חקר את הפוטנציאל של תא גזע Mesenchymal גיליון על הפיתוח של קרצינומה Hepatocellular In Vivo

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לפתח ויוו סרטן מודל של שימוש בטכנולוגיית תאי גליון. מודל כזה יכול להיות מאוד שימושי עבור הערכת הרפוי נגד סרטן.

Abstract

אין ויוו במודל חיה המחקה סרטן אנושי יכול להיות יישומים שונים המספקים מידע קליני משמעותי. משמש כיום הטכניקות לפיתוח ויוו סרטן דגמים יש מגבלות ניכר. לפיכך, במחקר זה, אנו שואפים לממש בטכנולוגיית תאי גליון לפתח מודל סרטן ויוו . קרצינומה Hepatocellular (HCC) מפותחת בהצלחה בחולדות עירום באמצעות גליונות התא שנוצר מתאי השורה תא HCC. הסדינים התא סרטן שנוצרו באמצעות אדהזיה תאיים ויצירת מבנה מרובדת, נשלט על ידי מטריצות. דבר זה מאפשר השתלת גיליון HCC לתוך הכבד ויצירת מודל בעלי חיים נושאות תוך חודש. בנוסף, חקר את התפקיד של גזע mesenchymal (MSC) בפיתוח של מודל זה סרטן. בנוסף הגיליון קו תא HCC, נוצרים עוד תא שני גיליונות: גיליון HCC תאי מח עצם MSCs (BMMSCs) ואת גיליון של תאים HCC, חבל הטבור MSCs (UCMSCs). הגליונות אשר יש שילוב של תאים HCC והן MSCs הם גם מסוגלים לייצר חיה נושאות. עם זאת, התוספת של MSCs מקטין את גודל הגידול בנוי, זו השפעה שלילית על התפתחות גידולים משתנה בהתאם למקור של MSCs בשימוש. אפשרות זו מציינת כי גיליון תא העשוי מסוימת יחוברו MSC יכול להיות מנוצל שליטה וניהול של הגידול.

Introduction

HCC הוא סרטן ראשוני של הכבד, קשורה באופן משמעותי עם פרוגנוזה גרועה. מדי שנה, כמעט חצי מיליון חולים חדשים מאובחנים עם HCC, המייצג 85% של סרטן הכבד בחולים ברחבי העולם¹. Hepatocarcinogenesis אינה מחלה אחת-טופס; ליתר דיוק, זה אוסף של מחלות בעלי תכונות שונות histopathological ולשינויים גנטיים ולא גנומית, בנוסף מגוון תוצאות prognostic¹. לכן, האתגרים העיקריים בהתפתחות של אסטרטגיית טיפולית יעילה עבור HCC הן את הידע מוגבל לביולוגיה HCC וחוסר מודל ניסיוני מתאימים בעלי חיים שיכולים לעזור להבין זו מחלה מורכבת. אין ויוו במודל חיה המחקה סרטן אנושי הוא הכרחי עבור בחירת המועמד גנים וזיהוי סמנים prognostic/ניבוי ערבו אינדוקציה סרטן, כמו גם על חקירת גורמים שונים שעשויים להשפיע על סרטן תגובות לסוכנים טיפולית.

מחקרים במבחנה סרטן משויכות עדיין מגבלות הגדולות. זה בשל העובדה כי התאים הסרטניים לאבד תכונות רבות שלהם ויוו כאשר נשמר בתרבות. השינויים שמתרחשים תאי במבחנה תוצאה של העדר רקמות כל הפיזיולוגיה באווירה ex-vivo . סרטן-לתא אינטראקציה (סטרומה, המערכת החיסונית, להערכת, אפיתל, וכו ') בתוך microenvironment הגידול משקף במידה רבה על סרטן התא מאפיינים². Microenvironment הגידול יכול לשנות ביטוי גנים/חלבון התא סרטן ומאפיינים פנוטיפי, בנוסף angiogenetic ואת פוטנציאל גרורתי. מערכת התרבות דו-ממדית (2-D) במבחנה חסרה גם מטריצה רקמות מתאים, אשר הכרחי לווסת את התקדמות הגידול. לפיכך, בשל מגבלות אלו, מודלים ויוו צריך תמיד להיות מנוצל כדי לתמוך ממצאים ראשוניים של מודלים במבחנה . במחקר זה, אנו משתמשים בטכנולוגיית תאי גליון לפתח ויוו במודל חיה זה elucidates את התהליך הביולוגי המלא שבבסיס HCC.

לפני יותר מעשור מעבדה של Okano הוקמה שיטה של הנדסת רקמות, המבוסס על טכנולוגיית תא גליון³. שיטה זו משתמשת פלסטיק תרבות מגיבים תרמו כדי לאפשר הפיכה תא אדהזיה/ניתוק על ידי שליטה על פני השטח hydrophobicity. שיטה זו מאפשרת קציר עדין של תאים בתרבית בתבנית ללא פגע תלת-ממדיים (3-D) (גיליון i.e.,cell), עם מטריצה חוץ-תאית מטופחים (ECM) ואינטראקציות מתא לתא. הטכניקה גיליון תא מחייב את precoating של תרבות מנות עם poly(N-isopropylacrylamide) טמפרטורה-מגיבה פולימר (אני פיפה), וזו מסחרית זמינים ומוכנים לשימוש. בטמפרטורה מתחת 20 ° C, פולימרים פיפה אני להפוך להתייבש, להמיס פתרונות מימית, ואילו, בטמפרטורה גבוהה (37 מעלות צלזיוס), פולימרים להתייבש, להפוך התמיסה עכורים. הפולימר מכיל אמיד הידרופילית שרשראות הידרופוביות לצד רשתות (איזופרופיל קבוצות). בטמפרטורות גבוהות, תנועה בראונית של מולקולות מים מתעצמת, הואיל בטמפרטורה נמוכה, מולקולות המים המקיפים את קבוצות איזופרופיל של פירוק מבנה רטוב וקבוצות איזופרופיל הידרופובי צבירה בגלל אינטראקציות הידרופוביות. לכן, כל שרשרת הפולימר אגרגטים, ארגונייט שוקע⁴.

במסגרת המחקר הציג, בטכניקה זו משתמשים לפתח מודל חיה HCC באמצעות שלושה גליונות תאים שונים. הגיליון הראשון מועסקים מורכב HCC תא שורת תאים בלבד, בעוד ששני הדפים האחרים מורכבים של שילוב של HCC תא שורת תאים MSCs משני מקורות שונים: MSCs במח העצם (BMMSCs) ו- MSCs הטבור (UCMSCs). MSCs הם הלא-hematopoietic סטרומה תאים המסוגלים המבדילים intocell נגזרות של השושלת mesenchymal, כולל adipocytes, osteocytes, chondrocytes ונייטרלים⁵. הסיבה שאנו מעסיקים תאים אלה בעת יצירת גליון התא סרטן היא תפוקתב לא עקבית על ההשפעה של MSCs על סרטן. הוצע כי MSCs יכולים להיות שני פנוטיפים שונים: "MSC1", הפנוטיפ proinflammatory, ו- "MSC2", פנוטיפ לדיכוי המערכת החיסונית⁶. MSCs מבטאים קולטנים כמו אגרה (TLRs). TLR4 לקרקע של MSCs מגביר את הפרשת גורמים proinflammatory, ואילו לקרקע TLR3 מגביר את הפרשת גורמים לדיכוי המערכת החיסונית⁶. המחקר במבחנה של פנוטיפים שני אלה דיווחו כי תרבות משותפת של MSC1 עם שורות תאים סרטן הקלוש צמיחת תאים של סרטן, בעוד תרבות משותפת MSC2 היה את האפקט ההפוך⁷. זה מרמז כי MSCs יכול להיות סרטן בעד או נגד סרטן, בהתאם פנוטיפ שלהם. לכן, בנוסף פיתוח המודל בעלי חיים HCC בטכנולוגיה גיליון תא, אנחנו רוצים לחקור את ההשפעה של השתלות MSC על התפתחות גידולים, ואם באמצעות תאים אלה להגביר או להפחית את התפתחות מודל זה.

Protocol

הפרוטוקול מנחים את טיפול בבעלי חיים של הוועדה האתית של אוניברסיטת המלך סעוד. ניתוחים, הרדמה, תרופות אחרות בשימוש בבעלי חיים המאושרים על ידי הוועדה האתית של אוניברסיטת המלך סעוד. כל עבודה ניסויית מתבצע על ידי צוות מיומן כראוי.

1. תא גליון בנייה

1. מעיל המנות תרבות (מנות תרבות טמפרטורה מגיב 3.5 ס מ) עם סרום שור עוברית (FBS) מדולל ולהבטיח כדי לכסות את כל השטח של המנה.
   הערה: שלב זה הוא חשוב עבור הניתוק של הגיליון תא מאז זה תומך את הצמיחה של התאים טפט ומונע צבירת התא.
2. דגירה הכלים במשך 24 שעות ביממה ב 37 מעלות צלזיוס באווירה humidified, המכילה 5% CO₂ ו- 95% אוויר.
3. להסיר את עודף FBS כלים מצופים ולאפשר את הכלים לייבוש בטמפרטורת החדר (RT) במשך לפחות שעה.
4. להכין את המתלים שלושה תאים: תאים⁶ HepG2 עונה 1 פרק 10 עונה 1 פרק 10⁶ HepG2 תאים עם BMMSCs, עונה 1 פרק 10⁶ HepG2 תאים עם UCMSCs (ביחס של 4:1 גם BMMSCs וגם UCMSCs).
5. זרע ההשעיה תאים מתאים על כל מנה עם תוויות.
6. להשעות כל התאים במדיום תרבות DMEM, בתוספת 10% FBS ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין.
7. דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס באווירה humidified, המכילה 5% CO₂ ו- 95% אוויר.

2. תא גליון התנתקות

1. ב- 100% תא הנהרות, לקחת את הכלים מתוך החממה 37 º C.
2. דגירה המנה גיליון תא HepG2 עבור h 1-RT, בעוד המקננת על HepG2/BMMSC ומנות HepG2/UCMSC תא גיליון 30-40 דקות ב- 20 ° C באווירה humidified, המכילה 5% CO₂ ו- 95% אוויר.
   הערה: הגיליון תא זני רק HepG2 שברירי; להקטין את הטמפרטורה עד 20 ° C גורם נזקים למבנה של הגיליון.

3. ביצוע הליך כירורגי

הערה: במהלך זמן הדגירה עבור הניתוק גיליון תא, תתחילי בטיפול בבעלי חיים.

1. הוראות הכנה של אזור הניתוח
   1. לנהל את כל הניתוחים באזור נפרד סטרילי בתוך המעבדה, כגון ברדס, זרימה שכבתית ארון או חדר ניתוח אספטי. להבטיח כי כל המשטחים של אזור הניתוח שאינו נקבובי, אטום, עמידה sanitizable.
   2. ללבוש ציוד מגן מתאים, כולל חלוק, כפפות, מסכות של כיסויי הראש ואת הנעל.
   3. שימוש כירורגית כלי זה הם סטיריליים ונקייה (via autoclaving; גזע רווי בלחצים גבוהים) בתחילתו של הניתוח.
   4. לשנות כפפות בין חולדות.
2. הכנה של החיה לניתוח
   1. השתמש חולדות עירום 8 ל 12-בת.
   2. צור בזריקות הרדמה על חולדות.
      1. כדי להכין את הפתרון הרדמה, חריגות קטמין-השירותים הווטרינריים, לערבב 2 מ"ל של קטמין, 1 מ"ל של חריגות השירותים הווטרינריים (על ריכוז של 20 מ"ג/מ"ל) ו- 1 מ ל תמיסת סטרילית הפיזיולוגיות (למשל, 0.9% נתרן כלורי) בבקבוקון אוסף סרום 10-mL סטרילי, לנער היטב לפני השתמש.
      2. כדי להחיל הרדמה, להזריק 0.2 מ"ל של הפתרון קטמין-חריגות השירותים הווטרינריים לכל 100 גרם של משקל הגוף של העכברוש intraperitoneally.
         הערה: המינון הכולל של הפתרון הוא 100 מ ג/ק ג של קטמין ו- 10 מ"ג/ק"ג של חריגות השירותים הווטרינריים.
   3. הסר העפר גלוי/פסולת באתר כירורגית.
   4. בדוק את עומק הרדמה על ידי בוחן את רפלקס הנסיגה פדלים (צביטה כרית כף הרגל בשתי הרגליים האחוריות).
      הערה: אם בלחץ כרית כף הרגל גורם לתגובה, חזור במינון של 0.05 גרם/100 גרם (כ כל 30 דקות) ולאחר מכן בדוק את עומק הרדמה.
   5. לחטא באזור הניתוח עם שיפשופים בשני שלבים מאת povidone-יוד/אלכוהול איזופרופיל.
   6. מכסים את העכברוש עם תלוי סטרילי כדי למנוע זיהום של החתך.
   7. להחדיר את החולדות subcutaneously הבופרנורפין (0.01 - 0.05 מ"ג/ק"ג)⁸ לפני קבלת את החתך.
   8. באמצעות אזמל סטרילי, להפוך 7 - ל ס מ-10 לחתוך בין פריטי מעטפת השרירים שמתחת כדי לחשוף את הכבד.
      1. הפרד את שריר הבטן מן העור עם הקצה האחורי השטוח של האזמל.
      2. בזהירות לדקור לינאה אלבה באמצעות אזמל ולהרחיב גזירה במספריים חדים.

4. השתלת גיליון תא

הערה: השתלת גיליון תא מתבצע על הכבד.

1. לאסוף את הגיליון תא המנה תרבות.
   1. טפח בעדינות את המנה תרבות מעל הספסל כדי לנתק את הסדין מפני-השטח.
   2. הפרד את הגיליון תא ממשטח של המנה על ידי גירוד קצה הסדין במעגל חצי באמצעות טיפ פיפטה סטרילי.
   3. הסר בעדינות את המדיום כולו מתוך קערה תרבות.
   4. להבטיח הגיליון שלם ללא נזק; אחרת, זה לא יכול להיות בשימוש (איור 1).
      הערה: ניתן להבחין הסדינים שנוצר ישירות באמצעות העין.
2. להכין את קרום סטרילי (נייר סינון) כדי לקצור את הגיליון תא מתוך קערה.
   1. ראשית, משרים את הקרום עם תמיסת מלח. לאחר מכן, הסר את תמיסת המלח עודף עם כרית כותנה סטרילי.
   2. הצב קרום רטובה מעל הסדין התא, תוך הימנעות רוחביים בועות אוויר בין הקרום ואת הסדין תא.
   3. הוסף מספר טיפות של תמיסת מלח מעל הקרום ואת הסדין תא כדי לאסוף אותם יותר קל.
      הערה: כדי למנוע את שבירת הגיליון תא, לא להשתמש תמיסת מלח קר והרם את הקרום ואת הסדין תא עם מלקחיים.
   4. השאר הקרום לכמה שניות להבטיח כי הגיליון תא מחובר כראוי למוח ולאחר מכן לאסוף אותו.
3. היכונו הכבד השתלת גיליון תא.
   1. ודא כי השטח הכבד הוא יבש על ידי בעדינות טפיחות עם כרית כותנה סטרילי.
   2. בעזרת מלקחיים סטרילי, הצב את הקרום עם הסדין תא מעל אונת הכבד של החולדה יחיד.
   3. הוסף מספר טיפות של תמיסת מלח סטרילית ולהחיל לחץ עדין על קרום כדי לנתק את הגיליון תא ממנו.
   4. המתן 5 דקות לפני הסרת בזהירות את הקרום.
      הערה: פעולה זו מתבצעת על מנת להבטיח שהגיליון תא מחובר כראוי אל הכבד.
   5. לבסוף סוגרים את השרירים המשמשים כבסיס, העור החתכים בתפרים ניילון 5-0.
   6. לחטא את האזור ניתוח עם povidone יוד.
      הערה: איור 2 מציג תרשים של ההליך השתלת תאי גליון על הכבד של עכברוש עירום.

5. לאחר הניתוח טיפול

1. מיד לאחר הניתוח, בית העכברוש בנפרד כדי להימנע קניבליזם או חנק, ולנטר אותה באופן קבוע (לפחות כל 15 דקות) עד שזה המודעים והבלתי מודעים, מהיותו באופן מלא.
2. לאחר מכן, להעריך את החולדות מדי יום עבור 5-14 d, לפחות 5 d וכאב לאחר הניתוח, כדי להבטיח שלא יהיו שום סיבוכים. במהלך המבדק יומי, ודא מהפעולות הבאות.
   1. הפצע סגור, התפרים שלמים, בלי להיות הדוקה יתר על המידה.
   2. ישנם סימנים של זיהום באזור הניתוח, כגון חום, עודף הפרשות נפיחות או מוגלתי.
   3. ישנם סימנים הקשורים לכאב, כגון ירידה בצריכת מזון ומים, ירידה במשקל, התייבשות, העור להקים אוהל או נשימה מהירה, פתח את הפה. כדי לשלוט מתון עד חמור כאב לאחר הניתוח, אם בכלל, להזריק החולדות subcutaneously הבופרנורפין (0.01 - 0.05 מ"ג/ק"ג) כל 6-8 h⁹ מינימום של 48-72 h במשככי.

6. ניתוח של האזור המושתלים

1. חודש אחד לאחר ההשתלה, scarifice החולדה ולאסוף את האזור המושתלים היסטולוגית וניתוח immunohistochemical.

Results

Tumorigenicity של התאים המושתלים גיליונות בחולדות:

חודש אחד לאחר ההשתלה, כל גיליונות התאים המושתלים כבדי של חולדות פיתחו גידולים (איור 3). הגודל הממוצע של גידולים מפותחים של HepG2, HepG2/BMMSC HepG2/UCMSC תא הסדינים היו 4.5 ס מ 4 ס מ, 2.5 ס מ, בהתאמה¹⁰.

ניתוח היסטולוגית של רקמות הכבד:

Discussion

כמות נרחבת של המחקר מוקדש להתפתחות נאותה ויוו פרה במודל חיה הדומה סרטן אנושיים. כיום, הגישות העיקריים המשמשים ליצירת מודלים בעלי חיים סרטן כרוך השתלת הנדסה גנטית ותא¹¹. מודלים מהונדס גנטית הם כלים טובים עבור זיהוי ואימות של גנים היעד, כמו גם להבין את המנגנונים המולקולריים שבבסיס רעילות תחת השפעת סמים. לעומת זאת, מודל זה מזוהה עם כמה מגבלות; למשל, השינוי של גן מסוים לא תמיד התוצאה הצפויה פנוטיפ¹². הגישה השתלת תאים נפוץ יותר כדי לגרום לסרטן בבעלי חיים, זה כרוך ההזרקה...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
<ריאגנטים חזקים>;
FBS	Gibco/Invitrogen	10270106
DMEM גלוקוז גבוה	סיגמא	D5671-500 מ"ל
פניצילין/סטרפטומיצין	Life Technology	15070063
תמיסת מלח פיזיולוגית סטרילית	Sigma	S0817-1GA
קו תאי HepG2 אנושי	ATCC, ארה"ב	HB-8065
קו תאים MSCs מח עצם אנושי	PromoCell, ארה"ב	C-12974
רקמת חבל טבור אנושית MSCs	PromoCell, ארה"ב	C-12971
קטמין 50%	רומפון, באייר
קסילזין 2%	רומפון	23076-35-9
Alphadine®   תמיסה.	ריאד פארמה	LBL0816
<חזק>חד פעמי:
15 מ"ל פוליפרופילן בהירות גבוהה צינור צנטריפוגה PP בז
3.5 ס"מ סטרילי כלי תרבית UpCell סטריליים עם נייר סינון (ממברנה)	Sigma	174904-1CS
100-1000 & מיקרו; l   טיפים לפיפטה	סיגמא	CLS4868-1000EA
נוהל בסיסי וילון	תרמופישר	PMD5293.0
<חזק>ציוד
פלוס, נפח משתנה	Eppendorf®   מחקר ו-reg;	Z683779-1EA
אינקובטור תרביות רקמה 37 מעלות; C, 5% CO2כל	מותג
ארון בטיחות ביולוגי	כל מותג
חממת תרביות רקמות 20 & deg; C, 5% CO2כל	מותג
כלים כירורגיים סטריליים וחולדות עירומות:
מספריים
מלקחיים
תפר ניילון  5-0	Accutome	AB-3854S	מונופילמנט, Lancet
1 מ"ל מזרקי טוברקולין	פישר סיינטיפיק	14-826-88
חולדות עירומות	Charles נהר