הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הכנת דוגמאות זחל דרוזופילה עבור גז כרומטוגרפיה-ספקטרומטריית (GC-MS)-מבוסס מטבולומיקס

10.9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/57847

⸱

6 ביוני 2018

 , 
1Department of Biology, Indiana University

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר כיצד להתכונן הרימות דרוזופילה metabolomic GC-MS מבוססי ניתוח.

תקציר

ההתקדמות בתחום גליקומיקס הקימו זבוב הפירות דרוזופילה melanogaster כמודל גנטי רב עוצמה עבור הלומדים חילוף החומרים בעלי חיים. על ידי שילוב המערך העצום של כלים גנטיים דרוזופילה עם היכולת סקר כ"שטח נוף פתוח של חילוף החומרים מתווך, בגישה גליקומיקס יכול לחשוף לאינטרקציות מורכבות בין דיאטה, גנוטיפ, אירועי חיים-היסטוריה רמזים סביבתיים. בנוסף, מחקרים גליקומיקס ניתן לגלות מנגנונים אנזימטי הרומן, לחשוף קשרים ידועים בין מסלולים מטבוליים שונים לכאורה. על מנת להקל על השימוש הנרחב יותר של טכנולוגיה זו בקרב הקהילה דרוזופילה , כאן אנחנו מספקים. פרוטוקול מפורט המתאר כיצד להתכונן דגימות זחל דרוזופילה ספקטרומטריית גז כרומטוגרפיה (GC-MS)- metabolomic המבוססת על ניתוח. פרוטוקול שלנו כולל תיאורים של איסוף הדגימה זחל, מטבוליט החילוץ, derivatization כימי וניתוח GC-MS. סיומו המוצלח של פרוטוקול זה יאפשר למשתמשים למדוד את השפע היחסי של מטבוליטים קוטב קטנים, כולל חומצות אמינו, סוכרים, חומצות אורגניות מעורב גליקוליזה את מחזורי TCA.

מבוא

זבוב הפירות דרוזופילה melanogaster התפתחה מערכת אידיאלי ללמוד את מנגנון מולקולרי שבו לווסת את חילוף החומרים מתווך. לא רק מסלולים מטבוליים רוב נשמרים דרוזופילה בין בני אדם, אלא מפתח חיישנים התזונתיים ואת הרגולטורים הצמיחה, כגון אינסולין, טור myc, פעילים גם לעוף1,2. כתוצאה מכך, דרוזופילה יכול לשמש כדי לחקור את הבסיס מטבולית של מחלות האדם ועד סוכרת והשמנה הקשורים ניוון מוחיים וסרטן. בהקשר זה, התפתחות הזחל דרוזופילה מספק את המסגרת אידיאלי שבו ללמוד תוכנית מטבולית גליקוליזה אירובי, או ורבורג. בדיוק כמו גידולים רבים להשתמש גליקוליזה אירובי כדי לייצר ביומסה של פחמימות, אז לעשות דרוזופילה הזחלים להפעיל גליקוליזה אירובי כדי לקדם צמיחה התפתחותית-3,-4,-5. אלה קווי דמיון בין זחל ואת חילוף החומרים הגידול להקים דרוזופילה כמו דוגמנית מפתח להבנה כיצד אירובי גליקוליזה הוא מוסדר ויוו.

למרות העובדה כי הזבוב התפתחה כמודל פופולרי עבור הלומדים את חילוף החומרים, רוב המחקרים דרוזופילה להסתמך על שיטות שנועדו למדוד מטבוליטים בודדים3, כגון טרהלוז, טריגליצרידים או ATP. מאז פרוטוקול מסוים נדרש כדי למדוד כל מטבוליט, מחקרים מבוססי assay הם עתירי עבודה, יקר, מוטה לכיוון את התרכובות הללו, שניתן למדידה באמצעות ערכות מסחריות. פתרון מגבלות אלה התפתחה מן התחום גליקומיקס, אשר מספק אמצעים יותר יעיל, לא משוחד של הלומדים דרוזופילה חילוף החומרים. בניגוד מחקר מבוסס-assay, ניתוח metabolomic יחיד יכול בו זמנית של מולקולה קטנה מטבוליטים מאות וכולן מספקות והיכרות מעמיקה של אורגניזם מצב מטבולי6,7. טכניקה זו התרחב באופן משמעותי את היקף לימודי מטבולית דרוזופילה ומייצג את העתיד של שדה המתעוררים זה8.

Metabolomic הלימודים מתנהלים בעיקר באמצעות שלוש טכנולוגיות: (i) תהודה מגנטית גרעינית (NMR), כרומטוגרפיה נוזלית (ii) מסות (LC-MS) ו- (iii) גז כרומטוגרפיה-ספקטרומטריית (GC-MS)9. בכל אחת מהגישות מציע יתרונות וחסרונות, ו כל הטכנולוגיות האלה שימשו ללמוד בהצלחה דרוזופילה חילוף החומרים. מאז המחקרים שנערכו במעבדה שלנו מתמקדת מטבוליטים קטן, קוטב, אנו מעסיקים בעיקר בשיטה מבוססת-GC-MS. GC-MS מספק למשתמש עם מספר רב של יתרונות, כולל הפארמצבטית גבוהה, שיא רזולוציה, רגישות, וגילה הזמינות של ספרייה ספקטרלי ההשפעה (EI) אלקטרון רגיל, המאפשר זיהוי מהיר של חילוף החומרים תכונות10,11. ההכנה של דגימות GC-MS, אולם, היא מורכבת למדי, דורש את תשומת לב רבה לפרטים. דוגמאות חייב להיות שנאספו, שטף, שקל, קפוא באופן במהירות המרווה תגובות חילוף החומרים. יתר על כן, הגופה לטוס עמיד בפני פרוטוקולים סטנדרטיים המגון ודורש טחנה חרוז כדי להבטיח מיצוי מטבוליט אופטימלית. לבסוף, דגימות נותחו על ידי GC-MS חייב לעבור derivatization כימי לפני זיהוי12. בעוד שיטות שפורסמו בעבר לתאר כל אלה13,3,השלבים14, פרוטוקול חזותי אשר יאפשרו למשתמש המתחיל להפיק reproducibly נתוני איכות גבוהה עדיין נדרשת. כאן נדגים כיצד להתכונן גליקומיקס GC-MS מבוססי ניתוח דגימות זחל דרוזופילה . פרוטוקול זה מאפשר למשתמש למדוד רבים של מטבוליטים קוטב קטנים שמרכיבים פחמן מרכזי חילוף החומרים reproducibly.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. אוסף ביצי

  1. לאסוף בוגרים זכרים ונקבות הבתולה של אחרים הרצוי. גיל בנפרד אלה חיות בקבוקון מזון עם סטנדרטיים מדיה בלומינגטון במשך 3-5 ימים.
  2. להגדיר את matings המתאים על-ידי העברת 50 בתולה נקבות וזכרים 25 בקבוקון מזון חדש.
    הערה: מינימום של שישה matings עצמאי צריך להגדיר עבור כל גנוטיפ. מדגם אחד בלבד ייאספו כל הזדווגות (קרי, ששת המדגמים שנאסף שישה matings עצמאית).
  3. להכין כובעים להטלת ביצים מולסה.
    1. מערבבים 115 מ של מולסה, 29 גר' אגר עם 700 מ"ל של H2O בקבוקון 2 ל'.
    2. מרתיחים מולסה אגר תערובת על פלטה חמה.
    3. להצטנן עד 70 מעלות צלזיוס.
    4. להוסיף 25 מ ל חומצה מיקס (20 מ ל חומצה זרחתית 85% וחומצה propionic 209 מ ב- 1 ליטר של H2O; בחנות בקבוק חום) ו- 10 מ"ל של 10% p-הידרוקסי-בנזואית חומצה מתיל אסתר ב 95% אתנול.
    5. שופכים את אגר מולסה לתוך החלק המכסה והן התחתון של תבשיל 35 x 10 מ מ2 תרביות רקמה.
      הערה: לפני לשפוך מולסה פלטות אגר, להיות בטוח כי העפעפיים ו/או בסיס של צלחת2 35 x 10 מ"מ מתאים מתכרבלת לתוך הפה של בקבוק דרוזופילה מניות (המתוארים שלב 1.6). בהתאם למותג הצלחות בשימוש, הבסיס לא יהיה שמיש.
  4. להפוך שמרים טריים הדבק על-ידי הוספת מים מזוקקים כפעילה שמרים יבשים (5 גרם שמרים/7 מ ל מים) עד שהתערובת הופכת משחה יכול להיות בקלות להפיץ על משטח יציב (קרי, מרקם של חמאת בוטנים).
  5. מורחים כ 1.5 גר' שמרים הדבק על פני השטח של כובע להטלת ביצים מולסה.
  6. דווח ארבעה חורים אוויר צידי פלסטיק 6 עוז דרוזופילה בקבוק מניות באמצעות מחט 22 גרם.
  7. להעביר את הזבובים ובסיומה לאחרונה מ המבחנה מזון לתוך תרבות בקבוקים.
    הערה: זבובים יועבר על-ידי שימוש CO2 כמו הרדמה זמני או על-ידי החזקת העליון של המבחנה בפה של הבקבוק וטפיחות בחדות בתחתית הבקבוק נגד benchtop.
  8. במהירות במקום כובע להטלת ביצים מולסה עם שמרים הדבק על פני השטח לתוך הפה של בקבוק מניות דרוזופילה . להשתמש בקלטת מעבדה כדי לאבטח את שווי להטלת ביצים במקום.
    הערה: אם זבובים היו מרדימים מראש כדי להעביר, הבקבוק צריכה להינתן אופקית benchtop עד מכל הזבובים התאוששו. לאחר זבובים נייד לחלוטין, מקם את הבקבוק בתוך אינקובטור עם הכיפה להטלת ביצים מולסה בחלק התחתון של התרבות.
  9. החלף את הכיפה להטלת ביצים מולסה לפחות פעם ביום במשך היומיים הראשונים על ידי היפוך הבקבוק מניות, הקשה על החלק התחתון של הבקבוק נגד benchtop, הסרת הכיפה ביצה הישן מיד הנחת כובע חדש ביצה לתוך הפה של הבקבוק. למחוק את הכובע הישן להטלת ביצים.
    הערה: שלב זה מבטיח כי הנקבות לא מחזיקים את ביציהם, מאפשר איסוף של אוכלוסיות מסונכרן.
  10. להכניס כובע חדש להטלת ביצים בתוך הבקבוק מניות לאחר יום 3, החלף לאחר 2 h, וזורקים. להסיר ולהחליף את הכובע השני להטלת ביצים לאחר ארבע שעות. תווית התחתון של הכובע הזה להטלת ביצים עם התאריך, הזמן, גנוטיפ.
    הערה: הביצים שנאספו במהלך חלון 4 שעות זה ישמש לצורך ניתוח. סינכרון שלב זה קריטי עבור ניתוח ספציפי שלבים התפתחותיים. ניתן לאסוף ביצים באופן זה במשך מספר ימים.
  11. הכנס את הפקקים להטלת ביצים לתוך צלחת פטרי של2 מ מ 60 x 15 והפיכתו אינקובטור לטמפרטורה הרצויה, לחות.
  12. בדוק את הפקקים להטלת ביצים כל יום עבור בעיות עם רעב, צפיפות אוכלוסין או זיהום.
    הערה: הזחלים חייבת להיות גישה מזון נאותים כדי להבטיח פיתוח רציף. במידת הצורך, ממרח שמרים טריים ניתן למרוח כל כנס כמוסות שישמש לניסוי. בנוסף, אם זחל הצפיפות גבוהה מדי, הזחלים יתחילו לשוטט מהצלחת תרבות. לא ניתן לשמש אלה דוגמאות לניתוח metabolomic בגלל צפיפות אוכלוסין גבוהה של התקפי ביניים של הרעבה חוו נדד תגרום נתונים לא עקביים. צפיפות של ~ 80 – 100 האמצעי השני לחלל הזחלים (L2) לכל צלחת או 40 – 50 האמצעי השלישי לחלל הזחלים (L3) לכל צלחת מומלץ. צריך להיות מושלך דגימות צמחים נגועים בעליל עם חיידקים או פטריות.

2. אוסף דגימה זחל

  1. גיל הזחלים עד השלב הרצוי. אם אוסף L3 הזחלים, לסנכרן מחדש דגימות-הנשירה L2-L3. סינכרון מחדש מושגת בדרך כלל באמצעות שיטה שתואר לעיל, העושה שימוש spiracles הקדמי של אבני דרך התפתחותיים15. לחלופין, אמצע-L3 הזחלים ניתן לסנכרן באמצעות גנים כתב16 sgs3 .
    הערה: בהקשר זה, אנו מוצאים הזחלים אמצע-L2 (h ~ 60 לאחר הנחת הביצה) מתאימה באופן אידיאלי עבור רוב ניתוחים בגלל התפתחות הזחל הוא עדיין יחסית סינכרונית בשלב זה, הדוגמאות שנאספו בקפידה יש במזון הולם לפתח את timepoint הזה, ואת מספר בעלי חיים לכל דגימה הוא לניהול (ראו להלן). צעד נוסף הסינכרון הוא הכרחי עבור הזחלים L3 כי הפולסים ecdysone רבות המתרחשות במהלך הפיתוח L3 יש השפעה דרמטית על חילוף החומרים ויגרמו חפצים באוכלוסיות שאינו מסונכרן.
  2. שימוש במחט ויבתר להרים בעדינות את העיסה שמרים את אגר. מניחים את השמרים לתוך כובע חדש של אגר מולסה.
    הערה: רוב הזחלים יאכל על הממשק בין אגר מולסה את העיסה שמרים.
  3. להשתמש במכחול קטן כדי לאסוף את הזחלים מפני השטח חשוף החדש של אגר מולסה. מקם את הזחלים לתוך שפופרת צנטרפוגה 1.5 mL על קרח.
    הערה: גודל מדגם המתאים עבור כל שלב התפתחותי הם כדלקמן: 50 instar ראשית הזחלים (L1); הזחלים אמצע-L2 25; 20 הזחלים L3 מוקדם; 15 אמצע-L3 או מאוחר הזחלים L3.
  4. רוחצים את הקפאת דגימות (שלבים 2.3 דרך 2.8) בקבוצות קטנות (4-6 דוגמאות) תוך איסוף ערכה מדגם גדולים. דוגמאות בוודאי קופא בתוך 20 דקות של הצבת הזחלים צינורות
    הערה: מומלץ להשתמש 1.5 ריפרבאן מ"ל Flex צינורות כי צינורות אחרים עלולים להפריע העברת דגימה בשלב 3. יש לאסוף דגימות microfuge צינורות. לא לאסוף דגימות צינורות חרוז שמתואר בשלב 3.1. חרוזי קרמיקה שומרים על הפתרון שטיפת NaCl, אשר תוצאות מדידות המונית לא מדויקים, מציג מזהמים לתוך הדגימה.
  5. להוסיף 1 מ"ל של קרח 0.9% NaCl לתוך הצינורית, סגור את המכסה והפוך אנכית צינור כדי ביסודיות לשטוף את הזחלים.
  6. מקם את הצינור בחזרה על הקרח ב-30 ~ s. במהלך תקופה זו, הזחלים ישקעו לתחתית הצינור, אבל שמרים תישאר ההשעיה. לאחר כל הזחלים יצרו גלולה רופף, להסיר את הפתרון NaCl באמצעות פיפטה של 1 מ"ל.
  7. חזור על שלב 2.4 ועל שלב 2.5 פעמיים, או עד הפתרון הסופי שטיפת נקה.
    הערה: השלבים לרחיצת נוספים עשוי להיות נחוץ אם המדגם שנאספו מכיל כמות מוגזמת של שמרים.
  8. Centrifuge את הדגימות-× 2,000 g עבור 1 דקות ב- 4 מעלות צלזיוס.
  9. הסר כל פתרון שיורית באמצעות פיפטה 200 µL.
  10. מיד להקפיא את הדגימה של חנקן נוזלי.
    הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול בשלב זה. דוגמאות ניתן לאחסן עד 3 חודשים ב- 80 ° c

3. העברת דגימות חרוז צינורות

  1. צינורות screwcap 2 mL המכילה חרוזים קרמיים 1.4 מ מ חייב להעביר כל מדגם זחל מהצינור microfuge 1.5 mL. לקראת שלב ההעברה, השתמש סמן אתנול-הוכחה לתייג את הצד של צינור חרוז screwcap 2 מ"ל (סימנים על המכסה יושמד במהלך שלב 4.4).
  2. טרה המסה של הצינור חרוז עם תוויות באמצעות איזון האנליטי המסוגל למדוד במדויק 0.01 מ"ג.
  3. אם הדגימות זחל אוחסנו ב-80 מעלות צלזיוס, מקום מדגם צינורות חנקן נוזלי מראש כדי להעביר.
  4. להשתמש מלקחיים ארוכות כדי להסיר את הצינור מדגם 1.5 mL החנקן הנוזלי דיואר.
  5. לובש nitrile כפפות, קחו קפואים צינור, היפוך, ולדפוק בחדות את המכסה צינור נגד benchtop מכך בגדר קפוא. ומיד שופכים בגדר לתוך צינור חרוז screwcap mL 2 מראש tared. אם בגדר נכשל מכך, לחזור ברכבת התחתית חנקן נוזלי וחזור.
    הערה: זחל כדורי לא מכך משפופרות microfuge כל. אם באמצעות צינור מזו המומלצת, לקבוע אם כדורי זחל יכול להיות רופף לפני איסוף דגימות לבדיקה.
  6. במהירות למדוד המסה משולב של הצינור צניפה, חרוז זחל. מיד למקם את הצינור לדוגמה חנקן נוזלי. בגדר זחל המסה ישמש כדי לנרמל את הנתונים metabolomic.
    הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול בשלב זה. דוגמאות ניתן לאחסן עד 3 חודשים ב- 80 ° c

4. דוגמת החילוץ

  1. מקום הצינורות מדגם benchtop-20 ° C קריר יותר.
  2. הוסף 0.8 מ של prechilled (-20 ° C) 90% מתנול המכיל חומצה סוקסינית-d4 µg/mL 2 לתוך כל שפופרת. להחזיר את הדגימה benchtop-20 ° C קריר יותר.
    הערה: חומצה סוקסינית-d4 משמשת על תקן פנימי. השתמש רק HPLC כיתה ח2O ומתנול. מאז מתנול, ממיסים אורגניים אחרים תנודתי וקשה למדוד באופן מדויק באמצעות פיפטות עקירה אוויר, אנו ממליצים על שימוש חיובי-הזחה פיפטות עבור שלב זה ואת כל השלבים הבאים.
  3. להגדיר פקד שלילי על-ידי הוספת 0.8 מ של prechilled (-20 ° C) 90% מתנול המכיל חומצה סוקסינית-d4 µg/mL 2 לתוך שפופרת חרוז ריק.
  4. Homogenize דגימות לשניה 30 ב- 6.45 מ' לשנייה באמצעות מהמגן מיל חרוז ממוקם בחדר בקרת טמפרטורה 4 ° C.
    הערה: כשל במהירות, לחלוטין homogenize בגדר הזחל הוא מקור נפוץ ההשתנות בניתוח מטבולומיקס. השתמש רק לטקס המסוגלים להרוס קפוא רקמות הזחל בתוך 30 s.
  5. להחזיר הצינורות דגימות הומוגני יותר מגניב benchtop-20 ° C, דגירה אותם במקפיא-20 ° C במשך לפחות שעה.
  6. Centrifuge צינורות 20,000 × g או מקסימום מהירות עבור 5 דקות ב 4 ° C כדי להסיר את המשקע המתקבל.
  7. להעביר 600 µL של תגובת שיקוע לתוך צינור 1.5 מ ל microcentrifuge. נא לא להפריע את התמיסה. אם בגדר precipitate הופך רופף בזמן pipetting את תגובת שיקוע, לחזור כל תגובת שיקוע הצינור וחזור על שלב 4.6.
  8. מקם את צינורות מדגם צנטריפוגה ואקום. ודא כי כל צינורות פתוחות לפני נעילת לצנטריפוגה. יבש את הדגימות בטמפרטורת החדר עד להסרת כל הממס (שלב זה בדרך כלל לוקח ~ 16 h כדי להשלים).
    הערה: אם יש צורך, ניתן להשהות את הפרוטוקול בשלב זה. דגימת יבשים ניתן לאחסן ב- 80 ° c

5. כימית Derivatization

  1. אם הדגימות יבשים היו מאוחסנים ב-80 מעלות צלזיוס, למקם את צינורות מדגם שלא נפתחו צנטריפוגה ואקום ויבש למשך 30 דקות. שלב זה חייב להתבצע לפני לפתוח את הצינור הדגימה.
    הערה: שלב זה מסיר את הדחיסה שאוסף בצד החיצוני של הצינור microfuge בעת הסרת מהמקפיא. חלק זה של הפרוטוקול הוא רגיש מאוד H2O וזהירות נוסף יש לנקוט כדי לשמור על כל ריאגנטים יבש ככל האפשר.
  2. להכין פתרון של 40 מ"ג/מ"ל methoxylamine הידרוכלוריד (MOX) בפירידין נטול מים. השתמש רק פירידין נטול מים. לאחסן MOX ופירידין desiccator ולהכין את הפתרון MOX מדי יום.
    התראה: MOX פירידין הם רעילים. להכין פתרון זה בשכונה fume.
    1. להשתמש באקדח חום יבש מזרק זכוכית 1 מ"ל.
    2. הכנס את המחט של המזרק לתוך בקבוק פירידין נטול מים. להסיר 1 מ"ל של פירידין ולהוסיף צינור microfuge המכיל 40 מ"ג MOX.
    3. לרוקן בקבוק פירידין נטול מים עם ארגון. לאטום את הבקבוק, להחזיר desiccator.
    4. להמיס את MOX ב פירידין מאת המקננת הצינור במיקסר תרמי ב 35 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות במהירות של 600 סל ד.
  3. להוסיף 40 µL של 40 מ"ג/מ"ל MOX בפתרון פירידין נטול מים המדגם מיובשים.
  4. מערבולת עבור 10 s ו בקצרה צנטריפוגה (10,000 x g עבור 20 s).
  5. דגירה ב 30 ° C עבור h 1-600 סל ד במיקסר תרמי.
  6. צנטריפוגה 20,000 × g או המהירות המרבית עבור 5 דקות כדי להסיר את העניין של חלקיקים.
  7. העברת µL 25 של תגובת שיקוע לתוך מבחנה תעשיה עם הוספת microvolume זכוכית 250 µL בוטלה.
  8. להוסיף 40 µL של N- מתיל -N- trimethylsilyltrifluoracetamide (MSTFA) המכיל 1% TMCS.
    התראה: MSTFA הוא רעיל. לבצע שלב זה בשכונה fume.
    הערה: אם הוא זמין, שלב זה יכול להתבצע על ידי מזהמי מזון Gerstel.
  9. להניח כובע על המבחנה תעשיה, לאטום בעזרת כלי צובטן.
  10. דגירה המדגם ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה ברעידות (250 סל"ד).
  11. להכין את חומצת שומן מתיל אסטר סטנדרטי (FAMES) פתרון בעבר desceribed3. להוסיף 3 µL של FAMES המבחנה מזהמי מזון באמצעות של מזהמי מזון רובוטי מייד לפני ההזרקה.
    הערה: FAMEs משמשים לכייל את המשמרת זמן השמירה ולבדוק את ביצועי כלי נגינה. אם תעשיה רובוטית לא זמין, ניתן להוסיף FAMEs במהלך שלב 5.8.

6. זיהוי GC-MS

הערה: ברוב המקרים, המשתמש ינהל שלב זה בסיוע מתקן הליבה לספקטרומטרית מסות. פרוטוקול זה נועד לשמש עם 30 מ', GC עמודה עם עמודה של משמר 5 מ'.

  1. סדר מדגם אקראי.
  2. הכינו את GC-MS.
    1. סט קצב הזרימה גז של מנשא הליום כדי 1 mL/min.
    2. הגדר את הטמפרטורה כניסת 250 מעלות צלזיוס.
    3. תוכנית GC לבצע מעבר הצבע החום הבאים:
      1. טמפרטורה התחלתית עד 95 ° C עם אחיזה של 1 דקות.
      2. מעלה את הטמפרטורה עד 110 מעלות צלזיוס בקצב של 40 ° C/דקה עם אחיזה של 2 דקות.
      3. להגדיל עד 250 מעלות צלזיוס על ידי שיפוע 5° C/min.
      4. להגדיל עד 330 ° C בקצב של 25 ° C/דקה עם אחיזה הסופי של 4 דקות.
    4. הגדר עיכוב הממס 3.5 דקות.
      הערה: ניתן לשנות את הזמן על פי שיטת GC-MS. מטרת שלב זה היא כדי למנוע MSTFA MOX גרימת נזק הגלאי.
  3. מזריקים µL 1 מדגם derivatized לתוך GC-MS (פיצול יחס של 10:1).
    הערה: להזריק µL 2 מדגם אם האינטנסיביות של פסגות הוא נמוך מדי. צריך להיות אקראי סדר הזרקה של דגימות.
  4. לנתח את ספקטרומטר מסה במצב סריקה מלאה על טווח המונית של 50 – 500 מ'/z.

7. ניתוח נתונים

  1. ניתוח נתונים metabolomic שימוש או גישה של יישוב או untargeted. ניתוח ממוקד מתמקדת מדידה של השפע ערכה מוגדרת של מטבוליטים, כגון המדידות לקטט זה נתאר להלן. לעומת זאת, ניתוח untargeted משתמשת בגישה לא משוחד כדי לזהות כל תכונה מטבוליות שהשתנה משמעותית בין שתי קבוצות המדגם.
    הערה: המעבדה שלנו בעיקר משתמשת את תוכניות ללא תשלום MetAlign17 ו-18,MetaboAnalyst19 לניתוח נתונים. מאז תיאור הולם של בקרת איכות, נורמליזציה, והן שלבי עיבוד נתונים מעבר להיקף של כתב יד זה, אנו מתייחסים המשתמש פרוטוקולים מפורטים יותר של מוקדשים עיבוד נתונים20,21, 22. בנוסף, תרשים זרימה המתאר את השלבים הנחוצים לביצוע ניתוח זה ניתן למצוא במקום8.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

לקטט דהידרוגנאז מוטציות (dLDH), שחסרה פעילות dLDH4ופקדים מתאימים מבחינה גנטית נאספו כ אמצע-L2 הזחלים ומעובדים על-פי הפרוטוקול המתואר לעיל. בהשוואה עם פקדים, הזחלים מוטציה התערוכה שינויים משמעותיים לקטט פירובט, L-2-hydroxyglutarate4. ספקטרה נרכשו עם מערכת Agilent GC6890-5973i MS. דוגמה של ספקטרום GC-MS ליצור עם פרוטוקול שלנו מוצג באיור1. ישנם תכונות גלויות רבות, רווי לשיא הבולטים של טרהלוז, אשר בדרך כלל ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

גליקומיקס מספק הזדמנות ללא תחרות סקר את תגובות חילוף החומרים שמרכיבים את חילוף החומרים מתווך. הרגישות של טכנולוגיה זו, מעבד עם זאת, נתונים רגישים הרקע הגנטי, רמזים התפתחותית, ומגוון של לחצים סביבתיים, לרבות טמפרטורה, לחות, צפיפות אוכלוסין וזמינות חומר מזין. לכן, גבוהה איכות, לשחזור גליקומיקס ניתוח דורש כי הדגימות ייאספו בתנאים מבוקרים מאוד. בעוד מספר הדעת להדגיש את הנקודה3,8,23, כאן אנו מספקים שיטה צעד אחר צעד עבור איסוף הזחלים ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף.

תודות

תודה לחברים של המתקן ספקטרוסקופיית מסה אוניברסיטת אינדיאנה, המתקן הליבה גליקומיקס אוניברסיטת יוטה לעזרה בארגון אופטימיזציה של פרוטוקול זה. J.M.T. נתמך על ידי הלאומית המכון כללי רפואי למדעים של מכוני הבריאות הלאומיים תחת פרס מספר R35GM119557.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מולסה שחורה ללא גופריתGood Food, INC
Drosophila Agar Type IIGenesee Scientific66-103
PyridineEMD MilliporePX2012-7
Methoxyamine hydrocholoride (MOX)MP Biomedicals, LLC155405
MSTFA עם 1% trimethylchlorosilaneSigma69478
פליישמן' s שמרים יבשים פעיליםAB מאורי מזון בע"מ2192
6oz בקבוק מלאי DrosophilaGenesee Scientific32-130
תערובת הומוגניזציה של רקמות רכות (2 צינורות מ"ל) אומני אינטרנשיונלמק"ט:19-627
תוספת בקבוקון, 250 ומיקרו; L זכוכית מנוטרלת עם רגלי פולימרAgilent5181-8872
חומצה סוקסינית-2,2,3,3-d4Sigma293075
SpeedVacThermo SC210A
o-חומצה זרחתיתפישר סיינטיפיקA242-1
חומצה פרופיוניתSigmaP5561
p-הידרוקסי חומצה בנזואית מתיל אסטרGenesee Scientific20-258
חרוזים RuptorOmni Internationalמק"ט:19-040E
ThermoMixer F1.5Eppendorf5384000012
שייקר MultiTherm עם בלוק 24 X 12 מ"מBenchmark ScientificH5000
מתנולסיגמא34860
צינור צנטריפוגה 1.5 מ"לEppendorf22364111
Falcon 35 X 10 מ"מ צלחת תרבית רקמותCorning Incorporated353001
GC columnPhenomexZB-5MSi

מקורות

  1. Owusu-Ansah, E., Perrimon, N. Modeling metabolic homeostasis and nutrient sensing in Drosophila: implications for aging and metabolic diseases. Disease Models & Mechanisms. 7 (3), 343-350 (2014).
  2. Sieber, M. H., Spradling, A. C. The role of metabolic states in development and disease. Current Opinion in Genetics & Development. 45, 58-68 (2017).
  3. Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. Methods for studying metabolism in Drosophila. Methods. 68 (1), 105-115 (2014).
  4. Li, H., et al. Drosophila larvae synthesize the putative oncometabolite L-2-hydroxyglutarate during normal developmental growth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (6), 1353-1358 (2017).
  5. Tennessen, J. M., Baker, K. D., Lam, G., Evans, J., Thummel, C. S. The Drosophila Estrogen-Related Receptor Directs a Metabolic Switch that Supports Developmental Growth. Cell Metabolism. 13 (2), 139-148 (2011).
  6. Nicholson, J. K., Lindon, J. C., Holmes, E. Metabonomics': understanding the metabolic responses of living systems to pathophysiological stimuli via multivariate statistical analysis of biological NMR spectroscopic data. Xenobiotica. 29 (11), 1181-1189 (1999).
  7. Fiehn, O. Metabolomics - the link between genotypes and phenotypes. Plant Molecular Biology. 48 (1-2), 155-171 (2002).
  8. Cox, J. E., Thummel, C. S., Tennessen, J. M. Metabolomic Studies in Drosophila. Genetics. 206 (3), 1169-1185 (2017).
  9. Lenz, E. M., Wilson, I. D. Analytical strategies in metabonomics. Journal of Proteome Research. 6 (2), 443-458 (2007).
  10. Pasikanti, K. K., Ho, P. C., Chan, E. C. Y. Gas chromatography/mass spectrometry in metabolic profiling of biological fluids. Journal of Chromatography B-Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 871 (2), 202-211 (2008).
  11. Want, E. J., Nordstrom, A., Morita, H., Siuzdak, G. From exogenous to endogenous: The inevitable imprint of mass spectrometry in metabolomics. Journal of Proteome Research. 6 (2), 459-468 (2007).
  12. Garcia, A., Barbas, C. Metabolic Profiling: Methods and Protocols Vol. 708 Methods in Molecular Biology. Metz, T. O. , Humana Press Inc. Totowa, Nj. 191-204 (2011).
  13. Chan, E. C. Y., Pasikanti, K. K., Nicholson, J. K. Global urinary metabolic profiling procedures using gas chromatography-mass spectrometry. Nature Protocols. 6 (10), 1483-1499 (2011).
  14. Dunn, W. B., et al. Procedures for large-scale metabolic profiling of serum and plasma using gas chromatography and liquid chromatography coupled to mass spectrometry. Nature Protocols. 6 (7), 1060-1083 (2011).
  15. Ashburner, M. Drosophila: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 171-178 (1989).
  16. Biyasheva, A., Do, T. V., Lu, Y., Vaskova, M., Andres, A. J. Glue secretion in the Drosophila salivary gland: a model for steroid-regulated exocytosis. Developmental Biology. 231 (1), 234-251 (2001).
  17. Lommen, A. MetAlign: Interface-driven, versatile metabolomics tool for hyphenated full-scan mass spectrometry data preprocessing. Analytical Chemistry. 81 (8), 3079-3086 (2009).
  18. Xia, J., Wishart, D. S. Using MetaboAnalyst 3.0 for comprehensive metabolomics data analysis. Current Protocols in Bioinformatics. 55, (2016).
  19. Xia, J., Sinelnikov, I. V., Han, B., Wishart, D. S. MetaboAnalyst 3.0-making metabolomics more meaningful. Nucleic Acids Research. 43 (W1), W251-W257 (2015).
  20. Lommen, A. Data (pre-)processing of nominal and accurate mass LC-MS or GC-MS data using MetAlign. Methods in Molecular Biology. 860, 229-253 (2012).
  21. Xia, J., Wishart, D. S. Using MetaboAnalyst 3.0 for comprehensive metabolomics data analysis. Current Protocols in Bioinformatics. 55, (2016).
  22. Xia, J., Wishart, D. S. Web-based inference of biological patterns, functions and pathways from metabolomic data using MetaboAnalyst. Nature Protocols. 6 (6), 743-760 (2011).
  23. Li, H., Tennessen, J. M. Methods for studying the metabolic basis of Drosophila development. Wiley Interdisciplinary Reviews Developmental Biology. 6 (5), (2017).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

מטבוליזניקה באמצעות GC-MSמיצוי מטבוליטיםנגזרת כימיתהומוגניזציה במטחנת כדוריםסנטריפוגת ואקוםנגזרת מתוקסילמיןסיליציה באמצעות MSTFAהכנת מבחנות למדגם אוטומטיניתוח רכיבים ראשיים
הכנת דוגמאות זחל דרוזופילה עבור גז כרומטוגרפיה-ספקטרומטריית (GC-MS)-מבוסס מטבולומיקס
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.