הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

פרוסות המוח, יותרת המוח בריא לחקירות אלקטרופיזיולוגיות של תאים יותרת המוח בדגים Teleost

7.5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/57790

⸱

16 באוגוסט 2018

 ,  , 
1Department of Basic Sciences and Aquatic Medicine, Faculty of Veterinary Medicine, Norwegian University of Life Sciences

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

המאמר מתאר פרוטוקול ממוטב עבור ביצוע פרוסות קיימא רקמת המוח, יותרת המוח, תוך שימוש medaka של דג teleost (Oryzias latipes), ואחריו אלקטרופיזיולוגיות הקלטות של יותרת המוח תאים בטכניקה תיקון-קלאמפ עם תצורת תיקון מחורר.

תקציר

חקירות אלקטרופיזיולוגיות של תאים יותרת המוח נערכו זנים חוליות רבים, אבל מעט מאוד דגים teleost. בין אלה, רוב ברור בוצעו על חלופה מועדפת תאים הראשי. כדי לשפר את ההבנה שלנו של מה teleost תאים יותרת המוח, להתנהג בסביבה יותר ביולוגית רלוונטית, פרוטוקול זה מראה כיצד להכין פרוסות המוח, יותרת המוח קיימא באמצעות medaka של דגים מים מתוקים קטנים (Oryzias latipes). עושה את פרוסות המוח, יותרת המוח, pH ו osmolality של כל הפתרונות הותאמו הערכים שנמצאו נוזלי גופו של דגי תיה 25-28 מעלות צלזיוס. בעקבות הכנה פרוסה, הפרוטוקול מדגים כיצד לערוך הקלטות אלקטרופיזיולוגיות בטכניקה תיקון שלם-תא מחורר-קלאמפ.... טכניקת תיקון-קלאמפ היא כלי רב עוצמה חסרת תקדים רזולוציה טמפורלית ורגישות, המאפשר חקירת תכונות חשמליות מתאי כל שלם אל תעלות יונים יחיד. תיקון מחורר הוא ייחודי בכך. זה שומר על הסביבה תאיים ללא פגע מונע גורמים רגולטוריים ציטוזול להיות מדולל לפי הפתרון אלקטרודה פיפטה תיקון. לעומת זאת, בעת ביצוע הקלטות שלם-תא המסורתי, זה היה ציין כי תאים יותרת המוח medaka במהירות מאבדות את יכולתן לפטר את פוטנציאל פעולה. בין ניקוב טכניקות שונות זמינים, פרוטוקול זה מדגים כיצד להשיג ניקוב של קרום תוקנו באמצעות ונעביר b. שהוא גוסס

מבוא

בלוטת יותרת המוח הוא איבר האנדוקרינית המפתח גולגולת ממוקם מתחת להיפותלמוס, אחורי הצנטר. הוא מייצר, מפריש הורמונים שישה עד שמונה סוגים תאים מסוים. הורמוני יותרת המוח מהווים ביניים בין המוח לבין איברים היקפיים ולנסוע מגוון רחב של תהליכים פיזיולוגיים חיוניים כולל גדילה, רבייה של ההסדרה של הומאוסטזיס. בדומה נוירונים, תאי האנדוקרינית של ההיפופיזה נמצאים חשמלית להתרגש עם היכולת לירות פוטנציאל פעולה באופן ספונטני 1. תפקידם של אלה פוטנציאל פעולה הוא תא התלויים. מספר סוגי תאים של יונקים ההיפופיזה, פוטנציאל פעולה יכול לרומם את תאיים Ca2 + מספיק לשחרור מתמשכת של הורמון 2. בנוסף, בלוטת יותרת המוח מקבל מידע מופחתים והן מעכבות המוח המשפיעה על פוטנציאל הממברנה של התאים 3,4,5,6. בדרך כלל, קלט מופחתים מגביר את רגישות לעתים קרובות כרוך על שחרורו של Ca2 + מחנויות תאיים וכן גדל ירי תדירות 7. הבנת איך התא מנצל את ההרכב ערוץ יון ומתאים אלה אותות מהמוח, היא המפתח להבנה הורמון סינתזה ושחרור.

הטכניקה תיקון-קלאמפ היה פותח בסוף שנות ה-70 על ידי Sakmann, Neher 8,9,10 , משופרת נוספת על ידי האמיל 11, ומאפשר חקירות מפורטת של מאפייני אלקטרופיזיולוגיות של תאים אל תעלות יונים יחיד. יתר על כן, הטכניקה ניתן ללמוד זרם ומתח. היום, מחבר תיקון-חובק למעקה הוא תקן הזהב למדידת תכונות אלקטרופיזיולוגיות של התא. ארבע הגדולות תצורות לשיטת תיקון-קלאמפ חותם חזק היה מפותח 11; את התא צמוד-את-inside-out, את החוץ-אאוט, התיקון השלם-תא. שלוש תצורות הראשונה משמשים בדרך כלל עבור יון בודד ערוץ חקירות. ליום העצמאות, בעקבות לתצורת צמוד-תא, חור קרום התא הוא עשה שימוש בלחץ אטמוספרי תת. תצורה זו מאפשרת גם חקירות של יון ערוץ הרכב של התא כולו 12. עם זאת, מגבלה אחת של טכניקה זו היא כי מולקולות cytoplasmic הם מדולל על ידי תיקון פיפטה פתרון 13 (איור 1א'), ובכך משפיע על התגובות חשמליות ומגנטיות פיזיולוגיים של התאים למד. אכן, חלק מן המולקולות עשוי לשחק תפקידים חשובים בהעברת האות או בוויסות של תעלות יונים שונים. כדי למנוע זאת, לינדאו, פרננדז 14 פיתח שיטה איפה תרכובת להיוות נקבובית מתווסף על פיפטה תיקון. בעקבות לתצורת צמוד-תא, המתחם לשלב קרום פלזמה תחת התיקון, לאט לנקב את הקרום יצירת מגע חשמלית עם ציטוזול (איור 1B). ניתן להשתמש במספר תבחיני שונים כגון ניסטטין 15 ו- B שהוא גוסס 16, או פיתחה כגון סאפונין בטא-escin 17,18 . תרכובות אלו ליצור נקבוביות גדול מספיק כדי לאפשר הקטיון monovalent ו- Cl– דיפוזיה בין ציטוזול על פיפטה של תיקון תוך שמירה על רמת cytosolic של מקרומולקולות, יונים גדולים יותר כמו Ca2 + 15, 16.

האתגר של שימוש תיקון מחורר הוא ההתנגדות סדרת פוטנציאל גבוה. סדרת ההתנגדות (Rs) או הגישה התנגדות נגמר ההתנגדות משולב פיפטה תיקון ביחס הקרקע. במהלך הקלטות תיקון-קלאמפ, ה-Rs יהיה במקביל התנגדות הממברנה (Rמ'). Rm ו- Rs עבודה במקביל מחלק מתח. עם ה-R גבוהs, המתח ייפול על ה Rs נותן שגיאות בהקלטות. השגיאה יהפוך גדול עם זרמים גדול נרשם. בנוסף, מחלק מתח הוא גם תדירות תלויה יצירת מסנן נמוך לעבור, ובכך להשפיע על רזולוציה טמפורלית. למעשה, התיקון מחורר שלא תמיד יאפשרו הקלטות של זרמים גדול ומהיר כמו המתח מגודרת זרמי Na+ (עבור קריאות מפורט ראו התייחסות 19). כמו כן, Rs עשוי להשתנות במהלך הקלטות תיקון-קלאמפ, שוב מובילים לשינויים בזרם המוקלט. לפיכך, תוצאות חיוביות שגויות עלולה להתרחש במצבים שבו Rs משתנה במהלך היישום סמים.

אלקטרופיזיולוגיה על הרקמה הפרוס הוצג לראשונה על ידי המעבדה אנדרסן ללמוד אלקטרופיזיולוגיות מאפייני הנוירונים במוח 20. הטכניקה סללה את הדרך עבור חקירות מפורט של תאים בודדים, כמו גם מעגלי תקשורת ותא תא-תא בסביבה יותר ללא פגע. טכניקה דומה להכנת פרוסות יותרת המוח הוצג לראשונה בשנת 1998 על ידי. Guérineau et al. 21. עם זאת, זה לא היה לפני 2005, הכנה פרוסה יותרת המוח הזה שימש בהצלחה ללימודי תיקון-קלאמפ teleost 22. במחקר זה, המחברים דיווחו גם על השימוש תיקון מחורר-קלאמפ הקלטות. עם זאת, עד כה, רוב החקירות אלקטרופיזיולוגיות של תאים יותרת המוח נערכו יונקים, רק קומץ של בעלי חוליות אחרים, כולל דגים teleost 1,2,22,23 . ב- teleosts, כמעט כל מחקרים בוצעו על תאים הפומבית ראשי 24,25,26,27,28,29,30 .

בתוך המאמר הנוכחי, אנחנו חלוקה לרמות פרוטוקול ממוטב עבור הכנה של המוח, יותרת המוח בריא, פרוסות medaka דגים המודל. הגישה מייצג מספר יתרונות בהשוואה תרביות תאים הפומבית העיקרי. ראשית, התאים נרשמים בסביבה יחסית משומר לעומת חלופה מועדפת תנאי התרבות תאים. שנית, ההכנות פרוסה מאפשרים לנו ללמוד מסלולים עקיף בתיווך תא-תא תקשורת 22, אשר אינה אפשרית בתנאי חלופה מועדפת תא תרבות. יתר על כן, נדגים כיצד לנהל הקלטות אלקטרופיזיולוגיות על הפרוסות רקמות שהושג באמצעות הטכניקה מחורר כולו-תא תיקון-קלאמפ עם המפוטריצין כסוכן להיוות נקבובית.

Medaka הוא דג מים מתוקים קטנים ילידי אסיה, בעיקר נמצאו ביפן. פיזיולוגיה, אמבריולוגיה, גנטיקה של medaka בהרחבה נחקרו במשך שנים מעל 100 31, זה דגם נפוץ מחקר במעבדות רבות. חשוב במיוחד הנייר הזה הינו הארגון מורפולוגיים ברורים של המתחם ההיפותלמוס, יותרת המוח בדגים teleost: ואילו ב יונקים וציפורים הנוירונים ההיפותלמוס משחרר שלהם הנוירו-ההורמונים וויסות תאים אנדוקריני יותרת המוח למערכת פורטל של קדושתו החציוני, יש השלכה עצבני ישירה של נוירונים היפותלמי אל התאים האנדוקריניים של ההיפופיזה ב דגים teleost 32. לפיכך, עם פרוסות המוח, יותרת המוח מתנהל היטב יש חשיבות מיוחדת בדגים, ומאפשר לנו לחקור את מאפייני אלקטרופיזיולוגיות התאים יותרת המוח ברשת יותרת המוח שהשתמרו ותאים בפרט איך בבלוטת יתרת המוח לשלוט דעתנית שלהם ועל ידי כך Ca2 + הומאוסטזיס.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

לטיפול בבעלי חיים כל בוצעה על-פי המלצות טיפול ולרווחתם של בעלי חיים מחקר ב אוניברסיטת הנורבגית למדעי החיים, ותחת פיקוחו של חוקרים מורשים.

1. הכנת כלים ופתרונות

הערה: כל הפתרונות צריכים להיות סטרילי. תשומת לב תינתן ועד ה-pH של osmolality (osmol/kg מים) של כל הפתרונות, אשר צריך להיות בזהירות מותאם הסביבה חוץ-תאי המין למד. pH ו osmolality צריך להיות מותאם עם ציוד אלקטרוני מדויק, כגון ph ו- osmometer נקודת הקיפאון בהתאמה.

  1. להפוך 500 מ"ל של פתרון במיוחד הסלולר ללא Ca2 + (Ca2 + חינם EC): 150 מ מ NaCl, 5 מ מ אשלגן כלורי, 1.3 מ'מ MgCl2, גלוקוז 4 מ מ, 10 מ מ Hepes.
    1. להמיס 4.38 g של NaCl, 186.37 מ"ג אשלגן כלורי, 61.89 מ"ג של MgCl2, 360.32 מ"ג של גלוקוז ו- g 1.19 של HEPES ב 450 מ של הנדסה גנטית (0.055 ארה ב / ס מ 25 ° c, את resistivity של שלום כהן 18.2) H2O בתוך זכוכית באמצעות מסית מגנטי.
    2. להתאים את ה-pH ל 7.75 עם NaOH.
    3. להעביר את הפתרון לתוך בקבוקון נפח 500 מ"ל. למלא את סטריליות הנדסה גנטית H2O עד 500 מ"ל.
    4. מערבבים את הפתרון לפני מדידה את osmolality. התאם ל 290-300 mOsm עם מניטול. מסנן לעקר את הפתרון באמצעות מערכת ואקום מים ו- 0.2 µm מסנן.
  2. להפוך 500 מ"ל של פתרון במיוחד הסלולר (EC): 150 מ מ NaCl, 5 מ מ אשלגן כלורי, 2 מ מ CaCl2, 1.3 מ'מ MgCl2, גלוקוז 4 מ מ, 10 מ מ Hepes.
    1. להמיס 4.38 גר' NaCl, 186.37 מ"ג אשלגן כלורי, 147.01 מ"ג CaCl2, 61.89 מ"ג של MgCl2, 360.32 מ"ג גלוקוז ו- g 1.19 של HEPES ב 450 מ של הנדסה גנטית H2O בתוך זכוכית באמצעות מסית מגנטי.
    2. להתאים את ה-pH ל 7.75 עם NaOH.
    3. להעביר את הפתרון לתוך בקבוקון נפח 500 מ"ל. למלא את סטריליות הנדסה גנטית H2O עד 500 מ"ל.
    4. מערבבים את הפתרון לפני מדידה את osmolality. התאם ל 290-300 mOsm עם מניטול. מסנן לעקר את הפתרון באמצעות מערכת ואקום מים ו- 0.2 µm מסנן.
  3. להפוך 500 מ"ל של פתרון במיוחד הסלולר עם 0.1% אלבומין שור (EC עם BSA): 150 מ מ NaCl, 5 מ מ אשלגן כלורי, 2 מ מ CaCl2, 1.3 מ'מ MgCl2, גלוקוז 4 מ מ, 10 מ מ Hepes.
    1. להמיס 4.38 גר' NaCl, 186.37 מ"ג אשלגן כלורי, 147.01 מ"ג CaCl2, 61.89 מ"ג של MgCl2, 360.32 מ"ג גלוקוז ו- g 1.19 של HEPES ב 450 מ של הנדסה גנטית H2O בתוך זכוכית באמצעות מסית מגנטי.
    2. להתאים את ה-pH ל 7.75 עם NaOH.
    3. להעביר את הפתרון לתוך בקבוקון נפח 500 מ"ל. למלא את סטריליות הנדסה גנטית H2O עד 500 מ"ל.
    4. מערבבים את הפתרון לפני מדידה את osmolality. התאם ל 290-300 mOsm עם מניטול. מסנן לעקר את הפתרון באמצעות מערכת ואקום מים ו- 0.2 µm מסנן. להוסיף 50 מ"ג BSA.
  4. להפוך 250 מ של פתרון תאיים (IC): 110 מ מ KOH, 20 מ מ אשלגן כלורי, 10 מ מ Hepes, סוכרוז 20 מ מ.
    1. להמיס 1.54 g KOH, 327.75 מ"ג אשלגן כלורי, 595.75 מ"ג של HEPES ו 1.712 גר' סוכרוז ב 450 מ של הנדסה גנטית H2O בתוך זכוכית באמצעות מסית מגנטי.
    2. להתאים את ה-pH ל 7.2 (N-מורפולינו) אתאן. חומצה sulfonic (MES).
    3. להעביר את הפתרון לתוך בקבוקון הנפחי 250 מ. למלא את סטריליות הנדסה גנטית H2O עד 250 מ.
    4. מערבבים את הפתרון לפני מדידה את osmolality. התאם ל 280 – 290 mOsm (10 mOsm נמוך יותר EC) עם סוכרוז. מסנן לעקר את הפתרון באמצעות מערכת ואקום מים ו- 0.2 µm מסנן.
  5. לעשות 100 מ של פתרון 2% נמוך agarose נמס ב Ca2 + ו- BSA חינם EC (2 גר' agarose ההיתוך נמוכה ב- 100 מ של Ca2 + חינם EC). לפזר בעזרת מיקרוגל ולמקם את agarose נמס בתוך אמבט מים ב- 40 מעלות צלזיוס. תן לזה להתקרר עד 40 ° צלזיוס לפני השימוש על הרקמות.
    הערה: EC, Ca2 + EC חינם ניתן לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס במשך מספר שבועות אם סטרילי ופתרונות IC ב-20 ° C, במשך מספר חודשים. Agarose ניתן לאחסן במשך שבוע ב 4 ° C, ניתן לבצע שימוש חוזר 3 – 5 פעמים לזמן קצר במיקרוגל. שימוש חוזר מופרז יוביל אידוי ושינוי של agarose, ריכוז המלחים ואיכות.
  6. לבצע גשר אגר:
    1. מחממים 7.5 מ מ נימים זכוכית בורוסיליקט ארוך עם מחוץ בקוטר 2 מ מ (יתר) והצבע בתוך קוטר (ז) מ מ טאו 1.16 בעזרת מבער בונזן מוקד כ 1/3 מקצה אחד עד הזכוכית יתחיל להתכופף. הסר את הזכוכית של הלהבה ולאפשר הזכוכית לכופף עם זווית של כ 120 מעלות (איור 2א).
    2. ממיסים 2% אגר ב- EC רגילה ללא גלוקוז באמצעות מיקרוגל, ובעוד agarose זה מילוי נוזלי הזכוכית מוכנות מראש נימי באמצעות קפילריות כוחות על ידי לשים באחד הקצוות של הזכוכית לתוך הנוזל ומחכים כמה דקות. לאחסן גשרים עד השימוש ב 4 ° C ב- EC ללא גלוקוז.
  7. הכינו זכוכית בורוסיליקט עם נימה תיקון פיפטות באמצעות של פולר פיפטה מתאימים. עיין במדריך פולר פיפטה כדי לקבל את ההתנגדות הרצויה אלקטרודה.
    הערה: לנר של פיפטה צריך להיות קצר ככל האפשר. להתחדד קצר פיפטה מושגת באמצעות צעדים מושך 4-6. ההתנגדות אלקטרודה צריך להיות בין 2 ו 6 MΩ בהתאם לגודל התא.
  8. כדי למנוע תנועה של רקמות במהלך הניסויים תיקון-קלאמפ מעיל פני השטח של התא הקלטה עם 0.1% של polyethylenimine (פיי) במאגר בוראט.
    1. הכנת 500 מ"ל של בוראט מאגר (25 מ מ):
      1. להמיס g 4.768 של נה2B4O710 H2O ב- 450 מ של הנדסה גנטית H2O בתוך זכוכית באמצעות מסית מגנטי.
      2. להתאים את ה-pH ל 8.4 עם HCl.
      3. להעביר את הפתרון לתוך בקבוקון נפח 500 מ"ל. למלא את סטריליות הנדסה גנטית H2O עד 500 מ"ל ו- 0.2 µm מסנן לעקר את הפתרון באמצעות מערכת ואקום מים.
    2. להכין פתרון 1% מניות של פיי (50% 1 מ"ל פיי למאגר בוראט 25 מ מ מ ל 49) ו- 0.1% פיי לדילול מאת המדללת 10 µL של 1% פתרון מניות µL 100 בוראט מאגר לשימוש האחרון.
    3. להוסיף 2 מ של 0.1% פיי על הזכוכית של בעל פרוסה ולתת את ציפוי תקופת דגירה של 1 דקה. אז בקצרה לשטוף את הזכוכית. פעמיים עם 5 מ של הנדסה גנטית H2O ותני אוויר יבש עד השימוש.
  9. להכין את הפתרונות המפוטריצין.
    1. להפוך 60 מ"ג/מ"ל פתרון מניות על ידי המסת 3 מ ג של אבקת המפוטריצין µL 50 דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד), צינור 1 מ"ל מוגן מפני אור. מערבולת במהירות המרבית עבור 30 s ו sonicate למשך 15 דקות homogenize. חנות aliquots לתוך צינורות 3 – 5 ב-20 ° C, להשתמש aliquot אחת ליום.
      הערה: אם הפתרון מניות B שהוא גוסס אינה ברורה וחד צהוב צבע אבל חלבי (עדיין צהוב) לאחר 15-20 דקות sonication להפוך פתרון מלאי חדש.
    2. להפוך IC פתרון עם המפוטריצין על ידי pipetting 2 מ ל IC גביע זכוכית נקי עם יותר מ- 10 מיליליטר. להוסיף 8 µL של פתרון מניות B שהוא גוסס הפתרון פיפטה ומערבבים על ידי pipetting. לעטוף את. הספל עם רדיד אלומיניום והמקום על הקרח עד לשימוש, לחדש אותו כל 3 שעות.

2. ניתוח וחלוקת עם Vibratome

  1. להכין כלי ניתוח לפני לנתח, כולל חדה אחת, מלקחיים חזק אחת עם מספריים. לנקות את הכלים (קופסת הטישיו, מברשת, מלקחיים) עם אתנול ולוודא כי הם משמשים למטרות ניתוח בלבד, לא ליצור קשר עם רקמות קבוע. לשמור אותם בקופסה נפרדת כדי למנוע זיהום.
  2. המתת חסד הדג במי קרח קר עבור 1 דקות.
  3. בצע את השלבים הבאים לנתח במהירות medaka המוח ואת יותרת המוח עם מלקחיים חדה (השתמש לא יותר מ 3 דקות).
    1. בעוד מחזיק את הדג עם המלקחיים חזקה חמור העצבים האופטים שני מאחורי העיניים עם מספריים או מלקחיים חדים.
    2. פתח את החלק הגבי של הגולגולת מן הצד האחורי בצד הקדמי על ידי שבירת עצמות הגולגולת צעד אחר צעד עם מלקחיים חזקה.
    3. לקלף את הגולגולת בצד אחד עם מלקחיים חזקה.
    4. חמור חוט השדרה עם מספריים או מלקחיים חדה.
    5. . בעדינות, קח חוט השדרה עם המלקחיים, להפוך את המוח האחורי כדי הקדמי ולמקם אותו לתוך תבשיל עם קר כקרח Ca2 + חינם לכלכלת
  4. ממלאים תבנית מתכת3 1.5-2 ס מ עם agarose נוזלי ומניחים אותו על הקרח.
  5. בדיוק לפני agarose מתמצק (ב בסביבות 25-30 מעלות צלזיוס), בעדינות לתפוס את המוח על ידי חוט השדרה עם המלקחיים, יבש המלקחיים עם חתיכה של נייר איכותי, מכניסים agarose הרקמה. מערבבים במהירות את agarose לדלל את העקבות של EC הותירו מסביב לרקמת, להתמצא הרקמה ולתת את התבנית על קרח לכמה שניות עד agarose מתקשה.
    הערה: הכרחי בשלב זה יהיה מהיר. Agarose עפור במהירות כפי כייר מתכת מקורר של קרח.
  6. חיתוך בלוק מרובע של agarose המכילה הרקמות עם להב סכין והדבק אותה על המחזיק הדגימה vibratome באמצעות דבק ניתוח (רעיל).
  7. למלא את cuvette של vibratome קבלת המחזיק (יותרת-המוח) הדגימה עם קרח Ca2 + חינם לכלכלת
  8. למקם את המחזיק הדגימה vibratome וחותכים את הבלוק agarose כדי להפוך parasagittal מקטעים של 150 מיקרומטר, באמצעות תדר גבוה ומהירות נמוכה עבור חלוקתה. לאסוף את המקטעים הנבחרים ולמקם אותם אל החדר הקלטה תיקון-קלאמפ עם 3 מ"ל של קרח Ca2 + חינם לכלכלת
  9. במקום הנבל הרשת (איור 2B) על סעיף הרקמה.
    הערה: הנבל יחד עם הציפוי לייצב את הרקמות ולמנוע ממנו לזוז במהלך ההקלטות תיקון-קלאמפ.
  10. לאחר בנבל במקום, לשנות Ca2 + חינם EC המדיום EC נורמלי עם Ca2 + ו- BSA. תן לשאר רקמות למשך 10 דקות.

3. תיקון-קלאמפ והקלטות אלקטרופיזיולוגיות מחורר

  1. לפני תחילת הניסוי, כלוריד הכסף תיל אלקטרודות על ידי הפעולות הבאות: ראשית, להשתמש עם נייר זכוכית עדין (p180 מיוצר מאלומיניום) כדי לנקות את האלקטרודות חוט כסף. שנית, לשטוף עם 2 מ"ל, 70% אתנול. שלישית, לטבול את החוטים ב mL 2, 2 – 5% כלור למשך 10 דקות. לבסוף, לשטוף עם 2 מ"ל, הנדסה גנטית H2O.
  2. מקום תא הקלטה עם הפרוסה יותרת המוח בשלב מיקרוסקופ לאתר אזור היעד (יותרת המוח) באמצעות המטרה X 10, לבדוק את התאים באמצעות המטרה X 40.
    הערה: אם ההכנה הוא מוצלח, צריך תאים עגולים ומעט מאוד להיות גלוי. תאים עגולים אלה הם תאים פגומים בדרך כלל כי הן ניתוק מן הרקמה.
  3. מקם את אלקטרודת הארקה דרך הגשר 2% אגר לאמבטיה EC.
  4. אתר תא בריא באמצעות המטרה X 40.
    הערה: תא בריא צריך להיות בחוזקה המצורפת הפרוסה רקמות לא מעוגל למעלה, מנותקת הפרוסה.
  5. להגדיר את המגבר מתח-קלאמפ (VC; מצב הצבע 4A איור 1). פתח החותם לבדוק תצורת האמבט החלון ולחץ (איור 4B נקודה 1 ו- 2. השתמש דופק 5-mV כדי לפקח על פיפטה ההתנגדות (איור 4B נקודת 3).
  6. מילוי בקצה פיפטה תיקון עם הפתרון IC חינם פטריות לפני הוספת הפתרון IC עם המפוטריצין באמצעות מזרק מיקרו-המילוי (ראה איור 3).
  7. להוסיף לחץ אוויר חיובי מעט פיפטה תיקון באמצעות מזרק 1 מ"ל.
    הערה: זה הופך זרם נוזלי קטן מ פיפטה תיקון זה למנוע זיהום של הקצה.
  8. פעם אחת באמבטיה, להעריך את ההתנגדות פיפטה תיקון וודא כי אין חלקיקי מחוברים בקצה פיפטה (איור 4C).
    הערה: חתיכה קטנה של קלטת מחובר על גבי הצג הצגת הטופס הקלטת וידאו שדה הראייה. זה הופך את מיקום פיפטה תיקון ביחס תא קל יותר כאשר המטרה לא מתמקד התא.
  9. מדריך על פיפטה תיקון אל התא באמצעות micromanipulators.
    הערה: ודא כי פיפטה נקי על-ידי חיפוש חלקיקים קטנים יש לצרף עד לקצה פיפטה. שינויים פתאומיים התנגדות עשוי גם להיות תוצאה של חלקיקים תקוע בקצה פיפטה.
  10. להתאים מחדש את פיפטה כאשר מספר מיקרונים שמעל לתא כך קצה פיפטה יגע התא 1/3 מהאמצע של התא, כמוצג באיור5. כאשר נוגעים התא, לשחרר את הלחץ ולהחיל היניקה עדין עד שנגרום לכלב-ים.
    הערה: הזמן פיפטה תיקון נכנס לאמבטיה כדי מוצלחת חותם ולמורה קצר ככל האפשר. לא יותר מ 1 – 1.5 דקות כדי להימנע המפוטריצין להגיע בקצה של פיפטה, דליפה לתוך האמבט.
  11. מיד, מעבר לחלון טלאי תיקון-קלאמפ לתוכנה (איור 4 D נקודה 1) ויש פוטנציאל מחזיק בין-50 ו-60 mV (נקודת4D איור 2). רפד קיבול מהר מורכב על-ידי פיפטה מזכוכית (נקודת4D איור 3).
  12. מעבר לחלון התא . מלחציים צולבים תיקון תוכנה (איור 4E נקודה 1 ו- 2) ולהתחיל ניטור הגישה התנגדות, Ra, מוצג בחלון. אפס החוצה קיבול הממברנה בתוכנה מגבר (איור 4E נקודת 3) לאחר ושברשותך הרשאת גישה מתאימה.
    הערה: גישה מספיקות עשוי להימשך 10-30 דקות (איור 4E הצבע 2). גישה טובה להקלטות קלאמפ הנוכחי צריך להיות מתחת 20 מ'.
  13. לעבור קלאמפ הנוכחי, IC, בחלון התוכנה מגבר (איור 4F נקודה 1). התאם את הזרמים מהיר-קיבולי בחלון קלאמפ של התוכנה מגבר (איור 4F הצבע 2 ו- 3) אותו ערך כמו 3.12. בדוק פוטנציאל ממברנה (איור 4F נקודה 1).
    הערה: חשוב, אם קרום פוטנציאלי הוא רדוד (אופייני מעל-35 mV) התא עלול להינזק. בטל את ההקלטה, למצוא תא חדש.
  14. לאחר מציאת תא בריא (מחובר היטב אל הרקמות עם קרומית אפשרית מתחת-40 mV), להתחיל ההקלטות ניסיוני כמפורט של היצרן-פרוטוקול- 33,-34.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

פרוטוקול זה מדגים פרוטוקול צעד אחר צעד כיצד להשיג הקלטות אלקטרופיזיולוגיות אמין מתאי יותרת המוח (gonadotrope), באמצעות קו הטרנסגניים medaka [Tg (lhb- hrGfpII)] היכן היעד תאים (מייצרי Lh gonadotropes) מסומנות עם חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP).

בתחילה, החקירות אלקטרופיזיולוגיות נערכו באמצעות התצורה תאים שלמים. עם זאת, פוטנציאל פעולה ספונטנית לא נצפו בכל התאים למד. בקבוצת משנה של תאים, פוטנציאל פעולה יכול להיות מופעלות באמצע...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הקלטות אלקטרופיזיולוגיות בטכניקה תיקון-קלאמפ על פרוסות המוח, יותרת המוח דורש אופטימיזציה זהירה. פרוטוקולים היטב אופטימיזציה עבור ביצוע חקירות לחיות תאים במיוחד teleosts מוגבלות, עם הרוב של פרסומים באמצעות פרוטוקולים המבוססים על מערכות יונקים. בהקשר זה, חשוב להיות מודעים לעובדה כי מספר פרמטרים פיזיולוגיים כמו pH osmolality הם לא רק מינים תלויים, אבל גם תלוי מאוד אם המדובר האורגניזם חי ביבשה או במים. דגים, יש גם צורך, לקחת בחשבון, אם הם חיים בסביבה ימית או מים מתוקים. לדוגמה, הלחץ חלקי2 CO הוא נמוך בהרבה בדגים ל...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף

תודות

אנו מודים גב' LourdesCarreon G טאן עזרה שמירה על המתקן medaka, אנתוני Peltier עבור נתוני המחשה. עבודה זו מומן על-ידי NMBU ועל -ידי מועצת המחקר של נורבגיה, המספרים גרנט 244461 (חקלאות ימית תוכנית) ו 248828 (תכנית החיים הדיגיטליים נורבגיה).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
VibratomeLeicaVT1000 S
דבק כירורגיWPIVETBOND3M דבק רקמות
להבי נירוסטהCampden Instruments752-1-SS
תבניות מתכתSAKURA4122
נבל פלדהוורנר מכשירים64-1417
PBSSIGMAD8537
Ultrapure LMP agaroseinvitrogen166520-100
פיפטות תיקוןמכשיר סאטרBF150-110-10HPבורוסיליקט עם נימה OD: 1.5 מ"מ, תעודת זהות: 1.10 מ"מ
מיקרוסקופ פרוסותScientificapro6000
P-Clamp10מכשירים מולקולריים#1-2500-0180sofware
Digitizer Digidata 1550A1מכשירים מולקולרייםDD1550
מגבר Multiclap 700B Headstage CV-7Bהתקנים מולקולריים1-CV-7B
GnRHBachem4108604H-GLU-His-Trp-Ser-His-Gly-Leu-Ser-Pro-Gly-OH מלח טריפלואורואצטט 
מושך פיפטהSutter InstrumentP-1000
אמפוטריצין BSIGMAA9528אנטיביוטיקה יוצרת נקבוביות
פוליאתילנימין SIGMAP314350% PEI תמיסת
מיקרופילר מזרקWPIMF28/g67-5
זכוכית לגשר האגרמכשיר סאטרBF200-116-15בורוסיליקט עם נימה OD: 2.0 מ"מ, תעודת זהות: 1.16 מ"מ אש מלוטשת
מיקרו-מנהלמיקרוסקופיה קוד פתוח
optiMOS sCMOS מצלמהQimaging  01-OPTIMOS-R-M-16-C
סוניקטורElmaD-7700 Sinen
NaClSiGMAS3014
KClSiGMAP9541
MgCl2SiGMAM8266
D-גלוקוזSiGMAG5400
HepesSiGMAH4034
CaCl< תת>2SiGMAC8106
סוכרוזSiGMA84097
D-מניטולSiGMA63565
חומצה MESSIGMAM0895
BSASIGMAA2153
תוכנת תוכנת

מקורות

  1. Stojilkovic, S. S., Tabak, J., Bertram, R. Ion channels and signaling in the pituitary gland. Endocr Rev. 31 (6), 845-915 (2010).
  2. Stojilkovic, S. S., Zemkova, H., Van Goor, F. Biophysical basis of pituitary cell type-specific Ca2+ signaling-secretion coupling. Trends Endocrinol Metab. 16 (4), 152-159 (2005).
  3. Van Goor, F., Goldberg, J. I., Chang, J. P. Dopamine-D2 actions on voltage-dependent calcium current and gonadotropin-II secretion in cultured goldfish gonadotrophs. J Neuroendocrinol. 10 (3), 175-186 (1998).
  4. Chang, J. P., Pemberton, J. G. Comparative aspects of GnRH-Stimulated signal transduction in the vertebrate pituitary - Contributions from teleost model systems. Mol Cell Endocrinol. , (2017).
  5. Heyward, P. M., Chen, C., Clarke, I. J. Inward membrane currents and electrophysiological responses to GnRH in ovine gonadotropes. Neuroendocrinology. 61 (6), 609-621 (1995).
  6. Ben-Jonathan, N., Hnasko, R. Dopamine as a Prolactin (PRL) Inhibitor. Endocrine Reviews. 22 (6), 724-763 (2001).
  7. Sanchez-Cardenas, C., Hernandez-Cruz, A. GnRH-Induced [Ca2+]i-signalling patterns in mouse gonadotrophs recorded from acute pituitary slices in vitro. Neuroendocrinology. 91 (3), 239-255 (2010).
  8. Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260 (5554), 799-802 (1976).
  9. Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annu Rev Physiol. 46, 455-472 (1984).
  10. Neher, E. Techniques in cellular physiology. Baker, P. F. , Elsevier/North. Holland. 4-19 (1981).
  11. Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Arch. 391 (2), 85-100 (1981).
  12. Cahalan, M., Neher, E. Patch clamp techniques: an overview. Methods Enzymol. 207, 3-14 (1992).
  13. Marty, A., Neher, E. Single Channel Recording. Sakmann, B., Neher, E. , Plenum Press. 113-114 (1983).
  14. Lindau, M., Fernandez, J. M. IgE-mediated degranulation of mast cells does not require opening of ion channels. Nature. 319 (6049), 150-153 (1986).
  15. Horn, R., Marty, A. Muscarinic activation of ionic currents measured by a new whole-cell recording method. J Gen Physiol. 92 (2), 145-159 (1988).
  16. Rae, J., Cooper, K., Gates, P., Watsky, M. Low access resistance perforated patch recordings using amphotericin B. J Neurosci Methods. 37 (1), 15-26 (1991).
  17. Fan, J. S., Palade, P. Perforated patch recording with beta-escin. Pflugers Arch. 436 (6), 1021-1023 (1998).
  18. Hodne, K., von Krogh, K., Weltzien, F. A., Sand, O., Haug, T. M. Optimized conditions for primary culture of pituitary cells from the Atlantic cod (Gadus morhua). The importance of osmolality, pCO(2), and pH. Gen Comp Endocrinol. 178 (2), 206-215 (2012).
  19. Sakmann, B., Neher, E. Single-Channel Recording. , Springer. US. 3-35 (1983).
  20. Andersen, P. Brain slices - a neurobiological tool of increasing usefulness. Trends in Neurosciences. 4, 53-56 (1981).
  21. Guerineau, N. C., Bonnefont, X., Stoeckel, L., Mollard, P. Synchronized spontaneous Ca2+ transients in acute anterior pituitary slices. J Biol Chem. 273 (17), 10389-10395 (1998).
  22. Levavi-Sivan, B., Bloch, C. L., Gutnick, M. J., Fleidervish, I. A. Electrotonic coupling in the anterior pituitary of a teleost fish. Endocrinology. 146 (3), 1048-1052 (2005).
  23. Guerineau, N. C., McKinney, R. A., Debanne, D., Mollard, P., Gahwiler, B. H. Organotypic cultures of the rat anterior pituitary: morphology, physiology and cell-to-cell communication. J Neurosci Methods. 73 (2), 169-176 (1997).
  24. Yu, Y., Ali, D. W., Chang, J. P. Characterization of ionic currents and electrophysiological properties of goldfish somatotropes in primary culture. Gen Comp Endocrinol. 169 (3), 231-243 (2010).
  25. Price, C. J., Goldberg, J. I., Chang, J. P. Voltage-activated ionic currents in goldfish pituitary cells. Gen Comp Endocrinol. 92 (1), 16-30 (1993).
  26. Van Goor, F., Goldberg, J. I., Chang, J. P. Electrical membrane properties and ionic currents in cultured goldfish gonadotrophs. Can J Physiol Pharmacol. 74 (6), 729-743 (1996).
  27. Xu, S., Shimahara, T., Cooke, I. M. Capacitance increases of dissociated tilapia prolactin cells in response to hyposmotic and depolarizing stimuli. Gen Comp Endocrinol. 173 (1), 38-47 (2011).
  28. Haug, T. M., Hodne, K., Weltzien, F. A., Sand, O. Electrophysiological properties of pituitary cells in primary culture from Atlantic cod (Gadus morhua). Neuroendocrinology. 86 (1), 38-47 (2007).
  29. Strandabo, R. A., et al. Signal transduction involved in GnRH2-stimulation of identified LH-producing gonadotropes from lhb-GFP transgenic medaka (Oryzias latipes). Mol Cell Endocrinol. 372 (1-2), 128-139 (2013).
  30. Hodne, K., et al. Electrophysiological differences between fshb- and lhb-expressing gonadotropes in primary culture. Endocrinology. 154 (9), 3319-3330 (2013).
  31. Wittbrodt, J., Shima, A., Schartl, M. Medaka--a model organism from the far East. Nat Rev Genet. 3 (1), 53-64 (2002).
  32. Ball, J. N. Hypothalamic control of the pars distalis in fishes, amphibians, and reptiles. Gen Comp Endocrinol. 44 (2), 135-170 (1981).
  33. pCLAMP 10 Data Acquisition and Analysis For Comprehensive Electrophysiology User Guide. Molecular Devices Corporation. , (2006).
  34. MultiClamp 700B COMPUTER-CONTROLLED MICROELECTRODE AMPLIFIER Theory and Operation. Axon Instruments / Molecular Devices Corp. , (2005).
  35. Dominguez-Mancera, B., et al. Leptin regulation of inward membrane currents, electrical activity and LH release in isolated bovine gonadotropes. Biochem Biophys Res Commun. 491 (1), 53-58 (2017).
  36. Schmidt-Nielsen, K. Animal Physiology : adptation and environment fifth edition. , Cambridge university press. 613(1997).
  37. Burton, R. F. Evolutionary determinants of normal arterial plasma pH in ectothermic vertebrates. J Exp Biol. 205, Pt 5 641-650 (2002).
  38. Burton, R. F. The dependence of normal arterial blood pH on sodium concentration in teleost fish. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Physiology. 114 (2), 111-116 (1996).
  39. Heming, T. A., Blumhagen, K. A. Plasma acid-base and electrolyte states of rainbow trout exposed to alum (aluminum sulphate) in acidic and alkaline environments. Aquatic Toxicology. 12 (2), 125-139 (1988).
  40. Reeves, R. B. The interaction of body temperature and acid-base balance in ectothermic vertebrates. Annu Rev Physiol. 39, 559-586 (1977).
  41. Baicu, S. C., Taylor, M. J. Acid-base buffering in organ preservation solutions as a function of temperature: new parameters for comparing buffer capacity and efficiency. Cryobiology. 45 (1), 33-48 (2002).
  42. Miyanishi, H., Inokuchi, M., Nobata, S., Kaneko, T. Past seawater experience enhances seawater adaptability in medaka, Oryzias latipes. Zoological Lett. 2, 12(2016).
  43. Cass, A., Finkelstein, A., Krespi, V. The ion permeability induced in thin lipid membranes by the polyene antibiotics nystatin and amphotericin B. J Gen Physiol. 56 (1), 100-124 (1970).
  44. Holz, R., Finkelstein, A. The water and nonelectrolyte permeability induced in thin lipid membranes by the polyene antibiotics nystatin and amphotericin B. J Gen Physiol. 56 (1), 125-145 (1970).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Perforated Patch clampAmphotericin BMedaka Oryzias latipesVibratomeWhole cell Patch clamp
פרוסות המוח, יותרת המוח בריא לחקירות אלקטרופיזיולוגיות של תאים יותרת המוח בדגים Teleost
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.