הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

Sensillum אחת ההקלטות של ארבה משוש Sensilla Basiconica

8.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/57863

⸱

23 ביוני 2018

 ,  , 
1Department of Entomology, China Agricultural University, 2Bio-tech Research Center, Shandong Academy of Agricultural Sciences

במאמר זה

סיכום

מאמר זה מתאר פרוטוקול מפורט ויעיל עבור הקלטות יחיד sensillum basiconica sensilla קאלאמרי של חרקים mouthparts.

תקציר

קאלאמרי של ארבה mouthparts נחשבים קונבנציונאלי איברים הטעם יש תפקיד חשוב בבחירת מזון של חגבים, במיוחד עבור זיהוי סימנים כימיים לא נדיף דרך chaetica sensilla (בעבר בשם sensilla מסוף או sensilla מצויץ). יש עכשיו הגדלת ראיות כי קאלאמרי אלה יש גם תפקיד חוש הריח. קולטן של odorant (LmigOR2) וחלבון מחייב odorant (LmigOBP1) הותאמו נוירונים, תאים אביזר, בהתאמה, ל- basiconica sensilla של קאלאמרי. Sensillum יחיד הקלטה (הסובייטית) משמש עבור הקלטת את התגובות של הנוירונים קולטן odorant, אשר היא שיטה יעילה לסינון ליגנדים פעיל על קולטנים ספציפיים odorant. הסובייטית משמשת במחקרים פונקציונלי של רצפטורים odorant sensilla משוש. מבנה basiconica sensilla ממוקם על הכיפה של קאלאמרי שונה במקצת מן המבנה של אלה על מחושיהם. לכן, בעת ביצוע של הסובייטית שהפיק odorants, עצה מסוים עשוי להיות שימושי להשגת תוצאות אופטימליות. בנייר זה, הוא הציג נוהל מפורט ויעיל עבור הסובייטית מן basiconica sensilla משוש חרקים.

מבוא

בעלי החיים התפתחו מגוון של איברים chemosensory חש סימנים כימיים אקסוגני. בחרקים, chemosensory האברים החשובים ביותר הם מחושיהם את קאלאמרי. על האיברים האלה, מספר סוגים של שערות chemosensory, שנקרא chemosensory sensilla, הם innervated על ידי נוירונים chemosensory (CSNs) בתוך השערות. CSNs ב chemosensory sensilla מזהה סימנים כימיים ספציפיים באמצעות אותות מן גירויים כימיים כדי פוטנציאל חשמלי לאחר מכן מועברים עד מערכות העצבים המרכזית1,2,3 .

CSNs אקספרס שונים chemosensory רצפטורים [למשל, odorant רצפטורים (ORs)], ionotropic רצפטורים (מס הכנסה), ואת הטעם רצפטורים (GRs) על הקרומים שלהם, אשר לקודד סימנים כימיים אקסוגני הקשורים עם סוגים שונים של chemosensation 45,,6. אפיון CSNs היא המפתח הבהרה של מנגנונים תאית ומולקולרית של חרקים chemoreception. עכשיו sensillum יחיד הקלטה (הסובייטית) היא טכניקה נפוץ עבור אפיון חרקים CSNs, sensilla antennal של חרקים רבים, כולל זבובים7, חיפושיות עש8,9, כנימות10, ארבה11, ו נמלים12. עם זאת, מחקרים מעטים החילו הסובייטית של חרקים קאלאמרי13,14,15,16,17, כי המבנים מסוים של sensilla שלהם הקלטה אלקטרופיזיולוגיות קשה18.

נחילי ארבה (חגבאים) לעיתים קרובות לגרום נזק רציני חיתוך והפסד כלכלי19. קאלאמרי הסברה יש תפקיד חשוב בבחירת מזון ארבה20,21,22,23,24. שני סוגי chemosensory sensilla נחקרות על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה (SEM). בדרך כלל, chaetica 350 sensilla ו- 7-8 sensilla basiconica הם נצפו על כל כיפת קאלאמרי locust18. Sensilla chaetica הם sensilla הטעם המרגישות לא נדיף רמזים כימי, ואילו sensilla basiconica יש תפקיד חוש הריח, חש סימנים כימיים נדיפים.

על קאלאמרי המדומה, הקוטר של אדני שיער basiconica sensilla (ca. 12 מיקרומטר), גדולים הרבה יותר מאשר אלו של sensilla chaetica (ca. 8 מיקרומטר)18,25. קיר cuticular basiconica sensilla על קאלאמרי הוא הרבה יותר עבה מזה של antennal sensilla18. בנוסף, הכיפה של משוש יש בתכולת בתוך הקוטיקולה גמיש במיוחד. מאפיינים אלו אומר חדירה ועם microelectrode של הרכישה של אותות אלקטרופיזיולוגיות טוב הוא קשה יותר מאשר עבור antennal sensilla. בנייר זה, פרוטוקול הסובייטית מפורט ויעיל עבור locust משוש sensilla basiconica מוצג עם וידאו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכנת כלי נגינה, חרק

  1. הכנת טונגסטן אלקטרודות ופתרונות גירויים
    1. תקן חדש תיל טונגסטן (קוטר של 0.125 מ מ, אורך 75 מ מ) לתוך micromanipulator, לחדד את זה ב- 10% (w/v) נתרן חנקיתי (ננו2) הפתרון של מזרק 10 V המסופקים על ידי ספק כוח של 1 דקות תחת stereomicroscope (40 X הגדלה).
    2. טובלים את החוט טונגסטן מחודדים שוב ושוב לתוך הפתרון2 ננו 10%, כ- 4 מ מ- 5 V ב- < 1דקות (איור 1 א').
    3. לבחון את הקוטר של קצה טונגסטן מחודדים לעתים קרובות תחת stereomicroscope עד שזה מספיק בסדר כדי לחדור את הקוטיקולה של sensillum חוש הריח משוש (איור 1B) ארבה.
    4. הכינו את הפתרונות הגירוי. לדלל את כל החומר גירוי כימי בתוך שמן מינרלי. למהול 1-nonanol וחומצה nonanoic-דילולים 10%. לדלל E-2-hexenal ו- hexanal ב- 10-2, 10-3, 10-4ו- 10-5.
    5. להכין פסטר טורפדו נושאת הגירויים: להוסיף רצועות נייר סינון (באורך של 2 ס מ, ברוחב של 0.5 ס מ) לתוך הצינורות פסטר, להוסיף רצועות נייר סינון הפתרונות גירוי מדולל (כל 10 µl) ולאחר מכן לחבר את הצינורות פסטר עם טיפים פיפטה (1 מ"ל).
  2. להכין את החרק
    1. אחורי ארבה (Locusta migratoria) עם חיטה טרי שתילים בתנאים צפופים של הלחות היחסית של 60%, לטמפרטורה של 28-30 מעלות צלזיוס, וכן את photoperiod של 18:6 h (בהירה: כהה). לבחור 1 עד 3-בת 5th וחמישית locust ולהסיר מחושיהם במספריים בסדר כדי למנוע כל הפרעה בעת הקלטה.
  3. הכנת המחזיק משוש בלסת העליונה ארבה
    1. להשתמש שקופית מזכוכית (25 מ"מ x 75 מ"מ) כבסיס של המחזיק משוש בלסת העליונה (קמ"ש). להצמיד פיסת פלסטיק (1 מ מ גובה, 10 מ מ רוחב, 35 מ מ אורך) לפינה של השקופית זכוכית עם דבק דו צדדי, ואין סוף סוף לתקן את כיסוי זכוכית (18 מ מ x 18 מ"מ) על גבי פיסת פלסטיק עם דבק דו צדדי. מניחים חתיכה קטנה של נייר דבק גומי אדום לתוך הזכוכית המכסה כשכבה החלקה. את פיסת פלסטיק וזכוכית כיסוי מהווים פלטפורמה משוש המדומה. הגובה של פלטפורמת הוא כ- 1.5 מ מ.
    2. התקנת חוט טונגסטן (קוטר של 0.125 מ מ, אורך 36 מ מ) במרחק של 1.5 מ מ מקביל הבתוך קצה של הפלטפורמה. לתקן את שני הקצוות של הכבל אל הרציף עם דבק דו צדדי.

2. הכנת קאלאמרי בלסת העליונה ארבה

  1. לחצי שפופרת צנטרפוגה (1.5 מ"ל) אנכית, לחתוך את החלק התחתון. מקם את השיטה המדומה לתוך הצינור מוכן. להשאיר את האזור הגחון ואת ראש העץ חשוף. לתקן את מכלול לשקופית זכוכית עם סרט דביק דו-צדדי (איור 2 א).
  2. משוך את משוש נכון בלסת העליונה על הפלטפורמה.
  3. סיכנה את החוט טונגסטן קטע רביעי של משוש. במקום מרק דבק על כל צד של הכבל טונגסטן, בערך 2 מ מ משוש בלסת העליונה (איור 2A ו- 2B).

3. יחידה Sensillum הקלטות

  1. מקום הכנת משוש בלסת העליונה locust תחת מיקרוסקופ בהגדלה גדולה נמוך (100 X). התאם את המיקום של ההכנה עד הוא בניצב האלקטרודה הקלטה (איור 3 א).
  2. הכנס האלקטרודה הפניה (אלקטרודה טונגסטן) לתוך העין המדומה באמצעות של micromanipulator. להעביר האלקטרודה הקלטה (אלקטרודה טונגסטן) קרוב משוש בלסת העליונה עם micromanipulator (איור 3B ו- 3 C).
  3. להתאים את המכשיר מסירה ריח כ-1 ס מ מ משוש בלסת העליונה (איור 3B).
  4. פתח את תוכנת הקלטה אוטומטית ספייק 32. הגדר את פרמטרי הקלטה כדלקמן: קנה המידה של הקלטה על 500 µV; החיתוך גבוה של המסנן על 300 הרץ, החיתוך נמוך ב- 200 הרץ; את pretrigger על 10 s.
  5. להתחבר האלקטרודה הקלטה 10 x מגבר ac/DC אוניברסליים.
  6. לעבור המיקרוסקופ בהגדלה גדולה (500 X). הוספת האלקטרודה הקלטה לתוך הבסיס של sensillum basiconic על משוש בלסת העליונה, בעדינות לכוון האלקטרודה הקלטה להשיג טוב ספונטני קוצים (דמות תלת-ממד).
  7. פתוח הבקר גירוי לספק זרם אוויר רציפה ב- 20 מ ל/ש לקבוע את הזמן גירוי לאותות 1 ס' רשומה עבור 10 s, מתחיל 10 s לפני התחלתה של הדופק הגירוי.
  8. השתמש מגבר ac/DC אוניברסליים 10 x כדי להגביר את האותות. להאכיל את האותות לתוך IDAC 4. לנתח את האותות בתוכנת ה-32 ספייק אוטומטית. AC אותות הם הלהקה לעבור סינון בין 200 ל 300 הרץ. שימוש אוטומטי ספייק 32 לבידול שיא-אל-שוקת amplitudes קולות. לחשב את התגובות של הנוירונים כמו העליות בתדרים פוטנציאל הפעולה (קוצים לשניה) על התדרים ספונטנית. לבצע ניתוח סטטיסטי באמצעות מנסרה GraphPad 7.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

שני sensilla יחוברו (pb1 ו- pb2) על משוש בלסת העליונה ארבה מזוהים על סמך התגובה שונה dynamics כדי odorants כימי (10% 1-nonanol ו- 10% חומצה nonanoic). הנוירונים ב- pb1 מייצרים קוצים יותר באופן משמעותי כדי 1-nonanol ליצירת חומצה nonanoic תוך הנוירונים ב- pb2, משמעותית שפחות מופעל על ידי 1-nonanol לעומת nonanoic חומצה (איור 4). Hexanal ו- E-2-Hexenal יכול לעורר משוש locust פתיחת התגובה (POR)26. Hexanal הוא המארח שופע צמח ירוק עלה נדיפים ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

חרקים מסתמכים על קאלאמרי לזהות ריחות האוכל, והאמינו קאלאמרי שלהם הם לשחק תפקיד חשוב היווצרות המינים13,27. קאלאמרי איברי חוש הריח פשוט, מקבלים תשומת לב גדלה והולכת ככל מודל אטרקטיבי עבור חקר neuromolecular רשתות chemosensation כבסיס28.

חרק labellar, ברית המועצות משוש בהצלחה בוצעו על דרוזופילה melanogaster, אנופלס gambiae כולכית quinquefasciatus13,

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמך על ידי מענק של נבחרת מדעי הטבע קרן של סין (No.31472037). כל אזכור של שמות מסחריים או מוצרים מסחריים במאמר זה היא אך ורק לצורך אספקת מידע ספציפי, לא משתמע המלצה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
חוט טונגסטןADVENTW559504משמש לייצור האלקטרודה ולקיבוע המישוש
NaNO2Sigma-aldrich563218-25Gמשמש לחידוד חוט הטונגסטן
ספק כוח ACSyntechA2-70מתן המתח בחידוד חוט הטונגסטן
סטריאוסקופמוטיקSMZ-163משמש לתצפית על חידוד חוט טונגסטן
מיקרוסקופאולימפוסW-51משמש להתבוננות בסנסילה על ארבה מקסילרי מישוש
רכישת נתונים חכםSyntechIDAC-4תצוגה בזמן אמת על המסך של כל האותות לפני ובמהלך ההקלטה
בקר גירויSyntechCS-55משמש לשליטה ביישום הגירוי
אלקטרוני מיקרומניפולטורC.M.D.TCFT-8301Dמשמש לתנועה קלה של אלקטרודת ההקלטה
מיקרומניפולטורNarishigeMN-151משמש לתנועה קלה של אלקטרודת הייחוס
רמקולEDIFIERR101T06מחובר ל-IDAC-4 ומספק צליל לאות
בסיס מגנטיPDOKPD-101משמש להחזקת האלקטרודה וצינור אספקת הגירוי
שולחן בידוד רטטTianHeHAP-100-1208משמש לבידוד הרטט מהציוד
מגלשת זכוכיתCITOGLASZBP-407משמש להכנת הבסיס ל-MPH
Blu-tackBostikBlu-tack-45gקיבוע חוט הטונגסטן
צינור פסטרYAREWITEGהנחת נייר הסינון המכיל פתרונות גירוי גירויים
בקר

מקורות

  1. Carey, A. F., Carlson, J. R. Insect olfaction from model systems to disease control. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (32), 12987-12995 (2011).
  2. Leal, W. S. Odorant reception in insects: roles of receptors, binding proteins, and degrading enzymes. Annual Review of Entomology. 58, 373-391 (2013).
  3. Zhang, J., Walker, W. B., Wang, G. Pheromone reception in moths: from molecules to behaviors. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 130, 109-128 (2015).
  4. Vosshall, L. B., Amrein, H., Morozov, P. S., Rzhetsky, A., Axel, R. A spatial map of olfactory receptor expression in the Drosophila antenna. Cell. 96 (5), 725-736 (1999).
  5. Benton, R., Vannice, K. S., Gomez-Diaz, C., Vosshall, L. B. Variant ionotropic glutamate receptors as chemosensory receptors in Drosophila. Cell. 136 (1), 149-162 (2009).
  6. Vosshall, L. B., Stocker, R. F. Molecular architecture of smell and taste in Drosophila. Annual Review of Neuroscience. 30, 505-533 (2007).
  7. de Bruyne, M., Foster, K., Carlson, J. R. Odor coding in the Drosophila antenna. Neuron. 30, 537-552 (2001).
  8. Roelofs, W., et al. Sex pheromone production and perception in European corn borer moths is determined by both autosomal and sex-linked genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (21), 7585-7589 (1987).
  9. Larsson, M. C., Leal, W. S., Hansson, B. S. Olfactory receptor neurons detecting plant odours and male volatiles in Anomala cuprea beetles (Coleoptera: Scarabaeidae). Journal of Insect Physiology. 47 (9), 1065-1076 (2001).
  10. Zhang, R., et al. Molecular basis of alarm pheromone detection in aphids. Current Biology. 27 (1), 55-61 (2017).
  11. Cui, X., Wu, C., Zhang, L. Electrophysiological response patterns of 16 olfactory neurons from the trichoid sensilla to odorant from fecal volatiles in the locust, Locusta migratoria manilensis. Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 77 (2), 45-57 (2011).
  12. Sharma, K. R., et al. Cuticular hydrocarbon pheromones for social behavior and their coding in the ant antenna. Cell Reports. 12 (8), 1261-1271 (2015).
  13. de Bruyne, M., Clyne, P. J., Carlson, J. R. Odor coding in a model olfactory organ: the Drosophila maxillary palp. Journal of Neuroscience. 19 (11), 4520-4532 (1999).
  14. Syed, Z., Leal, W. S. Maxillary palps are broad spectrum odorant detectors in Culex quinquefasciatus. Chemical Senses. 32 (8), 727-738 (2007).
  15. Lu, T., et al. Odor coding in the maxillary palp of the malaria vector mosquito Anopheles gambiae. Current Biology. 17 (18), 1533-1544 (2007).
  16. Pellegrino, M., Nakagawa, T., Vosshall, L. B. Single sensillum recordings in the insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae. Journal of Visualized Experiments. 36, e1725(2010).
  17. Grant, A. J., Wigton, B. E., Aghajanian, J. G., O'Connell, R. J. Electrophysiological responses of receptor neurons in mosquito maxillary palp sensilla to carbon dioxide. Journal of Comparative Physiology A. 177 (4), 389-396 (1995).
  18. Blaney, W. The ultrastructure of an olfactory sensillum on the maxillary palps of Locusta migratoria (L.). Cell and Tissue Research. 184 (3), 397-409 (1977).
  19. Hassanali, A., Njagi, P. G. N., Bashir, M. O. Chemical ecology of locusts and related acridids. Annual Review of Entomology. 50, 223-245 (2005).
  20. Chapman, R. F. Contact chemoreception in feeding by phytophagous insects. Annual Review of Entomology. 48, 455-484 (2003).
  21. Chapman, R. F., Sword, G. The importance of palpation in food selection by a polyphagous grasshopper (Orthoptera: Acrididae). Journal of Insect Behavior. 6, 79-91 (1993).
  22. Winstanley, C., Blaney, W. Chemosensory mechanisms of locusts in relation to feeding. Entomologia Experimentalis et Applicata. 24, 750-758 (1978).
  23. Blaney, W., Duckett, A. The significance of palpation by the maxillary palps of Locusta migratoria (L.): an electrophysiological and behavioural study. Journal of Experimental Biology. 63, 701-712 (1975).
  24. Blaney, W. Electrophysiological responses of the terminal sensilla on the maxillary palps of Locusta migratoria (L.) to some electrolytes and non-electrolytes. Journal of Experimental Biology. 60, 275-293 (1974).
  25. Jin, X., Zhang, S., Zhang, L. Expression of odorant-binding and chemosensory proteins and spatial map of chemosensilla on labial palps of Locusta migratoria (Orthoptera: Acrididae). Anthropod Structure & Development. 35 (1), 47-56 (2006).
  26. Zhang, L., Li, H., Zhang, L. Two olfactory pathways to detect aldehydes on locust mouthpart. International Journal of Biological Sciences. 13 (6), 759-771 (2017).
  27. Dweck, H. K. M., et al. Olfactory channels associated with the Drosophila maxillary palp mediate short- and long-range attraction. eLife. 5, e14925(2016).
  28. Bohbot, J. D., Sparks, J. T., Dickens, J. C. The maxillary palp of Aedes aegypti, a model of multisensory Integration. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 48, 29-39 (2014).
  29. Delventhal, R., Kiely, A., Carlson, J. R. Electrophysiological recording from Drosophila labellar taste sensilla. Journal of Visualized Experiments. 84, e51355(2014).
  30. Ng, R., Lin, H. H., Wang, J. W., Su, C. Y. Electrophysiological recording from Drosophila trichoid sensilla in response to odorants of low volatility. Journal of Visualized Experiments. 125, e56147(2017).
  31. Syed, Z., Leal, W. S. Electrophysiological measurements from a moth olfactory system. Journal of Visualized Experiments. 49, e2489(2011).
  32. Saha, D., Leong, K., Katta, N., Raman, B. Multi-unit recording methods to characterize neural activity in the locust (Schistocerca Americana) olfactory circuits. Journal of Visualized Experiments. 71, e50139(2013).
  33. Liu, F., Liu, N. Using single sensillum recording to detect olfactory neuron responses of bed bugs to semiochemicals. Journal of Visualized Experiments. 107, e53337(2016).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

הקלטה מסנסילום בודדאלקטרודת טונגסטןקולטן ריחגירוי כימימחוש לסתאלקטרופיזיולוגיהחוש הריח של חרקיםהכנת סנסילום
Sensillum אחת ההקלטות של ארבה משוש Sensilla Basiconica
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.