הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

תרביות רקמה השחלות כדי לחזות תופעות העכבר השחלה

13.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/57794

⸱

19 ביוני 2018

 ,  ,  , 
1Department of Physiology, Aichi Medical University, 2Department of Obstetrics and Gynecology, Nagoya University Graduate School of Medicine, 3Department of Maternal and Perinatal Medicine, Nagoya University Hospital

במאמר זה

סיכום

בתרביות רקמה השחלות יכול לשמש דגמים של זקיק פיתוח, הביוץ זקיק בהכנת ולציין את מנגנוני הרגולציה של תהליכים דינאמיים השחלות.

תקציר

נקבות יונקים מעת לעת הביוץ הוא מספר כמעט קבוע של oocytes במהלך כל מחזור ייחום. כדי לקיים כזה בהתמדה ובהחלטיות, תקופתיות, רגולציה מתרחש ברמת הציר ההיפותלמוס-יותרת המוח-האשכים והן על פיתוח זקיקים בשחלה. למרות מחקרים פעילים, מנגנוני התפתחות זקיק אינם ברורים בשל מספר הצעדים הכרוכים מהפעלה זקיק הקדמוני רדום עד הביוץ, ובשל במורכבות הרגולציה השונה בכל אחד מהשלבים הזקיקים. כדי לחקור את מנגנוני התפתחות זקיק, ואת הדינמיקה של זקיקים במהלך מחזור ייחום, פיתחנו מודל תרביות רקמה השחלות העכבר יכול לשמש כדי לבחון התפתחות זקיק באמצעות מיקרוסקופ. זקיק שיטתית, כתב-העת ביוץ ופיתוח זקיק בהכנת כל מגורמיה במודל השחלה בתרבית, התנאים תרבות יכולה להיות מאופנן השפעול. . הנה, נדגים את התועלת של שיטה זו של לימוד מנגנוני הרגולציה של התפתחות זקיק ושאר התופעות השחלות.

מבוא

העכבר הנשי השחלות מכילות אלף זקיקים מספר1ולאחר הביוץ תקופתיים מבשיל כ 10 oocytes-בכל מחזור ייחום. זקיקים מסווגים לתוך מספר שלבים התפתחותיים: הבראשיתי, ראשי, משני, antral, ו Graafian זקיקים, תלוי בצורת שכבה תאית granulosa המקיפה כל oocyte. רוב הזקיקים הקדמוני רדום, חלקם מופעלים ולגדול לתוך ראשי זקיקי-כל מחזור ייחום2. לאחר שלב הזקיקים המשני, התפתחות זקיק מוסדר בעיקר על ידי gonadotropins, הזקיקים מגרה הורמון (FSH), הורמון מחלמן (LH). עם זאת, התפתחות זקיק הקדמוני, ראשי היא עצמאית של גונדוטרופין, מנגנוני הרגולציה המפקחים על השלבים האלה נשארים גרוע inderstood3,4,5. בנוסף, גורמי גדילה והורמונים זקיק הקדמוני, ראשי מוסדר על ידי האינטראקציות בין זקיקי6,7. לכן, עלינו לבצע ניתוחים של זקיק dynamics ברקמות השחלה העכבר, חקרה את מנגנוני הרגולציה המשויך שימוש בתרביות רקמה השחלות8,9,10.

במסמך זה, נסקור שתי שיטות דגם השחלות תרביות רקמה. הראשון משמש כדי לנתח זקיק פיתוח על ידי מדידה של אזורים הזקיקים, והשני משמש כדי ללמוד את מנגנון רגולטורי במהלך התפתחות זקיק מוקדמת מן הקדמונים לשלב זקיק משני עם העכברים הטרנסגניים. לצורך ניתוח התפתחות זקיק, בעיקר השתמשנו השחלות של עכברים נקבה 4 - בן שבועיים כי הם מאפשרים קל ויזואליזציה של זקיקים. לזירוז ביוץ תקופתיים ופיתוח מודל ויוו זקיק, אנחנו לשכפל מנחשולים LH ו ביוץ שנצפה זקיק בהכנת, הפרשת אסטרדיול בתנאים תרביות רקמה. תמונות של השחלות בתרבית נלכדו, תהליכי התפתחות של זקיק נותחו על ידי מעקב אחר שינויים באזור הזקיקים. אולם, בניתוח מיקרוסקופיית שדה בהיר, ההבחנה בין הקדמונים ותחילת זקיקים העיקרי היה לא ברור. לכן, פיתחנו שיטת עבודה זקיקים קטנים, ויוכל להבדיל בין הבראשיתי, העיקרית, ותרבותית זקיק המשני של רקמות השחלות באמצעות Oogenesin1 (Oog1) pro3. 9, השחלות העכברים הטרנסגניים R26-ויזת עבודה H2B-mCherry ימים 0 ו- 4 אחרי הלידה11. הביטוי Oog1 לזיהוי ב oocytes לאחר כניסתו מיוזה, והוא עולה בהדרגה עם התפתחות זקיק, המאפשר התבוננות המעבר הבראשיתי זקיקים הראשי באמצעות תמונות בצילום מואץ של רקמת השחלה בתרבית11 ,12. למרות בשיטות מורפולוגיות שימשו ללמוד הגורמים המפעילים הקדמוני זקיקים רדומים13,14,15,16, התפתחות זקיק פיזיולוגיים של השחלות הוא קשה לצפות, ולהישאר ההשפעות של גורמים שונים uncharacterized. השיטות תרבות נוכח נועדו כתובת זו במחסור בזמן אמת בניתוח הגורמים היעד.

במחקר הנוכחי, אנו מעקב אחר התפתחות הזקיקים באמצעות שיטת הדמיה בצילום מואץ, שאפיינה את תהליך התפתחות זקיק. השיטות הרומן שלנו מציעים כלי חסר תקדים עבור חוקר הפיזיולוגיה של השחלות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

עכברים שוכנו בחדר לסביבה מבוקרת על 23 ±1 ° C עם 12 שעות אור/12 h מחזור כהה. פרוטוקולי טיפול בבעלי חיים, ניסויים נערכו בהתאם להנחיות לניסויים בבעלי חיים-איצ'י הרפואי האוניברסיטאי, אושרו על ידי טיפול בעלי חיים היוצא ועל שימוש הוועדה.

1. הכנת תרבות בינוני ומנות

  1. כדי להכין בינוני תרבות בסיסיים, להוסיף סרום שור עוברית (FBS, 5% v/v), FSH (100 mIU/mL), LH (10 מו/mL), ו פניצילין-סטרפטומיצין (פניצילין, 100 U/mL; סטרפטומיצין, 100 מ"ג/מ"ל) אלפא בינוני חיוני מינימלי (MEM-אלפא), לערבב צינורות 50 מ ל.
    הערה: כרכים הכולל של מדיה תרבות הנדרשים משתנים בין ניסויים, אבל 1 מ"ל של תרבות בינוני מספיקה בדרך כלל 3.5 ס"מ זכוכית-התחתון תרבות מנות.
  2. שופכים 1 מ"ל aliquots מעורב בינוני תרבות לתוך 3.5 ס"מ זכוכית-התחתון תרבות מנות וקבע במקום 30 מ מ תא תרבות מוסיף לתוך מנות. לחמם מדיה ומנות בתוך אינקובטור (5% CO2 ו- 37 מעלות צלזיוס).

2. הכנת רקמות השחלה

  1. פוספט חם מראש buffered תמיסת מלח (PBS) (−) ו MEM-אלפא המכילה 5% FBS, פניצילין U/mL 100 ו- 100 מ"ג/מ"ל סטרפטומיצין בתוך אינקובטור (5% CO2 ו- 37 מעלות צלזיוס).
    הערה: לגבי 3 מ"ל aliquots של PBS (−) לאדם שחלה מספיק לשימוש במהלך ניתוח שחלה הינם 1 מ"ל aliquots של מאמ-אלפא מספיקים עבור אחסון ארעי של השחלות בודד במנות 3.5 ס"מ.
  2. בלו השחלות של עכברים ICR (על שם אחרי המכון לחקר הסרטן) נקבה 4 - בן שבועיים, לקצץ את הרקמות הסובבות את השחלה באמצעות פינצטה תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי ומספריים. להזמין את השחלות שהוסר במדיום תרבות (ראה שלב 2.1) עד השימוש.
    1. מקום בודד שחלות על גבי נייר סינון בסוידיש מראש חימם PBS (−) (ראה שלב 2.1) פרוסה לחתיכות 4 באמצעות סכין מיקרוטום תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי.
      הערה: השחלות של עכברים ICR 4 - בן שבועיים הן בערך 2 מ מ קוטר. מספר חתיכות תלוי בגודל השחלה; עם זאת, כ-500 מיקרומטר חתיכות עבות לאפשר זקיק נאות תצפיות (בחלקים עבה יותר 500 מ מ, שקיפות הרקמות הוא ירד; בחתיכות דק יותר 500 מ מ, זקיקים רבים antral הם שבור ואיבד).
    2. לאחר ניתוח, למקם את דגימות השחלה הפרוס בינוני תרבות ומחוממת מראש במנות 3.5 ס"מ (ראה שלב 2.1).

3. השחלה תרביות רקמה

  1. זרוק כ 0.5 µL של תרבות בינוני לכל פרוסים רקמות השחלה על תותב התרבות התא שבו רקמת השחלה יהיה להגדיר משתמש של micropipette.
  2. למקם את הדגימה הפרוס בכל טיפה של תרבות בינוני על התוספות התרבות התא באמצעות פינצטה.
  3. תרבות רקמות השחלה 5% CO2 ב 37 º C.
  4. החלף המדיום תרבות בינוני ומחוממת מראש טרי כל יומיים.
    הערה: לוח הזמנים עבור שינויים בינונית עבור התרבות של השחלה מקטעים של עכברים ICR 4 - בן שבועיים מוצג באיור1.
    1. כדי להתרבות גל LH, פנקו בתרבית השחלות עכברים ICR 4 - בן שבועיים עם המדיום המכיל 100 מו/mL FSH ו- LH במשך 12 שעות מדי 4 ימים (איור 1).

4. מיקרוסקופ תמונות של השחלות בתרבית

  1. להתחיל הדמיה השחלות בתרבית לאחר יום 1 כאשר הרקמות יש דבקה על התוספות התרבות תאים, ולבצע ניתוחים מיקרוסקופ קונפוקלי או הפוך במרווחי 24 שעות כדי לאפשר מספיק זקיק צמיחה בין נקודות זמן.
    הערה: מיקרוסקופיה קונפוקלית עדיפה מיקרוסקופ הפוכה להתבוננות זקיקים של השחלות לגמרי בתרבית.

5. זמן לשגות הדמיה של השחלות בתרבית

  1. למטב את התנאים הדמיה בצילום מואץ, כולל עוצמות לייזר ו פעמים חשיפה, עבור מערכת הדמיה (טבלה 1).
    1. בחר השחלה לזווג דגימות עכברים יחיד לשימוש כקבוצות טיפול ובקרה. משתנים בעוצמות לייזר וזמן חשיפה כדי להשיג את התמונות הטובות ביותר (טבלה 1).
    2. השווה זקיק צמיחה תחת כל תנאי התרבות על ידי מדידת תחומים זקיק בתמונות של דגימות הבקרה במרווחי זמן 24 שעות זמן לשגות דגימות הדמיה (ראה שלב 6). במקביל, לספור את מספר oocytes ovulated בערכת כל השחלה ובחרו את תנאים אופטימליים הדמיה בצילום מואץ.
  2. לכידת תמונות במרווחי 30 דקות באמצעות מערכת הדמיה בצילום מואץ בכפוף לתנאים נחוש (טבלה 1).

6. זקיק צמיחה ניתוח

  1. כדי לנתח את הפיתוח זקיק, למדוד את האזורים זקיק של תמונות שנלכדו באמצעות תוכנת ImageJ (http://resbweb.nih.gov/ij/).
    1. בתחילה, להגדיר את קנה המידה של התמונה על ידי לחיצה על "הגדרת סולם" תחת 'נתח' בסרגל כלי. הזן את אורכי בצד בתמונה שנלכדה והמספרים התואמים של פיקסלים בשדות הריקים של "מרחק ידוע", "מרחק בפיקסלים", בהתאמה.
    2. לחץ על "יד חופשית" בסרגל כלי ומיתאר הזקיקים של תמונות שנלכדו שדה בהיר.
    3. לחץ על "מדד" תחת 'נתח' בסרגל כלי.
      הערה: אם נתוני מדידה אחרים הם הרצויה, לחץ על "מדידה קבע" תחת 'נתח' בסרגל כלי ובדוק בתיבות המתאימות ברשימה.

7. ניתוח התפתחות זקיק באמצעות העכברים הטרנסגניים

  1. לאסוף השחלות כמחנכת ימים 0 ו- 4 (P0, P4) נקבה העכברים הטרנסגניים המכיל transgenes Oog1pro3.9 R26-ויזת עבודה H2B-mCherrואת תרבות על הוספת כפי שמתואר צעדים 1.1 – 3.2, חוץ מזה לא פרוסה P0, P4 השחלות.
  2. החלף את המדיום תרבות בינוני טריים, ומחוממת מראש במנות 3.5 ס"מ בתוך אינקובטור המכילה 5% CO2 ב 37 ° C כל יומיים.
    הערה: הריכוז של LH במדיום תרבות P0, P4 השחלות יכול להישאר קבוע בגלל עליות LH לא מתרחשות בעכברים P0, P4.
  3. הגדר את המיקרוסקופ להמחיש רק AcGFP1-חיוביות זקיקים העיקרי P4 בתרבית השחלות (טבלה 1).
    הערה: רק הקדמוני, ראשי זקיקי נמצאים P4 העכבר הנשי השחלות.
  4. לכידת תמונות של P0 בתרבית Oog1pro3.9/R26-ויזת עבודה H2B-mCherry השחלות העכברים הטרנסגניים במרווחים של 30 דקות שימוש את ההגדרות המשמשות P4 השחלות (ראה שלב 5.2).
  5. לאתר ולנתח זקיק פיתוח באמצעות אותות AcGFP1, ויזת עבודה H2B-mCHerry.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

איור 1 מציג את הפרוטוקול עבור השינויים בתקשורת במהלך השחלות תרביות רקמה. בעקבות תוכנית זו, בת 4 בשבוע ICR עכברים השחלות תרבותי, עם תמונה במרווחי 24 שעות ביממה באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית (איור 2). במהלך תרבות של רקמות השחלה למשך 3 שבועות, זקיקים antral ומשני ביותר היו מנוון מאת בהכנת זקיק, חלקם היו ovulated (איור 2D ו לטבלה 2). בניתוח של זקיק אזורים באמצעות ImageJ ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

במחקר זה, פיתחנו שתי שיטות חדשות ללימוד פיתוח זקיק של העכבר השחלות. השיטה הראשונה כרוכה תרבות של רקמות הפרוס עכברים בוגרים השחלות ואחריו ניתוח התפתחות זקיק, השנייה כרוכה בשימוש הדמיה בצילום מואץ להמחיש את התפתחות מוקדמת זקיק בשלב גונדוטרופין עצמאית. בעבר, אנחנו להשתמש בשיטת תרביות רקמה השחלה הנוכחי כדי להעריך את ההשפעה של לוקמיה מעכבות פקטור ופרוגסטרון על זקיק פיתוח8,9, ולא הראה כי ההשפעות שלהם משתנות עם שלב הריכוז ואת זקיק. במחקר הנוכחי, פרוסים רקמות השחלה הציג ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף.

תודות

אנו מודים Naojiro ד ר אמסטרדם (אוניברסיטת קיוטו) על מתן העכברים Oog1pro3.9 . מחקר זה נתמך על ידי את JSPS (KAKENHI # JP15H06275) ושל קרן Nitto.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
הורמון מגרה זקיק מיותרת המוח האנושיתSIGMAF4021
הורמון לוטניזציה מיותרת המוחSIGMAL9773
תמיסת פניצילין-סטרפטומיציןWako Pure Chemical Industries168-23191
MEM a, GlutaMax, ללא נוקלאוטידיםתרמו פישר32561037
צלחת תחתונה מזכוכיתMatTekצלחת P35G-0-10-C35 מ"מ, כיסוי מס' 0, קוטר זכוכית 10 מ"מ
הכנסת תרבית תאים מילי-תא MerckMilliporeקוטר PICM0RG50: 315 מ"מ, גודל נקבוביות: 0.4 מ"מ, חומר: הידרופילי PTTE
3.5 ס"מ כלי תרבית תאיםגריינר ביו-וואן627160
50 מ"ל / צינור צנטריפוגה עם מכסה איטום משולשIWAKI2345-050
להבים חד פעמיים בפרופיל נמוך 819Leica14035838925
LSM 710Carl Zeissמיקרוסקופ קונפוקלי
CellVoyager, CV1000Yokogawa Electric Corporationהדמיית זמן-lapse
BZ-X700KEYENCEהדמיית Time-lapse

מקורות

  1. Myers, M., Britt, K. L., Wreford, N. G., Ebling, F. J., Kerr, J. B. Methods for quantifying follicular numbers within the mouse ovary. Reproduction. 127 (5), 569-580 (2004).
  2. Adams, G. P., Jaiswal, R., Singh, J., Malhi, P. Progress in understanding ovarian follicular dynamics in cattle. Theriogenology. 69 (1), 72-80 (2008).
  3. Palma, G. A., et al. Biology and biotechnology of follicle development. Sci World J. , (2012).
  4. Knight, P. G., Glister, C. TGF-beta superfamily members and ovarian follicle development. Reproduction. 132 (2), 191-206 (2006).
  5. Picton, H. M., Harris, S. E., Muruvi, W., Chambers, E. L. The in vitro growth and maturation of follicles. Reproduction. 136 (6), 703-715 (2008).
  6. Spears, N., de Bruin, J. P., Gosden, R. G. The establishment of follicular dominance in co-cultured mouse ovarian follicles. J Reprod Fertil. 106 (1), 1-6 (1996).
  7. Baker, S. J., Srsen, V., Lapping, R., Spears, N. Combined effect of follicle-follicle interactions and declining follicle-stimulating hormone on murine follicle health in vitro. Biol Reprod. 65 (4), 1304-1310 (2001).
  8. Komatsu, K., et al. Analysis of the Effect of Leukemia Inhibitory Factor on Follicular Growth in Cultured Murine Ovarian Tissue. Biol Reprod. 93 (1), 18(2015).
  9. Komatsu, K., Masubuchi, S. The concentration-dependent effect of progesterone on follicle growth in the mouse ovary. J Reprod Dev. 63 (3), 271-277 (2017).
  10. Murase, T., et al. Follicle dynamics: visualization and analysis of follicle growth and maturation using murine ovarian tissue culture. J Assist Reprod Genet. , 1-5 (2017).
  11. Ishida, M., et al. The promoter of the oocyte-specific gene, Oog1, functions in both male and female meiotic germ cells in transgenic mice. PLoS One. 8 (7), 68686(2013).
  12. Minami, N., et al. Oogenesin is a novel mouse protein expressed in oocytes and early cleavage-stage embryos. Biol Reprod. 69 (5), 1736-1742 (2003).
  13. Nilsson, E. E., Skinner, M. K. Growth and differentiation factor-9 stimulates progression of early primary but not primordial rat ovarian follicle development. Biol Reprod. 67 (3), 1018-1024 (2002).
  14. Nilsson, E. E., Kezele, P., Skinner, M. K. Leukemia inhibitory factor (LIF) promotes the primordial to primary follicle transition in rat ovaries. Mol Cell Endocrinol. 188 (1-2), 65-73 (2002).
  15. Nilsson, E. E., Skinner, M. K. Bone morphogenetic protein-4 acts as an ovarian follicle survival factor and promotes primordial follicle development. Biol Reprod. 69 (4), 1265-1272 (2003).
  16. Nilsson, E. E., Skinner, M. K. Kit ligand and basic fibroblast growth factor interactions in the induction of ovarian primordial to primary follicle transition. Mol Cell Endocrinol. 214 (1-2), 19-25 (2004).
  17. Abe, T., et al. Establishment of conditional reporter mouse lines at ROSA26 locus for live cell imaging. Genesis. 49 (7), 579-590 (2011).
  18. Lan, Z. J., Xu, X., Cooney, A. J. Differential oocyte-specific expression of Cre recombinase activity in GDF-9-iCre, Zp3cre, and Msx2Cre transgenic mice. Biol Reprod. 71 (5), 1469-1474 (2004).
  19. Payer, B., et al. Generation of stella-GFP transgenic mice: a novel tool to study germ cell development. Genesis. 44 (2), 75-83 (2006).
  20. Ohinata, Y., Sano, M., Shigeta, M., Yamanaka, K., Saitou, M. A comprehensive, non-invasive visualization of primordial germ cell development in mice by the Prdm1-mVenus and Dppa3-ECFP double transgenic reporter. Reproduction. 136 (4), 503-514 (2008).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Time lapseImageJFSH LHmCherry
תרביות רקמה השחלות כדי לחזות תופעות העכבר השחלה
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.