על כל אחרים יכול להיות מכסה על גורמים סביבתיים אחרים. ב. מנדז et al. ¹¹, הנקבות של ארבע שורות גנטיים אחרים שנבדקו עבור הביצועים שלהם טיפוס לאחר הועלה נורמאלי דיאטה כל יכולת טיפוס הראה משופרת עם תרגיל אימון. הדבר מצביע על כי התגובה שנצפתה DGRP 153 הוא גנוטיפ ספציפיים, לא מאפיין כללי של הטיפול תרגיל TW. ההשתנות בתגובה על פני סקס, דיאטה וקבוצות טיפול תרגיל מציין כי קיימים אינטראקציות סקס-מאת-דיאטה-מאת-פעילות גופנית משמעותית המשפיעה על היכולת טיפוס של הקו (p < 0.0001).

התוצאות מצביעות יחדיו, על כי ההשפעה של פעילות גופנית על בריאות מטבולית של הזבוב למבוגרים יכול להיות פונקציה של סקס, גנוטיפ, ושל הדיאט זחל. וריאציית פנוטיפי ציין בתגובה גנוטיפ, משתני סביבה (למשל, תזונה ופעילות גופנית), ומין גם נצפתה אחרים מחקרים^11,12,14,15. לפיכך, TW ו דרוזופילה יכול להיות אסטרטגיה רב עוצמה להסבר של גורמים גנטיים וסביבתיים בעיצוב הבריאות המטבולית.

איור 1 : TreadWheel התרגיל מכונת. (א) המכונה מחזיקה בקבוקונים 48 ויש לו תכונה מהירות מתכווננת. כאן בוצעו ניסויים ב סל ד 4. (B) מזון בודדים מבחנות שמכילות את הזבובים ניסיוני היו בזעף לתוך סוגריים המצורפת של הציר מסתובב. (ג) המרחק בין המבחנה הכנס מזון היה 6 ס מ עבור תרגיל בקבוקונים, 1 ס מ עבור פקד בקבוקונים. הבקבוקונים הונחו אז במחשב עבור פעילות גופנית. (D) התרגיל הפירמידה הופכי יום 5 המשטר שימש לממש את הזבוב הבוגר. בכל יום נוספים חמש דקות נוספה באחד הקרבות פעילות גופנית להשתולל עצימות באופן מצטבר, אשר מודלים סיבולת, מרווח אימון. דמות זו שונתה מ מנדז. et al. ¹¹. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 2 : שיטות חזותי ותוצאות נציג. (א) שיטות לבדיקת דיאטה זחל ואפקטים אינטראקציה גופנית למבוגרים. הזחלים היו הרים בדיאטה גבוהה מעבדה שמנה או נורמלי, החליפו אוכל רגיל על וגיחתו. הזבוב הבוגר היו מופרדים באמצעות סקס, להציב לתוך קבוצות ניסיוני ועבר במשך חמישה ימים רצופים. לאחר מכן, geotaxis שלילי טבעתי, טיפוס assay נערך, זבובים קפאו למדידות הטריגליצרידים. טריגליצרידים נציג נתונים מוצגים עבור שני קווים גנטיים, אורגון R ו- y¹w¹ עבור (B) נקבות וזכרים (C). מכל הזבובים היו גדלו על דיאטה רגילה ועבר בבגרות. רמות עם אותיות שונות הם שונים באופן משמעותי (p < 0.05) באמצעות פוסט הוק של תלמיד t-מבחן. איור זה מכיל קבוצת משנה של הנתונים המדווחים ב מנדז. et al. ¹¹. נציג טיפוס נתונים מוצגים עבור קו DGRP 153 (D) נקבות וזכרים (E). כל נקודה מייצגת את הביצועים טיפוס בממוצע של 232 או יותר אנשים על פני שלוש נקודות זמן עצמאי. קווי שגיאה מצביעים על שגיאת תקן אחד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

משלימה איור 1: שרטוט מפורט של TreadWheel. (א) תרשים של מבנה קלאמפ המבחנה כפול להצמדה בקבוקונים למכונה. (B) מבט פנים מערכת כונן המסתובבת של המכונה. (ג) הקרנה מקבילים של הפנים הקדמי של המכונה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

קובץ קוד משלים: TreadWheel.skp אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

Discussion

פרוטוקול תרגיל מפורט כאן הוכח לעורר בהצלחה תרגיל עדין דרוזופילה והוא יכול לשמש כדי לדמות סיבולת תרגיל במעבדה מבוקרת הגדרת¹¹. יודגש כי כאשר בתחילה בפיתוח הרעיון TreadWheel, שקלנו מוצרים מסחריים עשוי להיות שונה כדי לבצע באופן דומה (למשל, לירג מעבדה). עם זאת, אנחנו בסופו של דבר דחה גישה זו, בחירה בעיצוב לפי הזמנה כי ציוד מסחרי לא היה מהירות כשעוצמת נמוכה מספיק (4 סל ד) ולא חסרה קיבולת מספיקה מבחנה לדור מדגם תפוקה גבוהה.

פרוטוקול ה-TW עצמו יכול להיות מותאם כדי להקיף מגוון רחב של נושאי מחקר. לדוגמה, התאמת את התדירות והמשך של הזבובים תרגיל משטרים יכול לשנות עוצמות אימונים שהם מקבלים. על-ידי הרחבת פרוטוקול ארוך יותר מאשר שבוע אחד או בקבוצות גיל אחרות, אפשר היה לחקור את ההשפעות של פעילות גופנית על הזדקנות, מחלות שונות הקשורות לגיל. אנו ממליצים כי אם גישה מורחבת תרגיל מיושם, יתווספו לאחר מכן יום מנוחה אחד לפחות בשבוע צריך לאפשר התאוששות. ביצועים ושיפור הוצגה להיות גדול תחת משטרים שכלל יום התאוששות יותר לאותם משטרים שהיו רצופים התרגיל היומי¹². כמו כן, אנו מזהיר נגד הרחבת פעילות גופנית לגבי אורך 30 דקות האחרונות מאז habituation כדי תנועה סיבובית עלולה להתרחש לאחר תקופות ארוכות של רציף תרגיל¹¹. הבחנו גם וריאציות גנטיות מוטיבציה של הזבובים לשמור על רמות הפעילות שלהם על ה TW¹¹. לפיכך, אם התקפי יותר הם הרצויה, לשקול ניטור הזבובים רמות הפעילות, כפי שהוצגו על ידי וואטאנאבה, החידה^15,21 המתאר את השינוי של הקונספט שנ. גורמים אחרים יכול להיות מגוון כוללים חום, שינה-התעוררות דפוסים, אשר מוצגים גם להשפיע על תנועות לטוס^26,27.

יש שפע של ניתוחים זמין במהלך ולאחר השלמת פרוטוקול לפנות את ההשפעות של פעילות גופנית על רמת, התנהגותית, הפיזיולוגית, כמו גם את היכולת לפענח תופעות epigenetic של פעילות גופנית. מבחני מטבוליים נוספים (למשל, גלוקוז גליקוגן, חלבון), ביצועים לב, תגובה דלקתית אמצעי יכול לשמש על מנת לחקור את התרגיל אפקט יש לטוס פיזיולוגיה וגוף הרכב^{12,14 24, ,28}. שינויים התנהגותיים שונים הקשורים עם פעילות גופנית אינדוקציה, כגון שינויים האכלה התנהגות פעילות גינקולוגיות, שינה, גם ניתן למדוד באמצעות כלים כמו assay CAFE²⁹ או פעילות פיקוח על התקנים^{12,15 ,30}. ניתן לכמת שינויים ביטוי גנים וכן נשימה תאית לייחס להתאמן גם בשיטות PCR לרביעיית¹¹ ו- respirometry³¹. לבסוף, דרוזופילה יש ערך גנטי משאבים זמינים, כגון החלונית Reference גנטיקה דרוזופילה 2 והמשאב דרוזופילה סינתטי האוכלוסייה המספקות חוקרים את הפלטפורמה לביצוע מחקרים גנטיים כמותיים^25,32. כלים אלה מאפשרים מיפוי ניסויים, כגון מיפוי הגנום כולו האגודה מחקרים ו לוקוסים תכונה כמותית, לזהות המועמד לוקוסים הקשורים עם פעילות גופנית ותזונה.

מחקרים שהושלמו באמצעות TreadWheel את הדגים, בממוצע, פעילות גופנית מפחיתה במשקל הגוף, הטריגליצרידים הכולל אחסון גליקוגן, תוך הגדלת תכולת החלבון וטיפוס ביצועים¹¹. בנוסף, היו תגובות משתנה לממש בכל המינים ואת אחרים במשקל הגוף, כמו גם רמות טריגליצרידים, חלבון, גליקוגן, גלוקוז של פעילות רמות^11,15. בעוד ההשתנות של תגובה תרגיל ו דיאט על פני אחרים, מין עשויה להיות מאתגרת לפרש, לעיתים, שלא נראית מציאותית, הוא משקף מקורות וריאציה ביולוגי אמיתי נצפתה באוכלוסיות טבעיות. אנו משתדלים להבין את הגיוון של הגורמים הבסיסיים התורמים שיעור גבוה של המטס, כלים המאפשרים disentangling את התפקיד היחסי של הגורמים התורמים שונים על-ידי בדיקת גורמים אלה היצורים מודל יהיה קריטי ליכולת שלנו לפתח התערבויות מניעה וטיפול אישי. באופן מלא, כדי להעריך את האפקטיביות של פעילות גופנית כל הגורמים הללו, כיצד הם פועלים הדדית יש לקחת בחשבון בעת עריכת ניסויים, גיבוש מסקנות.

TW, כמו שאר מכשירי כושר לעוף, היא מוגבלת ביכולתה לכמת תנועה לעוף. לאחרונה, וואטאנאבה, החידה פיתח את סיבוב תרגיל כימות מערכת (REQS), שדרה TW ששינה עם פעילות ניטור יחידת (LAM25H) של מערכת ניטור דרוזופילה סדרה^15,21. כמו TW, מערכת זו משתמשת לאופקית לזירוז בעדינות את התרגיל תוך שימוש בזרוע LAM25H כדי לעקוב אחר לכמת פעילות לטוס, אבל היא מחזיקה מספר קטן יותר של צלוחיות (32 בקבוקונים) מאשר ה TW¹⁵. ללימודים תפוקה גבוהה פעילות גופנית, אם פעילות כימות אינו נחוץ או הרצוי, TW מאפשר למספר מדגם גדול יותר. העיצוב TW יכול גם להיות שונה מן במתכונתה הנוכחית כדי להכיל מספר רב יותר של בקבוקונים. מערכת זו, יחד עם שיטות אחרות קיימת פעילות גופנית, עזר להקים פעילות גופנית אינה רק בהגעה דרוזופילה , אבל גם ניתן יהיה ללמוד כדי לקבוע את ההשפעה של פעילות גופנית על מגוון רחב של תגובות פיזיולוגיות ומולקולרית ^11,12,15. לפיכך, TW, כשיטה מוכחת של גרימת תרגיל עדין זבובים, יכול לשמש כדי לחקור מגוון גדול של השאלות הביולוגיות.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
<חזקים>חומרים לבניית גלגל הליכה: < / חזק>
פילוס שיכוך רעידות כבד הר	מקמאסטר-קאר	60855K71	כמות: 4
מיסבים כדוריים מנירוסטה	מקמאסטר-קאר	57155K306	כמות: 8
שנאי מתח פלאג-אין (500MA, כניסת 120VAC, פלט 24 VAC)	מקמאסטר-קאר	70235K16	כמות: 1
מנוע הילוכים DC קומפקטי בעל פנים מרובעות	McMaster-Carr	6409K23	כמות: 1
מחזיק כלים (מלחציים)	McMaster-Carr	1723A22	כמות: 5 (10x)
12L14 מוט סובלנות הדוקה מפלדת פחמן	McMaster-Carr	5227T24	כמות: 1
סט צווארון פיר בורג	McMaster-Carr	6432K13	כמות: 8
גלגלת	חגורה עגולהMcMaster-Carr	6284K51	כמות: 5
בקרות חצים – 25 מקסימום סל"ד, מנוע AC DC חשמלי	McMaster-Carr	13DV 1A	כמות: 1
<חזק>חומרים לתחזוקת זבובים וגידול זבובים
6 אונקיות בקבוקים תחתונים מרובעים (פוליפרופילן)	Genesee Scientific	32-130	כמות: 1
35x10 מ"מ צלחות פטרי	VWR	82050-536	כמות: 1
בקבוקוני דרוזופילה צרים	Genesee Scientific	32-116	כמות: 1
Flystuff	Flypad Genesee Scientific	59-114	כמות: 1
Blowgun, Mini	Genesee Scientific	54-104	כמות: 1
<חזק>חומרים לבדיקת RING-like:
ImageJ	NIH	https://imagej.nih.gov/ij/	כמות: 1
1 ס"מ נייר גרף או רשת מצויירת (לפחות 20 ס"מ על 30 ס"מ)	שונות		:
מצלמה דיגיטלית אחת עם טיימר או טלפון חכם עם אפליקציית טיימר מצלמה	שונות		כמות: 1
<חזק>חומרים לטריגליצרידים בדיקה:
Dewar בקבוק	VWR	14200-960	כמות: 1
ערכת קביעת טריגליצרידים בסרום	Sigma Aldrich	TRO100	כמות: 1
מנוע עלי אלחוטי	VWR	47747-370	כמות: 1
עלי	VWR	47747-358	כמות: 1