איפה אתה חותך בנושאים: דיסקציה ומדריך ניתוח האוריינטציה המרחבי של הרשתית העכבר מן ציוני דרך עינית
Summary
פרוטוקול זה מספק מדריך ניתוח וניתוח מקיף לשימוש של ציוני דרך עינית עמוק, s-אופסין אימונוהיסטוכימיה, Retistruct ו קוד מותאם אישית כדי בדייקנות ובאמינות אוריינט הרשתית העכבר מבודד במרחב אנטומיים.
Abstract
בדייקנות ובאמינות זיהוי מרחבית של הרשתית העכבר מבודד הוא חשוב עבור מחקרים רבים במדעי המוח החזותי, כולל הניתוח של צפיפות ומעברי בגודל של סוגי תאים ברשתית, כיוון כוונון של כיוון סלקטיבית תאי גנגליון ולאחר הבחינה של דפוסי ניוון טופוגרפית כמה מחלות רשתית. אולם, ישנן שיטות שונות לנתיחה עינית רבים דיווחו בספרות המשמשים כדי לזהות תווית התמצאות ברשתית ברשתית העכבר. בעוד השיטה של התמצאות בשימוש מחקרים כאלה הוא להתעלם לעתים קרובות, לא דיווח התמצאות ברשתית איך נקבע יכול לגרום אי-התאמות בספרות, בלבול בעת ניסיון להשוות נתונים בין מחקרים. ציוני דרך עינית שטחיים כגון כוויות קרניות משמשים אבל לאחרונה הוכחו להיות מהימנים פחות ציוני דרך עמוקה יותר כגון השרירים rectus, של פיסורה דמית העין או s-אופסין מעבר הצבע. כאן, אנו מספקים מדריך מקיף לשימוש של ציוני דרך עינית עמוק לנתח במדויק ולתעד את כיוון המרחבי רשתית העכבר מבודד. יש גם לעומת היעילות של שני נוגדנים s-אופסין ואנו כלולים עבור s-אופסין אימונוהיסטוכימיה פרוטוקול. כי האוריינטציה של הרשתית על פי מעבר הצבע s-אופסין דורש שחזור ברשתית עם Retistruct תוכנה וסיבוב עם קוד מותאם אישית, הוצגו הצעדים החשובים נדרש להשתמש שתי התוכניות. בסך הכל, המטרה של פרוטוקול זה היא לספק ערכה הדיר ואמין של שיטות לאוריינטציה ברשתית מדויק שניתן לסגלה בפרוטוקולים ניסיוניים ביותר. יעד העל של עבודה זו היא לתקנן התמצאות ברשתית שיטות עבור מחקרים עתידיים.
Introduction
היבט חשוב, לפעמים תסולא בפז של מדעי המוח ברשתית הוא הכיוון הנכון, ניתוח של הרשתית כולה-הר מבודד, בין אם זה יהיה הכיוון של הרשתית חדר הקלטה אלקטרופיזיולוגיה או בשקופית היסטולוגית. זה חשוב במיוחד עבור מחקרים שכללו הרשתית העכבר, אשר נמצא כעת מודל הנפוצה ביותר עבור חקירות של מערכת הראייה יונקים. גילויים אחרונים מגלים כי הרשתית העכבר אינה אחידה במרחב אך יש מעברי צבע צפיפות וגודל של סוגי תאים ברשתית פונקציונלית-ברורים, כגון תאי גנגליון melanopsin, תאי גנגליון OFF-אלפא ארעי חרוט opsins1,2 ,3,4,5. כתוצאה מכך, השיטה שבה נעשה שימוש כדי לקבוע את הכיוון של הרשתית עשוי להשפיע על תוצאות הניסוי מעורבים תא סוג או אופסין הפצות2,3,6, כיוון כוונון של כיוון סלקטיבית 8,7,תאי גנגליון9, ודפוסי טופוגרפית של ניוון הרשתית10,11,12,13,14 . למעשה, לא דיווח התמצאות איך ברשתית הוא דיווח יכול לגרום אי-התאמות בספרות, בלבול בעת ניסיון להשוות נתונים בין מחקרים. לכן חיוני כי החוקרים מדווחים השיטה לזיהוי הכיוון של הרשתית, כך התוצאות של מחקרים כאלה יכול להתפרש באופן מדויק.
התמצאות ברשתית מזוהה בדרך כלל כשקלע את הקרנית הגבי, הגחון, האף או טמפורלית לפני העקירה עינית1,3,12,15,16,17 18, ,19 או על ידי חיתוך או צביעת ציוני דרך העין עמוק אנטומיים כגון השרירים extraocular6,7, דמית פיסורה20,21, או מעבר צבע2,‘ s-אופסין ‘3. השרירים rectus יכול לשמש כדי לזהות את הגבי, הגחון, אפי, ואת הרשתית טמפורלית על ידי ביצוע חתך עמוק להקלה על שחוצה את הקובץ המצורף של גם את rectus מעולה, rectus נחות, rectus המדיאלי או שריר לרוחב, בהתאמה. עם זאת, עבור רוב הניסויים, באמצעות שריר אחד מספיקה המכוונת רשתית22. פיסורה דמית העין, שהוא שריד של התפתחות העין, ניתן להציג כקו אופקי להתעלף בצד האחורי של העין. בכל קצה של קו זה מסיים את האף או הקוטב הטמפורלי של גלובוס23. לבסוף, s-אופסין ביטוי מופץ בצורה א-סימטרית ברשתית הגחון בעכברים, s-אופסין נוגדנים יכול לשמש כדי לחשוף את הרשתית הגחון ניסויים immunohistochemical1.
עבודה על-ידי Stabio, et al. 22 הדגימו כי ציוני דרך עינית שטחיים כגון כוויות קרניות הן שיטה פחות אמין המכוונת הרשתית בחלל אנטומיים, ככל הנראה עקב טעות אנוש ולשינויים בקבלת הכוויה הקרנית בעת שימוש את זמני ואת המדיאלי canthi כנקודות התייחסות. לעומת זאת, ציוני דרך עמוקה, כגון את שריר מעולה, פיסורה דמית העין, מעבר הצבע s-אופסין, הוכחו להיות ציוני אמין ומדויק יותר עבור המכוונת רשתית22. עם זאת, זיהוי מוקדי אנטומיים אלה דורש ניתוח ייחודי השלבים המתוארים לא בפירוט בספרות. לכן, המטרה של פרוטוקול זה נועד לספק הדרכה מקיפה על אופן השימוש של שריר מעולה, פיסורה דמית העין ו s-אופסין הדרגתי לזהות במדויק את כיוון המרחבי של הרשתית העכבר. בנוסף, כללנו השוואה של היעילות של שני נוגדנים s-אופסין, כמו גם עבור s-אופסין אימונוהיסטוכימיה פרוטוקול.
אתגר נוסף אחד ללימודים להסתמך על התמצאות ברשתית מדויק הוא גדול החתכים להקלה על הנדרש כדי לשטח wholemount הרשתיות הקלטה קאמרית, צלחת או שקופיות. דבר זה יכול להציג אתגרים לניתוח של מה זה באופן טבעי מבנה תלת-ממדי כאשר זה הוא עם תמונה כמבנה במול דו מימדי. תוכנית הנקראת Retistruct24 יכול לשמש כדי לחזור הרשתית שטוח wholemount את המבנה התלת-ממדי לפני ניתוח המידע שנאסף זה. לפיכך, קטע של פרוטוקול זה מוקדש המדגיש את השלבים הנחוצים באמצעות התוכנה Retistruct לשחזר s-אופסין immunostained העכבר הרשתית. כללנו גם קטע של פרוטוקול לשימוש שלנו MATLAB בקובץ script מותאם אישית, אשר פותחה כדי רשתית העכבר לסובב ולהכשיר במדויק מוכתם s-אופסין…
Protocol
כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) של האוניברסיטה של אקרון.
1. באמצעות את מלון וציון דרך השריר Rectus מעולה לזיהוי האוריינטציה רשתית
הערה: שריר מעולה היא נקודת ציון עבור הרשתית הגבי (טבלה 1). אם הניסוי אינו מחייב הסימון של הרשתית הגבי, לדלג על שלב 1, המשך לשלב 2.
- פעלתי לפי הנהלים שאושרו שלך אכפת לי חיה המוסדית והוועדה לשימוש עבור העכבר המתת חסד
- כדי לזהות את הכיוון הכללי של העולם, להפוך כוויה לסמן על הקרנית הגבי ישירות בין canthi האף ואת זמני ליד הגבול קרנית-בסקלרה מיד לאחר המתת חסד (איור 1א’). לבצע את הצריבה לסמן על-ידי חימום עט עורק דופן בית. לעשר שניות ואז לגעת בקצה העט בקרנית הגבי של פחות משניה.
הערה: אדים שעט עורק דופן בית הקרנית במשך זמן רב מדי יגרום את העולם כדי לנקב.
הערה: בעוד כמה עטים עורק דופן בית פולטים אור, העט עורק דופן בית המופיעים בטבלה של חומרים אינו פולט אור כאשר מחוממים, הפיכתה אפשרות לניסויים dark-adapted. - עבור העקירה, להשתמש מלקחיים מעוקל בעדינות לדחוף את העין ממקומה, אחיזה הגלובוס מ מתחת. לא לחתוך את עצב הראייה כדי להסיר את כדור הארץ; במקום זאת, הרם לאט הגלובוס מן השקע שלו בזמן בו זמנית להעביר אותו בעדינות משמאל לימין עד העולם הוא שוחרר מן השקע.
הערה: תנועה זו תאפשר השרירים rectus להישאר מחוברים העולם כאשר העולם סוף סוף מוסרת לגמרי מהשקע. עצב הראייה גם לעתים קרובות יישאר מחובר אל העולם. - להעביר את העולם עם השרירים המחוברים rectus בצלחת פטרי המכילות בינוני לנתיחה. לוודא לעקוב אחר אשר עין היא עין שמאל ולא העין הימנית.
הערה: בניתוח עליך להשתמש בינוני של דיסקציה המתאים שמתיישר עם שלהם נסיוני. - מתחת למיקרוסקופ לנתיחה, חזותית לאתר את הצריבה הקרנית הגבי ולזהות את שריר סופריור עם זו קשורה (איור 1א’).
- באמצעות חיתוך מספריים או 20 G (0.9 מ”מ x 25 מ”מ) מחט דקירה (ראה טבלה של חומרים), הקרנית-סימן כוויה. להפוך עמוקה להקלת לחתוך לתוך העולם לכיוון עצב הראייה כדי קטיעות לשריר מעולה. הרשתית המשוחזרת מבודדים עם החתך הזה מוצג דמויות 1B וג 1.
- בגין לבודד את הרשתית באמצעות שתי קבוצות של מלקחיים (ראה טבלה של חומרים) לקרוע בעדינות את החור עשה עם הניקוב בשלב 1.6 עד החלק של הרשתית חשוף.
הערה: חשוב כי תהיה זאת בעדינות, כמו קריעת בחוזקה מדי יכול לגרום להקלה על גזירה להרוס עוד יותר. - להשתמש מלקחיים להתגרות הרשתית מ בסקלרה לגזרים עד בסקלרה הוסר לחלוטין. להסיר את הקשתית, עדשה, הזגוגיות, כל המבנים שנותרו עם מלקחיים עד הרשתית מופרד לחלוטין.
הערה: הפרוטוקול עשוי להיות עצר כאן. אם הרקמה הולך להיות קבועה עבור s-אופסין אימונוהיסטוכימיה, המשך לשלב 3.5.
2. באמצעות את ציון דרך של פיסורה דמית העין לזיהוי האוריינטציה רשתית
הערה: פיסורה דמית העין קיים sclera בחלק האחורי של העין, ופועל מהקוטב טמפורלית לקוטב האף (דמויות 2B ו- 2 ג; טבלה 1).
- עקוב אחר אושר פרוטוקול אכפת לי חיה המוסדית והוועדה שימוש בעכבר המתת חסד.
- כדי לזהות את הכיוון הכללי של העולם, להפוך כוויה לסמן על הקרנית הגבי ישירות בין canthi האף ואת זמני ליד הגבול קרנית-בסקלרה מיד לאחר המתת חסד (איור 2א). לבצע את הצריבה לסמן על-ידי חימום עט עורק דופן בית. לעשר שניות ואז לגעת בקצה העט בקרנית הגבי של פחות משניה.
הערה: אדים שעט עורק דופן בית הקרנית במשך זמן רב מדי יגרום את העולם כדי לנקב. - Enucleate העין ולהעביר הגלובוס בצלחת פטרי המכילות בינוני לנתיחה. לוודא לעקוב אחר אשר עין היא עין שמאל ולא העין הימנית.
הערה: בניתוח עליך להשתמש בינוני של דיסקציה המתאים שמתיישר עם שלהם נסיוני. - מבחינה ויזואלית לאתר ולזהות את פיסורה דמית העין בצד האחורי של העין (איור 2ב, ג 2).
הערה: פיסורה דמית העין היא גם גלוי בתוך עיינית תחת אור אינפרא אדום20. - אוריינט הגלובוס בצלוחית הפטרי כך הצריבה הגבי נמצא בקוטב עליון, כפי שזה יהיה אם העין היו עדיין העכבר.
הערה: הנוכחות של מהראש צריבה מאפשר הזיהוי של הצד האף ואת זמני של העולם, כל עוד האם יש עין ימין או שמאל תועד: אם זה עין ימינית, פיסורה דמית העין האף יהיה בצד ימין של הכוויה, את tempora פיסורה דמית העין l יהיה משמאל הצריבה. אם זה עין שמאל, פיסורה דמית העין הזמני יהיה בצד ימין של הכוויה, פיסורה דמית העין האף יהיה משמאל הצריבה.
באמצעות חיתוך מספריים או 20 G (0.9 x 25 ממ) מחט (ראה טבלה של חומרים), להפוך ניקוב אחד הגלובוס שבו ממוקם הכוויה הגבי. - לגרום להקלת רדוד לחתוך לכיוון עצב הראייה שבו ממוקם הכוויה הקרנית הגבי. החתך הזה יהיה בניצב פיסורה דמית העין, המאפשר זיהוי של הרשתית הגבי לאחר בידוד (איור 2D).
- להפוך את החתכים הבאים עמוק להקלה על שני לכיוון עצב הראייה: אחד על ידי רירית הלהבים של הקרע מספריים למעלה עם הקו פיסורה דמית העין הטמפורלי בצד האחורי של העין, ומספריים אחד על ידי רירית הלהבים של הקרע למעלה עם דמית מהאף פיסורה קו בחלק האחורי של העין. . החתכים מוצגים על הרשתית המשוחזרת מבודדים איור 2D , 2E.
הערה: לחלופין, חתך עמוק יכול להתבצע בכל פיסורה דמית העין הטמפורלי, חתך שטחי יכול להתבצע בכל פיסורה דמית העין האף, שהופך את הצריבה הקרנית הגבי לחתוך מיותרים. דבר זה מאפשר כיוון מדויק של הרשתית עם קיצוצים להקלה על פחות. - בגין לבודד את הרשתית באמצעות שתי קבוצות של מלקחיים (ראה טבלה של חומרים) לקרוע בעדינות את החור עשה עם הניקוב בשלבים 2.7 ו- 2.8 עד החלק של הרשתית חשוף.
הערה: חשוב כי תהיה זאת בעדינות, כמו קריעת בחוזקה מדי יכול לגרום את cut(s) להקלה על לפרק נוסף. - להשתמש מלקחיים להתגרות הרשתית מ בסקלרה לגזרים עד בסקלרה הוסר לחלוטין. להסיר את הקשתית, עדשה, הזגוגיות, כל המבנים שנותרו עם מלקחיים עד הרשתית מופרד לחלוטין.
הערה: הפרוטוקול עשוי להיות עצר כאן. אם הרקמה הולך להיות קבועה עבור s-אופסין אימונוהיסטוכימיה, המשך לשלב 3.5.
3. תיוג מעבר הצבע S-אופסין ברשתית העכבר
הערה: הביטוי photopigment s-אופסין מופץ בצורה א-סימטרית הרשתית הגחון1, שהופך אותו סמן מצוין במחצית הגחון של הרשתית. שיטה זו שימושית רק עבור קבוע, רקמת immunostained (טבלה 1). השלבים הבאים ניתן ליישם הרשתיות זה גזור באמצעות כל אחת מהשיטות הנ.
- עקוב אחר אושר פרוטוקול אכפת לי חיה המוסדית והוועדה שימוש בעכבר המתת חסד.
- מיד לאחר המתת חסד, enucleate את העין ולמקם הגלובוס בצלוחית עם חיתוך בינוני. ודא לעקוב אחר בעין. העין השמאלית והוא אשר עין ימין כדי לזהות כיוון ברשתית לאחר הרשתית הוא גזור.
הערה: בניתוח עליך להשתמש בינוני של דיסקציה המתאים שמתיישר עם שלהם נסיוני. -
בגין לבודד את הרשתית באמצעות שתי קבוצות של מלקחיים (טבלה של חומרים) לקרוע בעדינות את חור בתוך הקרנית עד החלק של הרשתית חשוף.
הערה: חשוב כי תהיה זאת בעדינות, כמו קריעת בחוזקה מדי יכול לגרום הרשתית לקרוע. - להשתמש מלקחיים להתגרות הרשתית מ בסקלרה לגזרים עד בסקלרה הוסר לחלוטין. להסיר את הקשתית, עדשה, הזגוגיות, כל המבנים שנותרו עם מלקחיים עד הרשתית מופרד לחלוטין.
הערה: הפרוטוקול עשוי להיות עצר כאן. אם משתמש הרשתית ex-vivo ניסוי, לערוך את הניסוי לפני ביצוע השלבים הבאים. - באמצעות חיתוך מספריים, להפוך את ארבע להקלה על חתכים ברשתית, כך הוא שוכב שטוח. הר התא גנגליון ברשתית-בצד למעלה על קרום ניטרוצלולוזה (טבלה של חומרים) בהקשת בעדינות בכל פינה של הרשתית על גבי הקרום עם מלקחיים.
הערה: המיקום של החתכים להקלה על יכול להיות שרירותי בעת שימוש מעבר הצבע s-אופסין לאוריינטציה ברשתית. - באמצעות מלקחיים, העברה הרשתית רכוב אל הבאר הראשונה לתוך צלחת 24-טוב (טבלה של חומרים) מלא 1 מ”ל של 4% paraformaldehyde (טבלה של חומרים) עבור קיבעון. למקם את הצלחת 24-ובכן תפקודי לב / נשימה בטמפרטורת החדר (טבלה של חומרים) ותקן הרשתית בדיוק 40 דקות.
הערה: כל השלבים הבאים רוחצים את הדגירה צריך להשלים עם הלוחית 24-ובכן תפקודי לב / נשימה. - לשטוף את רשתית העין למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר על ידי העברת אותו השני טוב מלא 1 מ”ל של PBS 0.1 M. חזור על שלב זה פעמיים על-ידי העברת ברצף הרשתית 0.1 M PBS מלא השלישית והרביעית הבארות.
- הרשתית הנטען להעביר החמישי טוב המכיל 1 מ”ל של חסימת פתרון (1.7% טריטון X-100 ו- 5.2% חמור נורמלית בסרום ב- PBS 0.1 M; ראה טבלה של חומרים), דגירה בין לילה ב 4 º C.
- להוסיף הנוגדן העיקרי של אנטי-s-אופסין הארנב (ראה טבלה של חומרים) לפתרון חסימה בריכוז שבערך דגירה במשך שלושה ימים ב- 4 מעלות צלזיוס.
- רחץ עודף נוגדן ראשוני של הרשתית שש פעמים על-ידי הצבתו ברצף בבארות שש מלא 1 מ”ל של 0.1 M PBS במשך 10 דקות כל בטמפרטורת החדר.
- למקם את הרשתית טוב עם פתרון חסימה טריים (1.7% טריטון X-100 ו- 5.2% חמור נורמלית בסרום ב- PBS 0.1 M) ולהוסיף חמור ארנב אנטי אלקסה-594 נוגדנים משניים (ראה טבלה של חומרים). דגירה הרשתית עם הנוגדן משני בן לילה ב 4 º C.
- לשטוף את הנוגדן משני עודף של הרשתית שש פעמים על-ידי הצבתו ברצף בבארות שש מלא 1 מ”ל של PBS 0.1 M טריים למשך 10 דקות כל בטמפרטורת החדר.
- באמצעות מלקחיים, להעביר הרשתית הנטען צלחת פטרי המכילות PBS 0.1 M. שחרור הרשתית קרום ניטרוצלולוזה על-ידי הוספת בעדינות את קצות המלקחיים בין הרשתית הקרום עד הרשתית מחוברת יותר.
- הר הרשתית על משטח זכוכית מיקרוסקופ על ידי בעדינות לדרבן את זה עם מלקחיים, עד הרשתית ומודבקת הזכוכית ולהסיר את השקופית הפטרי.
- מכסה הרשתית על השקופית עם Aquamount, לכסות את זה עם coverslip #1.5. מקם את השקופית מגש שקופית (ראה טבלה של חומרים) ולאפשר לו לשבת בטמפרטורת החדר במשך שעה.
- לחזור לשקופית במקרר. ואני חנות מגש שקופית (ראה טבלה של חומרים) ב 4 ° C כאשר אינו בשימוש. לאחר השקופית כבר coverslipped במשך 24 שעות ביממה, להשתמש לק לאטום את הצדדים של השקופית כדי למנוע לייבוש.
הערה: הפרוטוקול אפשר לעצור כאן.
4. שימוש שיחזר הרשתיות Immunostained עם S-אופסין לזהות כיוון רשתית
- לדמיין את ההדרגה s-אופסין עם מיקרוסקופ קונפוקלי או מיקרוסקופ פלורסנטי עם צרופת המצלמה (ראה טבלה של חומרים) התמונה הרשתית כך הרשתית כולו מוצג בתמונה אחת (דמויות 1B, 2D, 3A, ו 3D). ניתן לבצע זאת על-ידי הדמיה הרשתית בסעיפים בהגדלה נמוכה ואז תפרים התמונות ביחד.
- שם באדמומיות אז הם ניתנים לזיהוי. לדוגמה, שם הרשתית הראשון להיות משוחזר “Retina1”.
- הורד והתקן ImageJ-https://imagej.nih.gov/ij/download.html.
- צור תיקיה בודדת עבור כל רשתית שצריך להיות משוחזר, אך להשאיר את התיקיות ריקות. לדוגמה, צור תיקיה בשם “Retina1”. כל הקבצים הדרושים כדי לשחזר את הרשתית ימוקמו בתיקיה זו והשלבים הבאים.
הערה: רק קבצים שתיקיות אלה צריך להכיל הן הקבצים כדי להיות מנותח על ידי Retistruct. קבצים שונים מאלה המפורטות להלן יגרום הרשתית אפשרות לפתוח על ידי תוכנת Retistruct. - פתחו את התמונה של הרשתית ב- ImageJ על-ידי בחירת קובץ ← פתח ולאחר מכן בחירה “Retina1”.
- מבלי לבצע שינויים בתמונה, לשמור אותו כקובץ “image.png” אל התיקיה תחת הכותרת “רשתית 1” על-ידי בחירת ← ← שמירה בשם קובץ PNG.
הערה: הקובץ צריך להיקרא בשם “image.png” על מנת Retistruct לתוכנה לזהות את הקובץ כמו הרשתית עבור שחזור. - השתמש בכלי קו מקוטע חלוקה לרמות את הקצוות של הרשתית. על ידי לחיצה על שני מקומות סמוכים על הגבול של הרשתית, הכלי קו מקוטע יהיה בעיקרו “לחבר את הנקודות” בין שני המקומות הסמוכים, יוצר מיתאר. חזור עד הרשתית כולו בקווים כלליים. שמור קווי המתאר של הרשתית כמו “outline.roi” אל התיקיה תחת הכותרת “Retina1” על-ידי בחירת נתח ← כלים ← רועי מנהל ← להוסיף [t] ← More → שמור.
הערה: הקצה של הרשתית ניתן לזהות היכן ההכתמה s-אופסין המעברים לרקע. - השתמש בכלי קו מקוטע שהומלץ בשלב 4.7 להתוות את הגבול של התקליטור האופטי. שמור קווי המתאר של דיסקים אופטיים כמו “od.roi” אל התיקיה תחת הכותרת “Retina1” על-ידי בחירת נתח ← כלים ← רועי מנהל ← להוסיף [t] ← More → שמור.
הערה: התקליטור האופטי מזוהה החור קטן במרכז הרשתית, והוא ישתנה בהתאם לאיכות לנתיחה.
הערה: כל הקבצים הדרושים עבור שחזור Retistruct (“image.png”, “outline.roi” ו- “od.roi”) כעת יש לשמור את התיקיה “Retina1”. - כדי להוריד, להתקין, פתח את התוכנית Retistruct, בצע את ההוראות המתוארות במדריך למשתמש Retistruct נמצא בסעיף השלמה של Sterratt, et al. 24
- ברגע Retistruct החלון הופיע, לחץ על הסמל ‘פתח’ בחלק העליון השמאלי של החלון, בחר את התיקיה מדריך “Retina1”.
- חלון תמונת יופיע המציינת כי אין סרגל קנה מידה קיים. לחץ על “סגור”, תמונה של הרשתית יופיע בתיבה. דמיינו את קווי המתאר של הרשתית על ידי לחיצה על לחצן ‘מאפיינים’ בחלק העליון הימני של החלון ושינוי צבע המתאר לצבע גלוי (איור 5א).
- חשוב: ציין אם ברשתית העין הימנית או עין שמאל בחלונית בצד השמאל (איור 5א).
- לחץ על לחצן “הוסף דמעה” בצד השמאל וציין דמעה או לחתוך איפה ברשתית על ידי לחיצה על שלושת הקודקודים של הקרע (איור 5א). פעולה זו תיצור את הקווים המחברים את שלושת הקודקודים של החתך. חזור על כל חתכים ברשתית.
- ציין הרשתית הגבי על-ידי לחיצה על נקודת שרירותי של החלוקה לרמות ברשתית. אות רישית “D” יופיעו בנקודה זו החלוקה לרמות (איור 5B).
הערה: הרשתית הגבי יהיה חצי כהה של הרשתית, מול מעבר הצבע s-אופסין. עם זאת, סימון הרשתית הגבי ב Retistruct אינה שיטה אמינה לזיהוי החצי הגבי של הרשתית, כך וקביעתו של “הגבי” יכול להיות שרירותי בשלב זה. - בנייה מחדש הרשתית על ידי לחיצה על לחצן “לשחזר רשתית” בחלק העליון השמאלי של המסך (איור 5B). מגרש קוטב של הרשתית המשוחזרת יופיע עם החתכים גלוי באותו צבע כמו החלוקה לרמות (איור 5C).
- לחץ על הלחצן “שמור” בצד ימין של המסך כך הרשתית המשוחזרת ואת כל הנתונים המשויכים אליו נשמר בספריית תיקיה “Retina1” (איור 5D).
- שמור הרשתית שוחזר על ידי לחיצה על לחצן “PDF” שבלוח הימני (איור 5D). תופיע תיבת בה תישאל על גודל מפרט. גודל ברירת המחדל מקובל עבור השלבים הבאים. פעולה זו תחסוך הרשתית המשוחזרת כמו “image.polar.pdf” בספריה תיקיה “Retina1”.
- פתח את “image.polar.pdf” תוכנית לצייר (או תוכנית אחרת מניפולציה תמונה) ולהשתמש בכלי “דלי צבע” (או דומה) כדי לשנות את הרקע של הרשתית המשוחזרת לשחור. שמור הרשתית המשוחזרת כקובץ. tif, כגון “Retina1_reconstructed.tif” בספריה תיקיה “Retina1”.
הערה: הפרוטוקול אפשר לעצור כאן. - הורד את קוד MATLAB עבור סיבוב הרשתית שנקרא “Retina_Rotator.m” (ראה חומרים משלים). מקם את קובץ הקוד בתיקיה משלו עם קבצים אחרים בתיקיה.
- פתח MATLAB, גירסה 2007b או מאוחר יותר. לחץ פעמיים על הקובץ קוד כדי לפתוח אותו ב- MATLAB. בחלון הפקודה, הקלד “Retina_Rotator” ולאחר מכן ללחוץ על מקש enter. יופיע חלון החיפוש.
הערה: הקוד הוא ספציפי עבור קבצי. tif. אם הקובץ כדי לסובב אינו בתבנית הנכונה, הקוד לא יסתובב הרשתית כראוי. ראה שלבים 4.17 ו- 4.18. שהצלת הרשתית המשוחזרת בתבנית מתאימה. - פתח את הקובץ כדי לסובב. לדוגמה, בחר “Retina1_reconstructed.tif”. הקוד תנתח הרשתית המשוחזרת, תשמור אוטומטית הרשתית שסובבו כמו “Retina1_reconstructed_rotated.tif” ב- התיקיה בה ממוקם הקובץ המקורי.
- אחרי הקוד סיים ניתוח רשתית העין, גם יופיע חלון מציג את התמונות של הרשתית לפני ואחרי סיבוב להשוואה (דמויות 3B ו 3 ג; דמויות 3E ו- 3F).
הערה: קוד זה מסובב הרשתית המשוחזרת כך החצי הגחון (הבהיר) נמצא בתחתית החצי (dimmest) הגבי הוא למעלה, ובכך במדויק המכוונת הרשתית על פי ה-s-אופסין הדרגתיות1. אם אם הרשתית העין הימנית או עין שמאל תועד, המיקום של הפולנים האף ואת זמני יכול גם להיות אומדן של שיטה זו של התמצאות (איור 3).
Representative Results
Discussion
יש כבר שום פרוטוקול מקיף, מתוקננים בקביעת ולקרוא את הכיוון של הרשתית העכבר מבודד במרחב אנטומיים. הפרוטוקול מפורט כאן מנסה למלא את החלל הזה על ידי האחדת ולזהות המפרט כיצד להשתמש ציוני עמוק אנטומיים כמו נקודות כדי התייחסות אמין כיוון ברשתית. הוכח כי ציוני הדרך עמוק האנטומי של פרוטוקול זה מספק שיטה אמינה ומדויקת יותר המכוונת הרשתית עכבר מאשר ציוני דרך שטחי כגון כוויות קרניות22. לכן, מחקרים צריכים לסמוך על כוויות קרניות לאוריינטציה ברשתית אולי היו שגיאות יותר לרוחב מאשר מחקרים צריכים לסמוך על כגון פיסורה דמית העין מהשרירים rectus חוסר התאמה זה מדגיש את הצורך והמשמעות של פרוטוקול זה מתוקנן לפרש תוצאות, ביצוע השוואות בין מחקרים התלויים מדויק כיוון ברשתית. בסך הכל, פרוטוקול מתוקננת תספק שיטה נפוצה לחוקרים חזון לעקוב, וכך למנוע את הנוכחות של משתנה מבלבלים ברכישת נתונים שעשויות להתרחש עם השימוש בשיטות שאינם סטנדרטיים עבור זיהוי רשתית התמצאות.
השיטות המובאות כאן הן הדיר בקלות החלים על סוגים רבים של פרוטוקולים ניסיוני. למעשה, אחד היתרונות הגדולים של פרוטוקול זה הוא הסתגלות שלה. בגלל פיסורה דמית העין, s-אופסין ביטוי וציוני שריר rectus כל נמצאו באופן אמין לזהות כיוון ברשתית22 ציון המתאים ביותר הפרמטרים ניסיוני יכולה להיבחר כדי למטב את חדרי קירור והקפאה (טבלה 1). בנוסף, ניתן לשלב של ביתור כדי כמוסיף הכיוון של הרשתית. לדוגמה, חתכים פיסורה דמית העין יכול להיות משולב עם s-אופסין אימונוהיסטוכימיה כדי אוריינט כל ארבעה קטבים של הרשתית: ההמיספרות האף ואת זמני יכול להיות מזוהה על ידי החתכים פיסורה דמית העין, והוא יכול לזהות s-אופסין אימונוהיסטוכימיה ההמיספרות הגחון, הגבי. ובכל זאת, יכולת ההתאמה של פרוטוקול זה שתהיה מוגבל על ידי הטבע הרגיש של הפיזיולוגיה של ניסויים. כי הזמן שהדרוש כדי לזהות ציון דרך, לגרום כוויה הקרנית לבצע חתך להקלה על יכול לגרום למוות לרקמות משמעותי בניסויים ex-vivo , ייתכן שחלק אלה שיטות ניתוח פחות אופטימלית. למרבה המזל, ברגע בניתוח הפך מוכר עם פיסורה דמית העין או rectus סופריור שריר לנתיחה שיטה, זיהוי ציוני הדרך עמוק, גורם להקלה חתכים במהירות להפוך לחלק השגרה לנתיחה, אינם מוסיפים באופן משמעותי אורך חיתוך. אמנם אנו להכיר את השלבים המפורטים כאן ניתן להוסיף בזמן רגיש לזמן ניסויים, אנו ממליצים להשתמש מעבר הצבע s-אופסין לאוריינטציה ברשתית פוסט הוק כאשר הכדאיות של הרקמה הוא כבר לא מהווה בעיה (איור 3 ). צביעת הרשתית עבור s-אופסין הוא דרך יעילה אוריינט הרשתית, כמו זה יכול לזהות כל הקטבים ארבע: מכתימה s-אופסין מחלק הרשתית הפולנים הגבי ו הגחון, המאפשר זיהוי של האף ושל טמפורלית מוטות בהתאם הרשתית הוא מ. בעין ימין או שמאל (איור 3). לכן, אנו מאמינים שפרוטוקול זה מספק ערכה הדיר ואמין של שיטות לאוריינטציה ברשתית מדויק זה שיגשים את כל הפרמטרים ניסיוני.
כמו עם הקרע ברשתית, ששונה כל תוקפו של שיטת ניתוח הוא מוגבל על ידי הדיוק את בניתוח והאיכות של הרקמה אשר היה מבודד. אם כל רקמות מתנתק במהלך ניתוח או הרשתית מדי. הוא מושחת עבור שחזור מדויק, Retistruct ואת התוכנית MATLAB לא תהיה אפשרות לשחזר בצורה אמינה או אוריינט הרשתית. לכן חשוב לתרגל שיטת ניתוח לפני השימוש בו עבור איסוף נתונים ניסויים. ואילו סוגי והניתוחים שהוסבר כאן אינם קשים, עליך לתרגל על מנת להבטיח את הדיר של זיהוי הכיוון ברשתית עם נקודת ציון מסוים. יתר על כן, זה חיוני כי נעשה שימוש בפועל בניתוח חזותית זיהוי ציוני הדרך אנטומי לפני תחילת איסוף הנתונים כדי להפוך בטוח כי את ציון דרך נכונה. דרך אחת לבדוק את הדיוק של בניתוח מסוים היא לעשות גם פיסורה דמית העין חתכים או שריר מעולה חותך, ולאחר מכן השווה את המיקום של החתכים. מעבר הצבע s-אופסין, מאז היא הוא סמן קבוע, ולכן אינו תלוי הדיוק של חיתוך ש dissectors פוטנציאליים, באפשרותך להשוות את הרשתיות המשוחזרת שלהם לזה של הדוגמאות של הרשתית המשוחזרת עם ציון מדויק חתכים מוצגים באיור 1 , איור 2. בעיקרו של דבר, בניתוח פוטנציאליים צריך לבצע השלבים המתוארים פרוטוקול זה עבור סוג ניתוח מסוים, בין אם זה יהיה שריר מעולה או דמית העין פיסורה שיטה, ולהשוות את התוצאות על מעבר הצבע s-אופסין להקים את תוקפו של בניתוח מסוים. כי אם בניתוח בטוח לגבי המיקום של מלון וציון דרך, זה עלול לגרום אוריינטציה לא מדויק של הרשתית את הצוואה, כברירת מחדל, להשפיע על איסוף נתונים ופרשנות.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Materials
| 0.1 M Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | P5244 | |
| Axioplan2 Epifluorescent Microscope | Zeiss | N/A | |
| Clear Nailpolish | N/A | N/A | |
| Corning LSE Low Speed Orbital Shaker | Sigma-Aldrich | CLS6780FP | |
| Costar TC-Treated 24-well Plates | Sigma-Aldrich | CLS3524 | |
| Dissection Microscope | Olympus | SZ51 | |
| Donkey anti-Goat Alexa 594 | Life Technologies | A11058 | |
| Donkey anti-Rabbit Alexa 594 | Life Technologies | A21207 | |
| Donkey Normal Serum | Millipore | 566460 | Use at 5.2% (52 μL with 86 μL of 20% Triton X-100 and 863 μL of 0.1M PBS for 1 mL of blocking solution) |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Goat anti-s-opsin | Santa Cruz Biotechnologies | sc-14363 | Not commerically available as of 2017 |
| Graefe Curved Forceps | Fine Science Tools | 11052-10 | |
| ImageJ or FIJI | National Institute of Health | N/A | Freely available software |
| Low Temperature Cautery Ophthalmic Fine Tip Cauterizer | Bovie Medical Corporation | AA00 | |
| MATLAB | MathWorks | N/A | At least version 2007b or later |
| Micro Cover Glasses | VWR International | 48393-241 | |
| Micro Slide Trays | VWR International | 82020-913 | |
| Moira Ultra Fine Forceps | Fine Science Tools | 11370-40 | |
| Nitrocellulose membrane | Millipore | HAWP04700 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Use at 4% (25 μL and 875 μL of 0.1 M PBS for 1 mL of fixative) |
| PrecisionGlide Needle 20G (0.90 mm x 25 mm) | BD PrecisionGlide | 305175 | |
| Pyrex Glass Petri Dish | Sigma-Aldrich | CLS3160152 | |
| R | The R Project for Statistical Computing | N/A | Freely available software; version 3.4.3 or later |
| Rabbit anti-s-opsin | Millipore | ABN1660 | |
| Retiga R3 Microscope Camera | Qimaging | 01-RET-R3-R-CLR-14-C | |
| Retistruct | N/A | N/A | Freely available software compatiable with Windows 7 or Windows 10 |
| Shandon Aqua-Mount Slide Mounting Media | Fisher Scientific | 14-390-5 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Use 1.7% (86 μL of 20% Triton-X with 52 μL of Donkey Normal Serum and 863 μL of 0.1 M PBS for 1 mL of blocking solution) |
| Vannas Spring Dissection Scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | |
| 5MP USB Microscope Digital Camera | AmScope | MU500 | To be used with the Olympus Dissection Microscope |
References
- Applebury, M. L., et al. The murine cone photoreceptor: A single cone type expresses both S and M opsins with retinal spatial patterning. Neuron. 27 (3), 513-523 (2000).
- Hughes, S., Watson, T. S., Foster, R. G., Peirson, S. N., Hankins, M. W. Nonuniform distribution and spectral tuning of photosensitive retinal ganglion cells of the mouse retina. Curr Biol. 23 (17), 1696-1701 (2013).
- Sondereker, K. B., Onyak, J. R., Islam, S. W., Ross, C. L., Renna, J. M. Melanopsin ganglion cell outer retinal dendrites: Morphologically distinct and asymmetrically distributed in the mouse retina. J Comp Neurol. 525 (17), 3653-3665 (2017).
- Bleckert, A., Schwartz, G. W., Turner, M. H., Rieke, F., Wong, R. O. L. Visual space is represented by nonmatching topographies of distinct mouse retinal ganglion cell types. Current Biology. 24 (3), 310-315 (2014).
- Warwick, R. A., Kaushansky, N., Sarid, N., Golan, A., Rivlin-Etzion, M. Inhomogeneous Encoding of the Visual Field in the Mouse Retina. Curr Biol. 28 (5), 655-665 (2018).
- Valiente-Soriano, F. J., et al. Distribution of melanopsin positive neurons in pigmented and albino mice: evidence for melanopsin interneurons in the mouse retina. Front Neuroanat. 8, 131 (2014).
- Sabbah, S., et al. A retinal code for motion along the gravitational and body axes. Nature. 546 (7659), 492-497 (2017).
- Vaney, D. I., Sivyer, B., Taylor, W. R. Direction selectivity in the retina: Symmetry and asymmetry in structure and function. Nat Rev Neurosci. 13 (3), 194-208 (2012).
- Huberman, A. D., et al. Genetic identification of an On-Off direction-selective retinal ganglion cell subtype reveals a layer-specific subcortical map of posterior motion. Neuron. 62 (3), 327-334 (2009).
- Ueki, Y., Ramirez, G., Salcedo, E., Stabio, M. E., Lefcort, F. Loss of Ikbkap causes slow, progressive retinal degeneration in a mouse model of familial dysautonomia. eNeuro. 3 (5), (2016).
- Maiorano, N. A., Hindges, R. Restricted perinatal retinal degeneration induces retina reshaping and correlated structural rearrangement of the retinotopic map. Nat Commun. 4, 1938 (2013).
- Hadj-Said, W., et al. Quantitative and topographical analysis of the losses of cone photoreceptors and retinal ganglion cells under taurine depletion. Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (11), 4692-4703 (2016).
- Tao, Y., et al. The temporal topography of the N-Methyl- N-nitrosourea induced photoreceptor degeneration in mouse retina. Sci Rep. 5, 18612 (2015).
- Risner, M. L., Pasini, S., Cooper, M. L., Lambert, W. S., Calkins, D. J. Axogenic mechanism enhances retinal ganglion cell excitability during early progression in glaucoma. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2018).
- Estevez, M. E., et al. Form and function of the M4 cell, an intrinsically photosensitive retinal ganglion cell type contributing to geniculocortical vision. J Neurosci. 32 (39), 13608-13620 (2012).
- Kolesnikov, A. V., Kefalov, V. J. Transretinal ERG recordings from mouse retina: Rod and cone photoresponses. J Vis Exp. (61), (2012).
- Lin, B., Wang, S. W., Masland, R. H. Retinal ganglion cell type, size, and spacing can be specified independent of homotypic dendritic contacts. Neuron. 43 (4), 475-485 (2004).
- Ortin-Martinez, A., et al. Number and distribution of mouse retinal cone photoreceptors: differences between an albino (Swiss) and a pigmented (C57/BL6) strain. PLoS One. 9 (7), 102392 (2014).
- Zhang, H., et al. The degeneration and apoptosis patterns of cone photoreceptors in rd11 Mice. J Ophthalmol. 2017, 9721362 (2017).
- Wei, W., Elstrott, J., Feller, M. B. Two-photon targeted recording of GFP-expressing neurons for light responses and live-cell imaging in the mouse retina. Nat Protoc. 5 (7), 1347-1352 (2010).
- Wang, J., et al. Anatomy and spatial organization of Muller glia in mouse retina. J Comp Neurol. 525 (8), 1759-1777 (2017).
- Stabio, M. E., et al. A novel map of the mouse eye for orienting retinal topography in anatomical space. J Comp Neurol. 526 (11), (2018).
- Lamb, T. D., Collin, S. P., Pugh, E. N. Evolution of the vertebrate eye: Opsins, photoreceptors, retina and eye cup. Nat Rev Neurosci. 8 (12), 960-976 (2007).
- Sterratt, D. C., Lyngholm, D., Willshaw, D. J., Thompson, I. D. Standard anatomical and visual space for the mouse retina: Computational reconstruction and transformation of flattened retinae with the Retistruct package. PLoS Comput Biol. 9 (2), 1002921 (2013).
