בגישה מוטגנזה מכוונת רוויה הרומן: אפיון צעד בודד של חלבון תקינה מחייב אתרים ב- RNA באמצעות Phosphorothioates

סיכום

חלבונים שקושרים רצפי RNA ספציפיים ממלאים תפקידים חיוניים בביטוי הגנים. אפיון מפורט של אתרים אלה מחייב חיוני להבנת הכונה. . הנה, מתואר בגישה צעד אחר צעד עבור מוטגנזה מכוונת רוויה מהאתרים מחייב חלבון ב RNA. גישה זו היא רלוונטית עבור כל האתרים מחייב חלבון ה-RNA.

תקציר

הכונה ממלא תפקיד חשוב בהתפתחות. רבים DNA ו RNA-מחייב חלבונים לאגד והרצפים שלהם מטרה עם ירידה לפרטים גבוה כדי לשלוט ביטוי גנים. אלה חלבוני בקרת ביטוי גנים ברמה של DNA (תמלול) או ברמה של RNA (pre-mRNA שחבור פוליאדנילציה, תחבורה mRNA, ריקבון, תרגום). זיהוי של רצפי הרגולציה מסייעת להבין לא רק איך הגן הוא החליף או ביטול, אלא גם אילו גנים במורד הזרם מוסדרים על ידי חלבון רגולטורי מסוים. כאן, אנו מתארים גישה חד-שלבית המאפשר רווית מוטגנזה מכוונת של אתר איגוד חלבון ב- RNA. זה כרוך סימום תבנית ה-DNA עם הלא-פראי-סוג נוקלאוטידים בתוך האתר מחייב, סינתזה של RNAs נפרד עם כל נוקלאוטיד phosphorothioate, ובידוד של השבר מאוגד בעקבות הדגירה עם חלבונים. ההפרעות נוקלאוטידים שאינם-פראי-סוג התוצאה שלהם תצדיק השבר חלבון מכורך מועדף. זה נמצא בפיקוח בג'ל בעקבות סלקטיבי כימי המחשוף בעזרת יוד של איגרות חוב phosphodiester המכילים phosphorothioates (phosphorothioate מוטגנזה מכוונת או PTM). גישה מוטגנזה מכוונת זו צעד אחר צעד רוויה ישימה על האפיון בכל אתר איגוד חלבון ב- RNA.

מבוא

הכונה ממלא תפקיד חשוב בביולוגיה. יכול להיות מוסדר גנים ברמה של שעתוק החדרת ה-pre-mRNA, היווצרות קצה 3', RNA ייצוא, תרגום, לוקליזציה mRNA, ריקבון, שינוי post-translational/יציבות, וכו שני חלבונים DNA ו RNA-מחייב ממלאים תפקידי מפתח בגן תקנה. בזמן ניתוח גנטי מולקולרי זיהו חלבוני רבים, רק תת קבוצה קטנה של אותם כבר שאפיינו מלא תאיים או איגוד אתרים בתוך vivo. ניתוח פילוגנטי רצף מוטגנזה מכוונת מציעים גישות משלימות לאפיין DNA או RNA-חלבונים.

RNA-מחייב חלבונים חשובים בתהליכים התפתחותיים, כולל בידול המיניות. החלבון דרוזופילה סקס קטלני (SXL) או החלבון סקס מאסטר-switch נעדר זכרים, אבל המתנה אצל נקבות. הוא מזהה רצפי uridine-עשיר או פירימידין-ספינלי סמוכים לאתרי splice ספציפי במטרות במורד הזרם pre-mRNA (שנאי, סקס קטלני, ו lethal2 זכר ספציפי) תאים סומטיים^{1,2 3, ,4}. בנוסף, זה מסדיר האתר פוליאדנילציה מיתוג באמצעות קשירה uridine-עשיר פוליאדנילציה רצפים משפר ב-^5,התעתיק⁶ משפר של בסיסי (e(r)). SXL סביר מווסת את מטרות נוספות ב germline הנשי שנותרו להיות מזוהה^{1,7,8,9,10,11, 12 , 13}.

בדרך כלל, אפיון אתר איגוד כרוך מוטגנזה מכוונת, לדוגמה, על-ידי מחיקה או החלפה של יחיד או נוקלאוטידים מרובים. כל אתר איגוד מוטציה, יחסית רצף ה-RNA פראי-סוג, ואז ניתוח באמצעות סדרה של ריכוז חלבון כדי לקבוע זיקה מחייבת שלה (דיסוציאציהK_d או שיווי משקל קבוע) עבור החלבון עניין; K_d הוא ריכוז חלבון הנדרשים על מנת לקבל 50% RNA מחייב. תהליך זה מהגידולים של נתונים היסטוריים מוטגנזה מכוונת כרוך דור וניתוח של מוטציות רבות – שלושה נוקלאוטידים מסוג שאינו בר לכל תפקיד באתר האיגוד. לפיכך, יש צורך בגישה אלטרנטיבית עבור מוטגנזה מכוונת רוויה מהירה, פשוטה וזולה מהאתרים מחייב חלבון ב RNA.

כאן, אנו מתארים גישה חד-שלבית המאפשר רווית מוטגנזה מכוונת של אתר איגוד חלבון ב- RNA. זה כרוך סימום תבנית ה-DNA עם הלא-פראי-סוג נוקלאוטידים בתוך האתר מחייב, סינתזה של RNAs נפרד עם כל נוקלאוטיד phosphorothioate, ובידוד של השבר מאוגד בעקבות הדגירה עם חלבונים. ההפרעות נוקלאוטידים שאינם-פראי-סוג התוצאה שלהם תצדיק השבר חלבון מכורך מועדף. זה נמצא בפיקוח בג'ל בעקבות סלקטיבי כימי המחשוף בעזרת יוד של איגרות חוב phosphodiester המכילים phosphorothioates (phosphorothioate מוטגנזה מכוונת או PTM). גישה מוטגנזה מכוונת זו צעד אחר צעד רוויה ישימה על האפיון בכל אתר איגוד חלבון ב- RNA.

פרוטוקול

הערה: איור 1 מספק מבט כולל על phosphorothioate מוטגנזה מכוונת, מסכם את השלבים החשובים בתהליך.

1. דור של ספריה של מוטציות — סימום תבנית ה-DNA עם נוקלאוטידים מסוג שאינו בר

1. לסנתז T7 פריימר (5'-GTAATACGACTCACTATAG-3') על ידי סינתזה על סינתיסייזר הדנ א.
2. לסנתז oligonucleotide מסומם (גדיל משלים) על ידי סינתזה על סינתיסייזר DNA המתאים לאתר איגוד חלבון. השתמש תערובת המתאים של phosphoramidites במהלך סינתזה עבור כל אתר של סמים (X להלן) עם יחס של 90% א כמו נוקלאוטיד פראי-סוג ו-10% T כמו נוקלאוטיד מסוג שאינו בר (ראה תוצאות נציג לקבלת פרטים נוספים על יחס זה).
   הערה: כאן, רצף oligonucleotide מסומם הוא 5'-GTTCACTACACTXGAXAXAXAXCAXCXAXAXGXTGCCCTATAGTGAGTCGTATTAC-3'. הרצף בקו תחתון הוא המשלים הפוכה של אתר קישור החלבון SXL, בתוספת נוקלאוטידים נוספים באתר איגוד מספקות פקדים שימושיים המאשר כי לא כל שינוי RNA משפיעה על איגוד, כמו גם בקרת טעינה השוואה ונורמליזציה של נוקלאוטידים בתוך האתר מחייב. הרצף באתר מחייב SXL UUUUUGUUGUUUUUUUU, אשר נוכח שנאי pre-mRNA^14,15,16,17, שימש כדי לתכנן את המתודולוגיה המוצעת. הרצף בכתב נטוי משלים הרצף פריימר T7 והוא יזם T7 עבור שעתוק במבחנה .

2. סינתזה של RNA

1. לסנתז RNA בתגובה שעתוק 20 µL, כפי שתואר לעיל¹⁸.
   1. מיקס T7 שעתוק מאגר ו 1 מיקרומטר T7 oligonucleotide, 1 מיקרומטר מסטול oligonucleotide, dithiothreitol 10 מ מ (DTT), 2 מ מ GTP, 1 מ מ ATP, CTP, זוג שזור (guanosine, אדנוזין, cytidine ו- uridine טריפוספט) ואת 2 U/µL T7 RNA פולימראז.
   2. להוסיף, שני צינורות microcentrifuge נפרדים, 0.167 מ מ α-thio ATP או מ מ 0.05 α-thio שזור לשלב phosphorothioates (ראה שרטוט באיור2) RNAs.
      הערה: עבור פרוטוקולים חלופיים, להוסיף 0.2 מ מ α-thio CTP או 0.2 מ מ α-thio GTP לתגובה המתאימה שעתוק המכיל oligonucleotide מסומם כדי לבדוק את השניים הנותרים נוקלאוטיד החלפות.
   3. דגירה את תערובת התגובה של סינתזה RNA עבור 2 h ב- 37 מעלות צלזיוס.
2. להוסיף הדגימה RNA 2.5 µL פוספטאז אלקליין חום-יציב ומאגר 2.5 µL 10xphosphatase. דגירה כזאתי µL 25 למשך 10-30 דקות ב 37 ° C כדי להסיר 5' פוספטים.
3. בטל את האנזים אלקליין פוספטאז על ידי חימום ב 80 מעלות צלזיוס למשך 2-5 דקות.
4. Radiolabel 5' סוף dephosphorylated RNA (5 pmole) באמצעות 1 µL T4 polynucleotide קינאז ו- 1 µL וγ -³²P ATP באמצעי אחסון התגובה 10 µL. דגירה המיקס התגובה למשך 30-60 דקות ב 37 º C.
5. הפוך ללא פעיל האנזים קינאז polynucleotide T4 על ידי חימום-65 מעלות צלזיוס למשך 20-30 דקות.
6. ג'ל לטהר את הרנ א על ידי אלקטרופורזה ב- 10% denaturing ג'ל לזיהוי. אתר ה-RNA על הג'ל על-ידי autoradiography. לסלק את הפרוסה ג'ל המכיל radiolabeled RNA, למחוץ צינור microcentrifuge על ידי לחיצה הקירות עם טיפ פיפטה, ומשרים במאגר K (PK) proteinase (100 מ מ טריס, pH 7.5, 12.5 מ מ EDTA, 150 מ מ NaCl, 1% נתרן גופרתי dodecyl). לסובב את הצינור בטמפרטורת החדר מ 2 h ללון.
7. Centrifuge של slurry ג'ל, למחוק את הג'ל ולאסוף את בופר.
8. לחלץ את הפתרון פעמיים נפח שווה של פנול-כלורופורם, פעם עם הכלורופורם ולאסוף את פאזה מימית.
9. להוסיף פאזה מימית 0.1 האחסון של 3m סודיום אצטט, pH 5.2, מנשא tRNA או גליקוגן, 2.5 בנפח אתנול. שמור את הדגימה ב-80 מעלות צלזיוס לשעה.
10. Centrifuge לדוגמה עבור 5 – 10 דקות microcentrifuge במהירות גבוהה ב 16,873 x g. הסר את הפתרון מאגר/אתנול בזהירות מבלי להפריע בגדר RNA.
11. לשטוף את גלולה עם 70% אתנול, צנטריפוגה עבור 2 – 5 דקות הסר אתנול בקפידה. יבש בגדר באוויר.
12. Resuspend בגדר ב 20 – 50 µL diethyl pyrocarbonate (DEPC)-מים מטופלים. לאחסן ב-20 ° C עד השימוש.
    הערה: בצע את כל השלבים עם radiolabeled RNA באמצעות אמצעי הזהירות המתאימים פלקסיגלס מגן כדי להגן מפני רדיואקטיביות. עד מהרה, ספין עמודות הן יותר נפוץ ונוח יותר להסיר את הרדיואקטיביות לא מעובדות, כחלופה ג'ל לטיהור של RNA.

3. חלבון מחייב תגובה והפרדה של RNA מאוגד

1. לבטא את חלבון רקומביננטי ולטהר מ- e. coli.
2. מעריכים ריכוז חלבון רקומביננטי באמצעות ספקטרופוטומטר או על-ידי הפרדת ב ג'ל מרחביות-לזיהוי לצד חלבון ידוע סטנדרטיים, שור אלבומין (BSA). דמיינו החלבון של עניין של BSA סטנדרטי על ידי מכתימה את הג'ל עם R-250 Coomassie כחול מבריק. Quantitate החלבון לעומת כמויות ידוע של BSA דילולים על הג'ל אותו.
   הערה: אחסן חלבון רקומביננטי ב- 80 ° C עד השימוש ורכים ב- 20 מ מ 4-(2-Hydroxyethyl) piperazine-1-ethanesulfonic חומצה (HEPES), pH 8.0, dithiothreitol 1 מ מ (DTT), 0.2 מ מ Ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA), 0.05% NP-40, 20% גליצרול. שימוש של 0.5-1.0 מ"מ פרוטאז מעכב phenylmethane sulfonyl פלואוריד (PMSF) היא אופציונלית.
3. לבצע RNA מחייב תגובה (20 – 100 µL) 10 מ מ טריס-HCl, pH 7.5, 1 מ"מ DTT, 50 מ"מ אשלגן כלורי, 0.5 יחידות/µL RNase מעכב, 0.09 µg/µL acetylated שור אלבומין, 1 מ"מ EDTA, 0.15 µg/µL סינתזת RNA 5'-סוף radiolabeled, 6 µL של הריכוז המתאים (א ריכוז בו ~ 50% של RNA נקשר חלבון) של החלבון.
   הערה: מאגר איגוד זה עובד עבור שלושה RNA – מחייב חלבונים (SXL, U2AF⁶⁵, ו- PTB), אבל חייב להיות מוגדר על חלבון עניין. לאמוד ריכוז חלבון מדעית, באמצעות דילולים שונים עבור הכנה חלבון מסוים, נדרש להשיג כ 50% איגוד ה-RNA. תנאי או K_d מייצג את החלק הרגיש ביותר של העקומה RNA מחייב.
4. דגירה התגובה מחייב חלבון למשך 20-30 דקות ב- 25 ° C (או על קרח).
5. להפריד את השבר RNA חלבון מכורך השבר לא מאוגד באמצעות אחד שתי גישות:
   1. ניטרוצלולוזה לסנן איגוד
      1. החל את תגובת האיגוד (20 – 100 µL) על מסנן ניטרוצלולוזה מחובר של יריעה ואקום בטמפרטורת החדר.
         הערה: רק המתחם RNA-חלבון נשמר מסנן והוא לא מאוגדים RNA זורם דרך המסנן. הגישה מחייב מסנן מאפשר התאוששות גבוהה יותר של הרנ א מאוגד, הוא מהיר יותר, פשוט יותר, בהשוואה ל וזמינותו shift הניידות ג'ל. על ידי הצבת DEAE קרום מתחת המסנן ניטרוצלולוזה זה גם ניתן לאסוף את השבר RNA לא מאוגד או חינם RNA להשוואה עם השבר מאוגד.
      2. לחתוך את החלק של המסנן ניטרוצלולוזה המכיל את יתרת RNA רדיואקטיבי לחתיכות קטנות יותר כדי להתאים לתוך צינור microcentrifuge, להשרות מאגר PK מספיקות (300 – 500 µL המכיל 10 – 20 µg PK) לטבול את החלקים מסנן ולאחר elute RNA מהמסנן עבור 2-3 שעות או לילה.
      3. לחלץ עם פנול-כלורופורם, כלורופורם, ולאסוף פאזה מימית. הוספת סודיום אצטט ואתנול, לאחר דגירה במקפיא, צנטריפוגה, לשטוף, לייבש, resuspend RNA במים שטופלו DEPC. בצע את השלבים כמפורט בשלבים 2.10-2.14 לעיל.
   2. Shift הניידות ג'ל
      1. להכין, פולימריזציה לזיהוי יליד 5% ג'ל (60:1 Acrylamide:bis-אקרילאמיד) ב- 0.5 x TBE (מאגר טריס-בוראט-EDTA סטנדרטי) לפני שמתחילים את תגובת האיגוד, כחלופה לשיטה איגוד מסנן.
      2. מראש להפעיל את ג'ל למשך 15 דקות ב 250 V בחדר קר (4 ° C).
      3. לטעון כל תגובת האיגוד (לעיל) לתוך בארות נפרדים של הג'ל מבחו לעיל.
         הערה: מאגר אחסון חלבון מספק מספיק גליצרול לטעינה מדגם לתוך בארות.
      4. להפריד את ה-RNA חלבון מאוגד על-ידי אלקטרופורזה בג'ל בחדר קר ב 250 V h 1-2, תלוי בגודל RNA חלבון ספציפי.
      5. אתר את המיקום של המתחם RNA-חלבון על הג'ל על-ידי autoradiography. לסלק את הפרוסה ג'ל המכיל המתחם RNA-חלבון. Elute את הרנ א מן הפרוסה ג'ל על ידי ריסוק הפרוסה ג'ל לספוג את המאגר PK.
      6. לחלץ עם פנול-כלורופורם, כלורופורם, ולאסוף פאזה מימית. הוספת סודיום אצטט ואתנול, לאחר דגירה במקפיא, צנטריפוגה, אוויר יבש, וקונטה resuspend RNA במים שטופלו DEPC. בצע את השלבים כמפורט בשלבים 2.10-2.14 לעיל.

4. ניתוח של מוצרים Phosphorothioate ביקע יוד לצורך זיהוי של נוקלאוטיד מוטציה עמדות

1. להוסיף יוד 1 מ ב µL 20 שטופלו DEPC מים המכילים עד 10 המוביל µg tRNA כדי לדבוק RNAs (סה כ וקשורות RNAs) באתרים התאגדות phosphorothioate. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
   הערה: עוד פרטים על יוד מחשוף עם תנאים קצת שונה — iodoethanol 7% (v/v), חימום ב 95 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות — ניתן למצוא גיש & אקשטיין 1988¹⁹.
2. התמיסה ביקע RNA על-ידי הוספת סודיום אצטט/אתנול, כמתואר לעיל. Resuspend ב צבע טעינה עבור denaturing ג'ל. החום ו'טען הדגימה כדי להפריד בין ה-RNA קטעים על ידי אלקטרופורזה ב- 15-20% ג'ל לזיהוי denaturing.
3. לחשוף את הג'ל לזיהוי על סרט צילום רנטגן.
4. לזהות להקות השבר מאוגד מול הבריכה הכולל שימוש autoradiography.
   הערה: בצע את כל השלבים עם יוד בשכונה הפליטה. להפרדה RNA המוצגת כאן, ג'ל-בצורת טריז הוא מועסק, אשר מושגת על ידי הכפלת העובי של קפיציות שני בחלק התחתון של הלוחות ג'ל על-ידי הוספת מרווח במיוחד-inch-ארוכת של בחלק התחתון של הג'ל. צורה זו מאפשרת יותר מרווח אחיד או קרוב יותר בין קטעים RNA קצרים יותר. לחלופין, ניתן להשתמש phosphorimager ולא x-ray סרטים זיהוי, כימות לרדיואקטיביות.

תוצאות

עקרון רוויה מוטגנזה מכוונת באמצעות סמים בספורט:

עבור יחס טוחנת המתאים של פראי-סוג של נוקלאוטידים אחרים, השתמש תערובת שווה של כל ארבעה נוקלאוטידים אם רק תנוחה אחת כדי להיות מנותח. עם זאת, אם תפקידים מרובים מנותחים בו זמנית, היחס של הלא-בר לסוג פראי-סוג נוקלאוטידים שתישמר, קרי, מופחתת. אחרת, בנוסף החלפות יחיד, אשר היא הרצויה, יהיו גם תבניות עם מספר נוקלאוטידים מסוג שאינו בר בתוך המולקולה, מסלק ניתוח ההשפעה של נוקלאוטיד יחיד ...

דיון

מוטגנזה מכוונת זמן שימש לאפיין אתרי קישור חלבון. ראשית, סדרה של מוטציות יכול להיות נבנה ונבדק באופן אינדיבידואלי מחייבים מבחני לניתוח והשפעותיהם על איגוד הזיקה. בעוד בגישה מוטגנזה מכוונת סטנדרטי מציע דרך לנתח מספר רצפים, מרובי שלבים מעורב הגישה סטנדרטיים, כגון בניית מוטציות וביצוע סדרה של איגוד תגובות עבור כל מוטציה, זה מפרך וצורכת זמן, אולי לא לאפשר מוטגנזה מכוונת רוויה, במיוחד עבור רצפים ארוכים יותר. שנית, יכול להיות אקראיים רצף, הבריכה המשמש מספר מחזורים של תגובת שרשרת מחייבים, פולימראז (PCR) הגברה. רצפי אלה לאגד חלבו...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Uridine 5' a-thio triphosphate	NEN (בוסטון, מסצ'וסטס)	NLP-017
Adenosine 5' a-thio triphosphate	NEN (בוסטון, מסצ'וסטס)	NLP-016
סעפת ואקום	פישר סיינטיפיק	XX1002500	Millipore  25  מ"מ זכוכית מיקרואנליזה ואקום מסנן
ואקום סעפת	Millipore	XX2702552	1225 דגימה ואקום סעפת
ניטרוצלולוז	Millipore	HAWP
ניטרוצלולוז	Schleicher & ערכת זרחון של Schuell	PROTRAN
	NEB	M0508
T4 פולינוקלאוטיד קינאז	NEB	M0201S
פרוטאינאז K	NEB	P8107S
T7 RNA פולימראז	NEB	M0251S
RNasin	Promega		RNase מעכב
צלחות זכוכית סטנדרטיות
ציוד אלקטרופורזה ג'ל
סרטי רנטגן סטנדרטיים
פתרונות ג'ל פוליאקרילאמיד	סטנדרטיים