נתאר החילוץ בקנה מידה קטן שונה ואת מבחני ערכי צבע מוחלטים של ו לקטט פירובט ב תולעים נימיות C. elegans. כאשר ניצול מסחרי assay ערכות, פיתוח טכני של הרגישות והדיוק שלהם חשובה. חלבון משקעים החילוץ הוא השלב הקריטי ביותר של הקביעה כמותית של מטבוליטים תאיים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
ערכי צבע מוחלטים מבחני של תאיים לקטט בקנה מידה קטן ו פירובט ב נמטודות Caenorhabditis elegans
במאמר זה
סיכום
תקציר
לקטט פירובט intermediates מפתח של מסלולים מטבוליים אנרגיה תאיים בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. פיקוח על היחס לקטאט/פירובט בתאים מסייעת כדי לקבוע אם קיים חוסר איזון בחילוף החומרים האנרגיה הקשורות לגיל בין זרחון חמצוני מיטוכונדריאלי גליקוליזה אירובי. כאן, אנו מראים את הניצול של ערכות assay ערכי צבע מוחלטים מסחרי ו לקטט פירובט באורגניזם מודל C. elegans. לאחרונה, הרגישות והדיוק של ערכות ערכי צבע מוחלטים/fluorimetric assay שופרו במידה רבה על ידי מחקר ופיתוח בניצוחו של ריאגנט יצרנים. ריאגנטים משופרת אפשרו את השימוש מבחני בקנה מידה קטן עם צלחת 96-ובכן C. elegans. באופן כללי, וזמינותו fluorimetric עדיפה על רגישות וזמינותו ערכי צבע מוחלטים; עם זאת, הגישה ערכי צבע מוחלטים מתאים יותר לשימוש במעבדות נפוצות. בעיה חשובה נוספת ב אלה מבחני לקביעת כמותית היא חלבון משקעים של הומוגני C. elegans דגימות. בשיטה שלנו חלבון משקעים, precipitants משותף (למשל., חומצת חומץ טריכלור, חומצה על-כלורית, חומצה metaphosphoric) משמשים עבור הכנת הדוגמא. מדגם assay נטול חלבון מוגש על-ידי הוספת ישירות קר precipitant (ריכוז הסופי של 5%) במהלך המגון.
מבוא
ריכוז ו לקטט פירובט נחשבים נרחב intermediates של חילוף החומרים האנרגיה, קשורים לארצות הברית גליקוליזה, חומצה tricarboxylic (TCA) מחזור ו תחבורה אלקטרונים בשרשרת בתאים של אורגניזמים אירוביים. סדרה של תגובות בגליקוליזה נישחק גלוקוז כדי פירובט, אשר שוכנת בצומת דרכים מטבולית, ניתן להמיר פחמימות באמצעות גלוקונאוגנזה, חומצות שומן, חילוף החומרים האנרגיה באמצעות אצטיל קואנזים a, את אלנין חומצה אמינית. מחזור TCA מתרחשת תחת הנוכחות של מספיק חמצן מומס, והוא היסוד עבור ההמרה של גלוקוז לאנרגיה. במיוחד, משינוי של חילוף חומרים משני הוא תופעה מעניינת שבה גליקוליזה משמשת בעיקר לייצור אנרגיה והוא אירובי נשימה מיטוכונדריאלי, אשר מערבת את מחזור TCA ושרשרת אלקטרון תחבורה, downregulated סר....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. מסונכרנים תרבות של C. elegans
- לפני זריעה, תרבות Escherichia coli (e. coli) זן OP50 בין לילה ב- 37 מעלות צלזיוס ב 300 מ ל מרק לוריא-Bertani (LB) בינוני נוזלי. לאחסן את OP50 בתרבית ב-4 ° c
- כדי להפוך את LB מרק נוזלי בינוני, השתמש 10 גר' טריפטון, 5 גר' תמצית שמרים, 10 גרם של NaCl ו 1.5 מ ל 1 N NaOH ולאחר להוסיף 1 ליטר מים יונים. אוטוקלב.
הערה: OP50 ו- C. elegans זנים זמינים מן המרכז גנטיקה Caenorhabditis (אוניברסיטת מינסוטה, סנט פול, MN, ארה ב).
- כדי להפוך את LB מרק נוזלי בינוני, השתמש 10 גר' טריפטון, 5 גר' תמצית שמרים, 10 גרם של NaCl ו 1.5 מ ל 1 N NaOH ולאחר להוסיף 1 ליטר מים יונים. אוטוקלב.
- כדי להפוך את הצמיחה נמטודות בינוני (NGM) אגר, השתמש דור 3 של NaCl, 2.5 גר' peptone, 17 גרם אגר, 975 מ ל מים יונים. אוטוקלב. מגניב עד 55 ° C, אז ste....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
באמצעות מבחני את ערכי צבע מוחלטים לקביעת ריכוזים ו לקטט פירובט כמותית, הראנו את הדיוק של אלה מבחני לעומת דוחות הקודם ב- C. elegans7,8. כאן, התהליך של חלבון משקעים במהלך חילוץ מדגם היה השלב המכריע ביותר כדי להפיק ערכים מדויקים. עבור חלבון משקעים, precipitants נפוצות (למשל., TCA, PCA, או חומצה metaphosphoric) ניתן להשתמש כדי להכין את הבדיקה דוגמאות (איור 1). ב- C. elegans, עם .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
כאשר ניצול ערכות אלה assay ערכי צבע מוחלטים, השלב הקריטי ביותר מדגם החילוץ כדי לזהות לקטט הסלולר ו פירובט במדויק ב- C. elegans הוא התהליך של חלבון המדידות המגון (איור 1). . זה לא הכרחי כדי להשתמש מהמגן טפלון, כמו אחרים לטקס (למשל., דאונס, צמצום מטחנות רקמות או חרוז מילס) מתאימים אף הם החילוץ בקנה מידה קטן של תולעים. אנחנו לא זיהה לקטט הסלולר ו פירובט בדגימות מבחן זה חולצו באמצעות מהמגן לפני חלבון משקעים. יתר על כן, רמות ו לקטט פירובט ירד באופן דרסטי בחודש השבר cytosolic מופ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.
תודות
עבודה זו מבחינה כלכלית נתמך על ידי מענק מחקר מיוחד מאוניברסיטת Bunka Daito אל Sumino Yanase.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| ערכת בדיקה קולורימטרית/פלואורמטרית לקטט | BioVision | #K607-100 | בדיקות קולורימטריות/פלואורימטריות 100; אחסן ב-20oC |
| EnzyChrom Pyruvate ערכת בדיקה | BioAssay Systems | #EPYR-100 | בדיקות קולורימטריות/פלואורומטריות 100; יש לאחסן ב-20oC |
| BCA Protein Assay | Kit Thermo Scientific | #23225 | מבחן קולורימטרי; יש לאחסן ב טמפרטורת החדר |
| חומצה טריכלורואצטית | Wako Pure Chemical | #207-04955 | יש לאחסן בטמפרטורת |
| החדר הומוגנייזר טפלון | Iwaki/Pyrex | #358034 (Wheaton) | במקום Iwaki/Pyrex, זמין על ידי Wheaton |
מקורות
- Warburg, O. On the origin of cancer cells. Science. 123, 309-314 (1956).
- Matoba, S., et al. p53 regulates mitochondrial respiration. Science. 312, 1650-1653 (2006).
- Yanase, S., Suda, H., Yasuda, K., Ishii, N.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
