מאמר שיטה

Cytometry זרימה מונחה מסד הנתונים להערכה של התבגרות התא מיאלואידית מח עצם

DOI:

10.3791/57867

⸱

3 בנובמבר 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Hematology, University Hospital of Saint-Etienne, 2Department of Immunology, University Hospital of Grenoble-Alpes, 3Department Hematology, University Hospital of Clermont-Ferrand, 4Department of Immunology, University Hospital of Nice, 5Department of Biopathology, Institute Paoli-Calmettes, 6Department of Hematology, University Hospital of Lille

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

האבחנה MDS קשה בהיעדר קריטריון מורפולוגי או ציטוגנטיקה אינפורמטיבי. MFC יכול לעזור לעדן את תהליך האבחון של MDS. כדי להיות שימושי עבור הקלינית, הניתוח MFC חייבת להתבסס על פרמטרים מספיקה ירידה לפרטים ורגישות, נתונים צריכים להיות לשחזור בין המפעילים השונים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קבוצת עבודה יזם בתוך האגודה Cytometry צרפתית (AFC) פותחה ומשתלבת בהרמוניה היישום של cytometry זרימה multiparameter (MFC) עבור אבחון מחלת מיאלואידית בצרפת. פרוטוקול המובאת כאן הייתה מוסכמת ושימושית בין ספטמבר 2013 בנובמבר 2015 שש מעבדות אבחון צרפתי (בתי חולים אוניברסיטאיים Saint-Etienne, גרנובל, פראנד, ניס, ואת ליל אינסטיטוט פאולי-Calmettes ב מרסיי) והתירו את התקינה של הכנה דגימת מח עצם ורכישת נתונים. שלושה מסדי נתונים ההבשלה פותחו עבור נויטרופילים, monocytic, ו erythroid שושלות עם מח עצם מאנשים התורם "בריא" (יחידים ללא ראיות של מחלה hematopoietic). שיטה חזקה של ניתוח עבור כל השושלת מיאלואידית צריך להיות ישימים עבור שימוש לאבחון שגרתי. מקרים חדשים יכול להיות מנותח באופן זהה, לעומת נגד מסד הנתונים הרגיל. לפיכך, ניתן לזהות חריגות פנוטיפי כמותיים ואיכותניים, אלה מעל 2SD לעומת הנתונים של דגימות מח עצם נורמלי לשקול מעידה על פתולוגיה. המגבלה העיקרית היא ההשתנות גבוה יותר בין נתוני מושגת באמצעות נוגדנים חד-שבטיים שהושג עם השיטות המבוססים על טכנולוגיות ליפידים ומשמשים כיום אבחון קליני. הגדרת קריטריונים עבור אימות טכני של הנתונים רכשה עשוי לסייע בשיפור השירות של MFC לאבחונים MDS. הקמתה של קריטריונים אלה דורש ניתוח מול מסד נתונים. ההפחתה של החוקר הסובייקטיביות בניתוח נתונים היא יתרון חשוב של שיטה זו.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בהיעדר ספציפית לשינויים dysplastic המתרחשים בתאי מיאלואידית במהלך החניכה MDS, התקדמות פנוטיפי סמנים, גישה חדשה הוצע בשנים האחרונות, בהתבסס על הערכת המסלולים ההבשלה (ביטוי שונה של אנטיגנים מיאלואידית במהלך הייצור של התאים מיאלואידית בוגרים) או של התפלגות נורמלית של סוגי תאים שונים בתוך מח העצם (מוניטור) תאים תאים1,2.

מאמר זה מציג שיטה חדשה עבור יישום מתוקננת של MFC כדי לזהות שינויים dysplastic בתאים התאים מיאלואידית מוניטור הקשורות תסמונות myelodysplastic (MDS) או מחלות אחרות hematological מיאלואידית. מחקר זה מראה גם את תוכנית השירות של שימוש ההבשלה מסדי נתונים עבור ניתוח נתונים MFC.

סטנדרטיזציה של הליך הכנת המדגם, חדרי קירור והקפאה, ניתוח באמצעות מסדי הנתונים יאפשר זיהוי ליקויים פנוטיפי הרלוונטיים ביותר הקשורים לשינויים dysplastic בתאי מיאלואידית מוניטור. לכן, קבוצות משנה סטטיסטית הנבחר בהתבסס על תבניות הלחצנים הוסף מוכרת היטב (דיאגרמות מפריד האוכלוסייה אוטומטי (APS), היסטוגרמות, וחלקות נקודה) נדרשים עבור פיתוח אסטרטגיית ניתוח יכול לשמש לאחר מכן ניתוח סיבובים. גילוי מומים פנוטיפי חזק ב- MDS תקל את האבחנה במקרים עם או ללא דיספלזיה מורפולוגי מינימלית וללא cytogenetic aberrancies. זיהוי של פרמטרים מפלה המאפשר צמצום של לוחות immunophenotypic עשויה לפשט הנוכחי ציונים2, המתיר שלהם הישימות במעבדות קליניות פתולוגיות.

שיטה זו מגבילה את הפרשנות הסובייקטיבית של cytometry נתונים, כמו היה לשלוח אותן ב- MDS אבחון3. שלב זה הוא תנאי הכרחי להתפתחות של כלים אוטומטיים עבור עיבוד וניתוח זרימת נתונים4.

MDS כוללת קבוצה הטרוגנית של הפרעות המשובטים תאי גזע hematopoietic (HSC) שבו מוטציות ספלייסוזום לשתף פעולה עם הספציפיים המגבילים epigenetic להניב תשואה של פנוטיפ MDS. כיום ידוע כי יחד עם מועדון הכדורגל מונפלייה מוטציות, מנגנונים אחרים המעורבים פתופסיולוגיה MDS, כגון דלקת בתיווך החיסונית סוטה אינטראקציות בין ממאיר HSCs את microenvironment סטרומה של ויטביע. עם זאת, מנגנונים אלה נשארים ממעטים להבין. הטרוגניות לרווחה קליניים והביולוגיה של MDS הופך האבחון, הבחירה של הטיפול האופטימלי אתגר. בעשור האחרון, מחקרים רבים הראו כי ה-MFC הוא לעיתים קרובות יותר רגיש באיתור דיספלזיה2 יותר מורפולוגיה, אבל אילוצים טכניים וכלכליים לעשות את הטכניקה הזו קשה לתקנן, עם תוצאות קרובות בהתאם ניסיון של מתורגמן3. בנוסף, לא ברור איך MFC יכול להטות את הכף לכיוון MDS במקרים עם או ללא דיספלזיה מורפולוגי מינימלי, בהיעדר חריגות cytogenetic, או במקרים גבוליים כגון hypocellular MDS, עם ספירה נמוכה הפיצוץ, מן מוניטור אחרים שאינם המשובטים הפרעות כגון אי ספיקת מח עצם (כלומר., אנמיה אפלסטית). זה גם נשאר קשה להבדיל בין מקרים גבוליים של MDS עם עודף של תקיעות לוקמיה מיאלואידית חריפה (AML). מכל הסיבות האלה, ההנחיות הקלינית אינם משתלבים MFC בדיקות לתוך האבחנה הסופית של MDS. בשנת 2011, ארצות הברית הלאומית מקיף סרטן רשת (NCCN) מומלצת MFC ההערכה של האחוז של תאי CD34 +, זיהוי של שיבוטים hemoglobinuria ליליות התקפי, ונוכחות של שיבוטים ציטוטוקסיות תא T ב- MDS hypocellular5. אלה שני מצבים האחרון כרוך גם מטרה טיפולית כי נתונים קליניים הראו תגובה טובה של חולים אלו טיפול לדיכוי המערכת החיסונית6. הנחיות NCCN 2017, בצטטו את המלצות קבוצת העבודה הבינלאומית (IWG), רשום immunophenotyping סוטה זיהוי על-ידי MFC מהקריטריונים שיתוף לאבחון MDS, אך ללא ביצוע כל מפרטי6. בנוסף, סיווג WHO שפורסמו לאחרונה קובע כי הממצאים MFC לבד אינן מספיקות כדי לבסס אבחון ראשי של MDS, בהעדר נתונים מורפולוגיים ו/או cytogenetic חד7. עם זאת, MFC יכול לשמש מבחן נוסף מציג dysregulation של התאים מיאלואידית ההבשלה דפוסי וכימות "מרחק מן הרגיל" עבור חולה בזמן מסוים בקורס המחלה.

שיטה זו ישימה במעבדות קליניות מעוניין בהערכה של דיספלזיה בתאי מיאלואידית מוניטור באמצעות MFC immunophenotyping, על מנת לחדד את האבחנה MDS או הפרעות אחרות מיאלואידית עם מומים dysplastic.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול המפורטים להלן אושרה על ידי "Comité דה הגנה des Personnes" (ועדת האתיקה Independant) Sud-Est 1 מ אוניברסיטת בית החולים של Saint-Etienne, צרפת.

1. Cytometer הגדרות

הערה: ההגדרות cytometer בוצעו על פי המלצות צרפת לזרום, על פי נוהל EuroFlow "EuroFlow תקן הפעלה פרוטוקול (SOP) עבור כלי ההתקנה ופיצויים (https://www.euroflow.org/usr/pub/protocols.php).

  1. התקנת מכשיר חודשי
    1. הפעל את cytometer. להבטיח כי כל רמות הנוזלים הדיווה המתאים ופתוח 6.1.3. לבצע אתחול פלואידיקה: שורת התפריט, בחר ' Cytometer | פלואידיקה אתחול '. לחץ על 'אישור' כאשר תתבקש לעשות זאת. אפשר cytometer את לחמם במשך לפחות 30 דקות.
    2. בדיקת הביצועים - החרוזים CST
      הערה: בשלב זה, להכין 12 75 מ מ פוליסטירן שפופרת, חרוזים CST ונוזלים נדן (ראה טבלה של חומרים).
      1. תווית צינור פוליסטירן של2 מ מ 12 x 75 'CST'. מערבבים את המבחנה חרוז שסופק על-ידי היפוך עדין או vortexing עדין מאוד. להוסיף הצינור שכותרתו: 0.35 מ של נוזל הנרתיק וטיפה 1 של חרוזים CST. מערבולת הצינור בעדינות והמשך רכישה. אחסן את הצינור עבור עד 8 שעות ב 2-25 ° C בחושך אם לא רכישת מיד.
      2. לבצע את בדיקת ביצועים: שורת התפריט, בחר ' Cytometer | CST'.
      3. בכרטיסיה 'הגדרות' של המודול CST: לאשר את Canto II כמו תצורת ברירת המחדל של 4-2 H-2V, גם לאשר כי תוכנית בסיסית שנוצרו באמצעות המגרש הנוכחי של חרוזים CST קיים עבור תצורה זו. אם לא קיימת תוכנית בסיסית, להפנות IFU חרוזים CST. לאשר כי בסיסית זו לא פג: תחת ' הגדרת בקרה ', בחר ' לבדוק את הביצועים מתוך התפריט הנפתח.
      4. בדוק 'לטעון את הרכבת התחתית באופן ידני' ולחץ על 'הפעל'. אשר מוצג המספר רבים. מערבולת החרוזים מדולל המוכן מעל ובעדינות כשתתבקש, לטעון את החרוזים מדולל ולחץ על 'אישור'.
      5. בסיום בדיקת ביצועים, ודא כי עברה Cytometer ביצועים. לחץ על 'הצג דוח'. הפעל מחדש את הבדיקה ביצועים אם התוצאות לא עבר. לשמור את הדוח בפורמט PDF עם תאריך דוח מעקב אחר ביצועים.
    3. התאם 'PMT פלורסנט המתחים' עם קשת חרוזים (טבלה של חומרים).
      הערה: ערכי היעד הם התנה ב Euroflow סטנדרטי (SOP) שכותרתו "20180302_7th_Peak_Target_Values_Rainbow_Beads". נוהל זה זמינה באתר Euroflow (www.euroflow.org; באזור הציבורי; הכרטיסיה פרוטוקולים).
      1. ליצור התנסות חדשה באמצעות ' חודשי תאריך ההתקנה מכשיר | הדגימה '.
      2. ', לבחור את הפרמטרים אופטי fluorochromes המקביל מודאג הצינורות (FITC, PE, PerCPCy5.5, PE-Cy7, APC, APC-H7, V450, V500), ולבדוק את הפרמטרים הרצויים רכישה (היומן, א, ח ו / או W). החלת הגדרות CST הנוכחי (הימני, לחץ על ' הגדרות Cytometer' של הניסוי). להגדיר את הסף עבור פרמטר FSC 10,000.
      3. -Cytometer, לבטל את הפיצוי בעת הגדרת פלורסצנטיות PMT מתחים עבור הגדרת היעד MFI; לענין זה, נכנסים 'מפקח', נווט אל הכרטיסיה 'פיצויים' בטל פיצוי על-ידי האפשרות ' לאפשר פיצוי ' unchecking.
      4. ליצור גליון עבודה ' היעד MFI' עם כל נקודה הכרחי חלקות (n = 2; FSC נגד האס, FITC לעומת PE), היסטוגרמות (n = היסטוגרמה 8; אחד עבור כל גלאי קרינה פלואורסצנטית) ונתונים סטטיסטיים מציג ההפניה השיא לערכים (MFI, CV) לכל ערוץ זריחה.
      5. לדלל טיפה 1 של 8-לשיא הקשת חרוזים כיול חלקיקים ב 1 מ"ל של מים מזוקקים, מערבולת לפני השימוש. רוכשים ללא הקלטה הפתרון חרוזים 8-לשיא הקשת בקצב זרימה 'נמוך' . אחסן את הצינור עבור עד 8 שעות ב- 2-25 הלעפה תרוטרפמט בחושך אם לא רכישת מיד.
      6. שער גופיה חרוזים ' האוכלוסייה P1' ב FSC מול מגרש נקודה bivariate האס, הפסגה ח' או ז' ב FITC לעומת PE נקודה bivariate עלילה (הפסגה המבריקים או שאחריו כלפי מטה, כמו זה כאמור במסמך Euroflow שכותרתו "20180302_7th_ Peak_Target_Values_Rainbow_Beads") בשם שער זה אוכלוסייה P2.
      7. המשך הרכישה של המתלה חרוז הקשת 8-פסגות ולהתאים PMT המתחים בתוך כל הערוצים פלורסצנטיות להגיע ערכי MFI יעד לפי המסמך Euroflow "20180302_7th_Peak_Target_Values_Rainbow_Beads".
      8. ברגע ערכי היעד MFI הפסגה ח' או ז' נגישים, להקליט את MFI המטרה מושגת והערכים PMT הסופית המתאימה. לרכוש אירועים 5,000 ולהקליט את הנתונים.
        הערה: PMT ערכי חייב לשמש מתחת בשלב 1.2.3 (ביצועים בדוק - אישור של PMT ערכים עם קשת חרוזים).
      9. שיא ערכים אלה להכין הדפסה מסך ' היעד MFI' גליון העבודה והגדרות כלי ולשמור כתמונה. jpg.
        הערה: כאשר נוצר צינור "חדש", לפעמים PMT הערכים משתנים באופן בלתי צפוי. בשביל זה, בדיקת זוגי PMT הוא חיוני. השווה בכל פעם את הערכים PMT להערות שלך, שח כפול כי ' היעד MFI' וערכי PMT נכונים!
      10. לשמור את 'הגדרות יישום'. בדפדפן, לחץ לחיצה ימנית על ' הגדרות Cytometer''. בתפריט הנפתח, בחר ' הגדרות יישום 'ושמור. לחץ על 'אישור'. אם תתבקש, לחץ על כן כדי לשמור את ערכי סף.
        הערה: לשמור את הגדרות היישום באמצעות שם ברירת המחדל. לא תשנה את ההגדרות.
    4. להתאים את 'FCS' ואת 'האס המתחים' עם lysed שטף דם (LWB).
      הערה: בשלב זה, µL 50 של דגימת דם היקפיים (PB) בריאים המתנדבים, lysing פתרון (טבלה של חומרים), כביסה מאגר הדרושים.
      1. Pipets 50 µL של PB לתוך צינור. להוסיף 2 מ"ל של פתרון lysing טרי מדולל. לערבב בעדינות, תקופת דגירה של 10 דקות ב- RT.
      2. צנטריפוגה למשך 5 דקות ב x 540 גרם.
      3. וארוקן את תגובת שיקוע מבלי להפריע בגדר תא, עוזב כ 50 µL נפח שיורית בצינור. מערבבים בעדינות ומוסיפים 2 מ"ל של פתרון מסונן לשטוף.
      4. צנטריפוגה למשך 5 דקות ב x 540 גרם.
      5. חוזר עוד פעם אחת את 1.1.4.3–1.1.4.4 צעדים.
      6. מוסיפים 250 µL מאגר מסונן כביסה ומערבבים בעדינות.
      7. הניסוי יצר עבור רכישת חרוזים הקשת, ליצור החדש ' הדגימה | גליון חדש ': לצייר גרף האס-A / FSC-A bi-פרמטרית.
      8. לרכוש את התאים, שער של לימפוציטים FSC נגד האס נקודה bivariate עלילה ולהתאים FSC ואת האס המתחים להגיע ערכי היעד הממוצע עבור האוכלוסייה לימפוציט מגודרת: FSC: 55,000 (טווח 50,000 – 60,000) ואת האס: 13,000 (טווח 11,000 –15,000).
      9. לרכוש ולתעד את הנתונים עם-10,000 אירועים. ודא רשע FSC ואת האס ערכי היעד עבור לימפוציטים מגודרת. להסתגל מתח FSC ואת האס במידת הצורך.
      10. הדפסה המסך ולאחסן עותק של ערכי היעד של הערוץ שמושגות.
    5. קרינה פלואורסצנטית פיצוי הגדרות.
      הערה: הפקדים פיצוי שהוכתמו יחיד חייב להיות מוגדר לאחר ההגדרות MFI היעד ואת הגדרות FSC/האס הוקמו. בשלב זה, PB של מתנדבים בריאים, פיצוי חלקיקים (טבלה של חומרים), יש צורך lysing פתרון ושטיפת מאגר. הרשימה של נוגדן fluorochrome מצומדת ריאגנטים המשמש להגדרת מטריצות פיצוי פלורסצנטיות ואוכלוסיות ההתייחסות שלהם מפורטים בטבלה 1.
      1. תווית שפופרת אחת לכל מגיב כדי לשמש להגדרת פיצוי קרינה פלואורסצנטית (FITC, PE, PerCPCy5.5, APC, V450, V500, PECy7 - CD117, APC-H7 - CD10, APC-H7 - CD14 וגם APC-H7 - CD71), צינור "ריק/מוכתם".
      2. Pipet 50 µL של PB לתוך כל שפופרת או טיפה 1 של חלקיקים פיצוי "שלילית" + טיפה 1 של חלקיקים פיצוי "חיובית" את החצוצרות שלה שליטה פיצוי המצוין לעיל טבלה 1.
      3. להוסיף הכמות המתאימה של נוגדן הכימית ברכבת התחתית. להוסיף מאגר כביסה מסוננים כדי להגיע נפח סופי של µL 100 למחזור ומערבבים בעדינות. תקופת דגירה של 15 דקות ב- RT, מוגן מפני אור.
      4. מוסיפים 2 מ"ל של טרי מדולל פתרון lysing רק ב הצינורות עם תאי ומערבבים בעדינות. תקופת דגירה של 10 דקות-RT, מוגן מפני אור.
      5. צנטריפוגה למשך 5 דקות ב x 540 גרם.
      6. וארוקן את תגובת שיקוע מבלי להפריע בגדר תא משאיר כ נפח שיורית 50 µL כל שפופרת. מערבבים בעדינות. להוסיף 2 מ של מאגר מסונן כביסה.
      7. צנטריפוגה 5 דקות ב x 540 גרם.
      8. וארוקן את תגובת שיקוע מבלי להפריע בגדר תא משאיר כ נפח שיורית 50 µL כל שפופרת. להוסיף מאגר מסונן כביסה כדי להגיע נפח סופי של µL 250 למחזור ומערבבים בעדינות.
      9. ליצור פקדים פיצוי.
        1. שורת התפריטים, בחר הניסוי יצר עבור רכישת חרוזים הקשת. ליצור החדש ' הדגימה | פיצוי ההתקנה | ליצור פיצוי פקדים.
        2. בתיבת הדו-שיח שתופיע, בחר בתיבת הסימון ' בקרה וללא רבב נפרדת כלול צינור/נו ' . ליצור פקדים (לא תווית ספציפי) פיצוי כללי עבור FITC, PE, PerCPCy5.5, APC, HV450, HV500. ליצור פקדים ספציפיים תווית פיצוי עבור PE-Cy7-CD117, APC-H7 - CD10, APC-H7 - CD14 וגם APC-H7 - CD71. לחץ על 'אישור'.
        3. בגליון עבודה חדש, ליצור גרף האס-A / FSC-A bi-פרמטרית וצייר שער על לימפוציטים (P1), ההיסטוגרמה התואם fluorochrome כי יזוהו בתוך כל שפופרת וצייר שער P2 הפסגה חיובי. הצגת ההירארכיה (קליק ימני גרף, בחר ' הצג האוכלוסייה הירארכיה ') כדי להמחיש את מספר האירועים ב- P2, מלבד הצינור בקרה וללא רבב.
        4. בדפדפן, הרחב את הדגימה פיצוי פקדים.
        5. מערבולת תאי וללא רבב, מוכן לעיל, להתקנה ס' 3 – 5 התאים מוכתם מוכן על cytometer. להתאים את קצב הזרימה כדי 'בינוני ' ולחץ על ' לרכוש נתונים '. העלילה האס-A נקודה vs FSC-A, להתאים את השער P1 ולחלוש באופן מלא את אוכלוסיית לימפוציטים. לחץ לחיצה ימנית על השער P1. בחר "החל על כל פיצוי השליטה".
        6. מלוח המחוונים 'רכישה' , לחץ על 'נתונים רשומה ' לרכוש אירועים 5,000. עבור כל התאים שליטה מוכתם צבע יחיד, ודא כי השער מרווח P2 מקיף את האוכלוסייה חיובי.
        7. עבור PE-Cy7 ו APCH7 צינורות, להוסיף שער מרווח P3 ההיסטוגרמה ולהבטיח כי הוא מקיף את האוכלוסייה שלילי, כי P2 משתרע על האוכלוסייה חיובי.
        8. חישוב פיצויים. שורת התפריטים, בחר ' ניסוי | פיצוי ההתקנה | חישוב פיצוי '. שם המטריקס פיצוי: 'פיצוי על תאריך'. בחרו 'קישור ולשמור'.
        9. להציל את המטריצה פיצוי בהגדרות יישום קטלוג: לחץ על ' הגדרות Cytometer| הגדרות יישום | שמירת ', שם במטריצת פיצוי 'פיצוי תאריך' ולחץ על 'אישור'.
        10. בדפדפן, לחץ על ' הגדרות Cytometer'. במפקח, נווט אל הכרטיסיה 'פיצויים' הדפסה לחץ על פינה הימנית התחתונה.
          הערה: המידע הזה ניתן גם יהיה לאחזר מקטלוג.
        11. שליטה של המטריקס פיצוי.
          1. מערבבים את שפופרת אחת כל הצינור מוכתם יחיד (APCH7 של הבחירה).
          2. ליצור התנסות חדשה בשם 'תאריך אימות פיצוי', להוסיף הדגימה חדש, לחץ על מימין ' הגדרות Cytometer' של הניסוי הזה ולבחור ' קישור | בטל קישור | הגדרת יישום ' הציל את שלב 1.1.3.10. רוכשים אירועים 50,000 מהצינור הזה עם ההגדרות החדשות.
          3. להחיל גליון עבודה גלובלי חדש. ליצור נקודה 1 מגרש FSC-A/האס-A וצייר שער להמחיש לימפוציטים ו n x (n-1) / 2 מגרשים אחרים התמקדו השער לימפוציטים להמחיש פרמטרים-שתיים.
  2. התקנת מכשיר יומי
    1. הפעל את cytometer. להבטיח כי כל רמות הנוזלים הדיווה המתאים ופתוח 6.1.3. לבצע אתחול פלואידיקה: שורת התפריט, בחר ' Cytometer | פלואידיקה אתחול '. לחץ על 'אישור' כאשר תתבקש לעשות זאת. אפשר cytometer את לחמם במשך לפחות 30 דקות.
    2. בדיקת הביצועים - החרוזים CST: לחזור 1.1.2.1–1.1.2.5 השלבים.
    3. בדיקת ביצועים - אישור של PMT ערכים עם חרוזים הקשת.
      1. תווית צינור פוליסטירן כמו ' הקשת חרוזים ' וסמנו שהמספר רבים הוא זה שנמצא בשימוש. מערבבים ביסודיות את המבחנה הקשת חרוז. הכנת חרוזים הקשת, להוסיף טיפה 1 של הקשת חרוזים 1 מ"ל מים מזוקקים או יונים. להגן מפני אור.
        הערה: המשך רכישה או לאחסן את הצינור ב- 2-8 הלעפה תרוטרפמט עד הרכישה.
      2. ליצור התנסות חדשה: ' קשת חרוזים תאריך '.
      3. לקשר את הפיצויים: קליק ימני על ' הגדרות Cytometer', בחרו ' קישור התקנה ', בחר המטריקס שכר הולם שנוצר בשלב 1.1.5.9.9 ובחר 'החלף'.
      4. בטל קישור פיצוי: קליק ימני על ' Cytometer הגדרות ', בחר 'נתק קישור מן ההגדרה שכבר קושרו' ולחץ על 'אישור'.
      5. החלת ' הגדרות יישום ': קליק ימני על ' Cytometer הגדרות ', בחר ' הגדרות יישום ', החלת ההגדרה שנוצר בשלב 1.1.3.10 במהלך הגדרת חודשי ובחר 'לשמור את הערך פיצוי '.
      6. בטלו את הבחירה באפשרות "אפשר פיצוי".
      7. ליצור טיפוס חדש הניסוי עם תבנית גליון העבודה עבור קשת חרוזים. רוכשים את הצינור ברכישת 'נמוך' .
      8. במהלך רכישת חרוזים, להתאים את השער P1 כדי לכלול רק את האוכלוסייה חרוז גופיה. התאם את השער P2 על המגרש נקודה FITC-A / PE-A כדי לכלול רק את האוכלוסייה חרוז גופיה. שיא אירועים 10,000.
      9. בדוק כי MFI את הערכים CV שהתקבלו לאוכלוסיה P2 הם המטרות שהוגדרו מראש של הפרוטוקול. אחרת, לשטוף את cytometer ולהתחיל את הפעולה שוב. לשמור את הדוח בפורמט PDF.

2. הכנת הדוגמא מוניטור

הערה: בצע את התא שטיפה פרוטוקול פשוט לפני ההליך מכתימים.

  1. פיפטה µL 600 מדגם ראשוני לתוך שפופרת צנטרפוגה 15 מ"ל.
  2. להוסיף 10 מ ל לרחוץ את מאגר (PBS + 0.5% BSA [> BSA טהור 98%] + 0.09% נאן3 מסונן פתרון, pH 7.4). מערבבים התליה תא היטב באמצעות פיפטה.
  3. צנטריפוגה למשך 5 דקות ב 540 x g (שטיפת 1). למחוק את תגובת שיקוע מבלי להפריע בגדר התא.
  4. חזור על שלבים 2.2 – 2.3 (לשטוף 2).
  5. להשעות בגדר תא ב- 400 µL לרחוץ את המאגר.
  6. צביעת סמני את עמוד השדרה. להעביר את כל נפח הנוגדנים עמוד השדרה צינור פוליפרופילן לניתוח FACS, המזוהה עם הנתונים החולה, את "עמוד השדרה". להוסיף 350 µL מדגם שטף (היקף המדגם שטף נדרש למלא כל הקברים על הלוח). מערבבים היטב בעזרת פיפטה.
    הערה: לחשב את הנפח הכולל של עמוד השדרה נוגדנים על פני הממברנה מכתים (כפי שמוצג בטבלה מס ' 2).
  7. פיפטה כמויות שוות של המיקס מדגם-השדרה לתוך צינורות פוליפרופילן 3 עבור ניתוח FACS, המזוהה עם נתוני המטופל ואת "טורפדו מס ' 1" כדי "צינור מספר 3". אם יש צורך, להשתמש מאגר כביסה כדי להגיע נפח סופי של µL 200 למחזור.
    זהירות: היזהרו לא משאיר עקבות של המדגם על דפנות הצינורות; אחרת, התאים האלה לא להיות מוכתם. במידת הצורך, מערבולת התאים ואת צנטריפוגה הצינור.
  8. כל שפופרת, להוסיף נפח מתאים של נוגדנים בכתבות סמני פני שטח התא (למעט הסימנים עמוד השדרה), כמפורט בטבלה 2. מערבבים היטב בעזרת פיפטה. תקופת דגירה של 30 דקות ב- RT מוגן מפני אור.
  9. להוסיף 2 מ של lysing פתרון. מערבבים היטב בעזרת פיפטה. תקופת דגירה של 10 דקות ב RT מוגן מפני אור.
  10. צנטריפוגה למשך 5 דקות ב x 540 גרם. למחוק את תגובת שיקוע מבלי להפריע בגדר תא, משאיר כ נפח שיורית 50 µL כל שפופרת. מערבבים היטב בעזרת פיפטה.
  11. להוסיף 2 מ"ל לרחוץ את המאגר כדי בגדר התא. מערבבים היטב בעזרת פיפטה.
  12. חזור על שלבים 2.10 – 2.11 (לשטוף 2).
  13. צנטריפוגה למשך 5 דקות ב x 540 גרם. למחוק את תגובת שיקוע מבלי להפריע בגדר תא, מחדש להשעות בגדר תא ב- µL 200 ל- PBS. מערבבים היטב בעזרת פיפטה.
  14. לרכוש את התאים, רצוי, מיד לאחר צביעת או לאחסן ב 4 ° C, מוגן מפני אור, עבור לא יותר מ 1 h עד נמדד cytometer הזרימה.

3. חדרי קירור והקפאה

  1. לפתוח התנסות חדשה ב- Diva תוכנה ולשנות לפי שם, סוג הדגימה ותאריך.
  2. ליצור טיפוס חדש המכיל 3 צינורות. לציין הפריסה ניסוי הנוגדנים בשימוש כל שפופרת.
  3. לחץ על מימין ' Cytometer הגדרות ', בחר ' הגדרות יישום ' ולהחיל הערכים שהתקבלו בהגדרת חודשי (שלב 1.1.3.10).
  4. פתח גליון עבודה גלובלי חדש וליצור החלקות נקודה: האס-A / FSC-A, האס-A / CD45-HV500-A, האס-A / FITC-A, האס-A / PE-A, האס-A / CD34-PerCP-Cy5.5, האס-A / CD117-PECy7-A, האס-A / APC-A, האס-A / APCH7-A, האס-A / הלע-ד ר-HV450-א העלילה נקודה האס-FSC-הנ"מ, ליצור שער כדי לבחור את התאים גופיה. העלילה נקודה האס-A/CD45-BV500-A, ליצור שערים כדי לבחור אוכלוסיות 4: גרנולוציטים ומונוציטים, תקיעות, לימפוציטים. פרוייקט אוכלוסיות אלה בהחלקות נקודה שיצרת קודם לכן.
  5. ליצור גליון עבודה גלובלי חדש לבקרת פיצויים כפי שמתואר בשלב 1.1.5.9.11.3.
  6. רוכשים את הצינור רכישה 'בינוני' , שיא 500,000 אירועים/צינור. לאחר אימות טכני (הערכה של פיצוי, ההכתמה נכונה), לייצא את הנתונים כקבצים FCS3.0.

4. ניתוח נתונים

הערה: כדי לבנות את מסדי הנתונים הרגיל של מוניטור היו קבצים בהם נעשה שימוש מתורמים מאוד בריאים, מאנשים ללא ראיות למחלת hematopoietic כדלקמן 11 מ 18 קבצים עבור Neutrophils_NM מסד נתונים, 10 מ 18 קבצים עבור מסד Monocytes_NM ו 14 מ-18 קבצים עבור מסד הנתונים NRC_NM. הקבצים שנמחקו הראתה בעיות טכניות שונות, כפי שהוצג בסעיף נציג תוצאות. הקבצים באופן אינדיבידואלי נותחו באמצעות התוכנה Infinicyt (טבלה של חומרים), העומדות אסטרטגיות שונות מצטיירת דמות 1A(1-3) על שושלת היוחסין נויטרופילים (פרופיל Neutrophils_Maturation.inp), איור 2 A מונוציט השושלת (פרופיל Monocytes_Maturation.inp), איור 3A(1-2) על שושלת היוחסין של תאי erythroid (פרופיל NRC_Maturation.inp).

  1. האסטרטגיה של ניתוח של נויטרופילים -בניית מסד נתונים Neutrophils_NM 
    1. לזהות CD34 + ביצע נויטרופילים תקיעות באמצעות חיתוך של שבעה שערים, המאפשר בחירת CD34 + CD117 + HLADR + נמוך CD10 - CD13 + CD11b-אירועים (איור 1A.1). להקצות אירועים אלה אל הכרטיסיה 'נויטרופילים' בעץ ההירארכיה האוכלוסייה ובטל לאחר מכן בכרטיסיה זו כדי להסיר תאים אלה (מתואר בכחול) מתוך התצוגה של האירועים הנותרים (אפור).
    2. לבודד את CD117 + CD34 - CD13 + CD11b-HLADR + מבשרי נויטרופילים נמוכה באמצעות חיתוך של שישה שערים, כפי שהיא מתוארת באיור 1A(2) ולהקצות אותם אל הכרטיסיה 'נויטרופילים' .
    3. לזהות נויטרופילים בוגרים יותר באמצעות חיתוך של ארבעה שערים, המאפשר את האפליה של CD45dim SSCint היי CD117-HLADR-תאים וההקצאות שלהם אל הכרטיסיה 'נויטרופילים' .
    4. בטל את הסימון של האירועים הנותרים, שומר רק נויטרופילים גלויים, ואז לייצא אוכלוסייה זו על ידי לחיצה על ' קובץ | ייצוא ' ווידוא כי כל הפרמטרים הדרושים נבדקים ולשמור את הנתונים כקבצים FCS.
    5. בקובץ הממוזג בהיקף של כל הקבצים מיוצא FCS, לבצע בדיקת איכות על ידי הערכת עוצמת הביטוי של סמנים עבור כל subpopulation. באמצעות APS חלקות עם medians עבור כל קובץ ועיקולים SD עבור כל subpopulation שמוצג, להסיר את המקרים מחוץ העקומות 2SD (ראה פירוט בסעיף התוצאות נציג) (איור 1B).
    6. בקובץ מורכב שנוצר עם "נויטרופילים" גלוי, לצייר מסלול התבגרות על דיאגרמה APS (איור 1C משמאל) ולשמור כקובץ .cyt.
      הערה: השוואה ההבשלה תרשים מאפשר את החזיית כל הפרמטרים מכל הקבצים הנכללים במסד הנתונים Neutrophils_NM ייצג מול מסד הנתונים מנורמל. התרשים המוצג באיור 2C, בצד ימין, מציג את כל הקבצים הנכללים במסד הנתונים Neutrophils_NM (n = 11) משתלב 2 SD לעומת החציון של הקבוצה.
  2. מהאסטרטגיה ןועברל monocytes - הבניה מסד Monocytes_NM
    1. לזהות את התאים השושלת monocytic (CD117 + /-CD64 + שלום HLADR + שלום) באמצעות חיתוך של ארבעה שערים (איור 2א). להקצות אירועים אלה אל הכרטיסיה 'Monocytic' בעץ ההירארכיה האוכלוסייה.
    2. בטל את הסימון של האירועים הנותרים, להשאיר רק את התאים monocytic גלויים, ואז לייצא אוכלוסייה זו על ידי לחיצה על ' קובץ | ייצוא ' ווידוא כי כל הפרמטרים הדרושים נבדקים ולשמור את הנתונים כקבצים FCS.
    3. בקובץ הממוזג בהיקף של כל הקבצים מיוצא FCS, לבצע בדיקת איכות על-ידי הערכת עוצמת הביטוי של סמנים עבור כל subpopulation ולאחר מכן תסיר את המקרים מחוץ העקומות 2SD (פירוט בפרק התוצאות נציג) (איור 2 B).
    4. בקובץ שנוצר עם "Monocytic" תאים גלויים, לצייר מסלול התבגרות על הדיאגרמה APS (איור 2C משמאל) ושמור זה כקובץ .cyt.
      הערה: השוואה ההבשלה תרשים מאפשר את החזיית כל הפרמטרים מכל הקבצים הנכללים במסד הנתונים Monocytes_NM ייצג מול מסד הנתונים מנורמל. התרשים המוצג באיור 2C, בצד ימין, מציג את כל הקבצים הנכללים במסד הנתונים Monocytes_NM (n = 10) משתלב 2 SD לעומת החציון של הקבוצה.
  3. האסטרטגיה של ניתוח של כדוריות אדומות nucleated (NRCs) - בניית מסד נתונים NRC_NM
    1. לזהות CD34 + תקיעות erythroid שבוצעו באמצעות חיתוך של שבעה שערים לאפשר את מבחר CD34 + CD117 + HLADR + נמוך CD105 + CD33 - CD36 + CD71 + אירועים (איור 3A(1)). להקצות אירועים אלה ללשונית "NRC" בעץ ההירארכיה האוכלוסייה ובטל ואז בכרטיסיה זו כדי להסיר תאים אלה (מתואר באדום) מתוך התצוגה של האירועים הנותרים (אפור).
    2. לזהות NRCs בוגרים יותר באמצעות חיתוך של ארבעה שערים לאפשר את האפליה של CD45-/ + עמום SSClow CD36 + שלום CD71 + שלום CD105 + /-תאים. להקצות אירועים אלה ללשונית "NRC" (איור 3A(2)). טסיות הדם (CD36 + שלום תאים SSClow) יש להסיר מן האוכלוסייה NRC (איור 3A(2)).
    3. בטל את הסימון של האירועים הנותרים, להשאיר רק את התאים NRC גלויים, ואז לייצא אוכלוסייה זו על ידי לחיצה על ' קובץ | ייצוא ' ווידוא כי כל הפרמטרים הדרושים נבדקים ולשמור את הנתונים כקבצים FCS.
    4. בקובץ הממוזג בהיקף של כל הקבצים מיוצא FCS, מבצעת בדיקת איכות על-ידי הערכת עוצמת הביטוי של סמנים עבור כל subpopulation, ואחריו הסרת של המקרים בחוץ 2SD עקומות (ראה פירוט בסעיף התוצאות נציג) ( איור 3 B).
    5. בקובץ שנוצר עם "NRC" תאים גלויים, לצייר מסלול התבגרות על הדיאגרמה APS (איור 3C, משמאל) ושמור זה כקובץ .cyt.
      הערה: השוואה ההבשלה תרשים מאפשר את החזיית כל הפרמטרים מכל הקבצים הנכללים במסד הנתונים NRC_NM ייצג מול מסד הנתונים מנורמל. התרשים המוצג באיור 3C, בצד ימין, מציג את כל הקבצים הנכללים במסד הנתונים NRC_NM (n = 14) משתלב 2 SD לעומת החציון של הקבוצה.
  4. הערכה של התבגרות בתאים מיאלואידית מוניטור בשימוש במאגרי המידע ההבשלה
    1. פתח את הקובץ .cyt המייצגים שושלת היוחסין של עניין (כלומר., Neutrophils_NM_GMFF.cyt על שושלת היוחסין נויטרופילים, Monocytes_NM_GMFF.cyt של השושלת monocytic, ו NRCs_NM_GMFF.cyt עבור erythroid היוחסין).
    2. לחץ לחיצה ימנית על לשונית "התבגרות" מתחת לכרטיסיה התואם שושלת היוחסין של הריבית (' נויטרופילים | Monocytic | NRC') ולשמור את מסד הנתונים של התבגרות כדי התבגרות.
    3. לפתוח קובץ חדש FCS ולבצע ניתוח כפי שהוסבר קודם לכן (שלב 4.1.1–4.1.3 עבור נויטרופילים, שלב 4.2.1 עבור תאים Monocytic, וצעד 4.3.1–4.3.2 עבור NRC).
    4. לצייר מסלול התבגרות עבור האוכלוסייה עניין.
    5. פתח את מסד הנתונים המתאימים בכרטיסיה 'כלים' (ניתוח מסד נתונים) והשווה האוכלוסייה כדי להיות מנותח עם מסד הנתונים המתאימים של התבגרות. בדוק את הנתונים עבור תאימות עם מסד הנתונים הזמינים: להשלים את תאימות (משולש ירוק); תאימות חלקית, בברוב המקרים אי-התאמות בשם הפרמטרים (משולש צהוב); של אי-תאימות (משולש אדום).
    6. אם הנתונים הם compatibles או compatibles חלקית, התוכנה יוצר דיאגרמה ' מנורמל ההבדלים ההבשלה ' . כדי להמחיש ' פרמטר הלהקה ההבשלה ההבדלים ', פתיחת דיאגרמה חדשה בכרטיסיה 'דיאגרמה' , לחץ על 'ההבשלה' ולבחור כמה פרמטרים כדי להיות מוצגים, לחץ על 'אישור' , הדיאגרמה מופיעים. עם לחץ לחיצה ימנית בדיאגרמה; ניתן לבצע שינויים ויזואליזציה של נתונים, ויזואליזציה של מסד נתונים, ויזואליזציה דיאגרמה ההבשלה.
    7. כדי להמחיש את משמעות ההבדלים בין הקובץ החדש ואת הנתונים הנכללים במסד הנתונים, הגדר זום (לחץ לחיצה ימנית על ' מנורמל ההבדלים ההבשלה ' ולהחיל 'זום').

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הדגימות מוניטור 54 האיסוף-K-EDTA קרישה נכללו במחקר. MFC הנתונים נותחו, בהעדר כל מידע על המטופלים. מחקר רטרוספקטיבי הראה כי הדגימות מוניטור היו מתורמים בריאים 7 (5 זכרים ו 2 נקבות עם עידן החציוני של 47.4 [35-48], 11 אנשים עם הוכחות של מחלה hematopoietic (8 זכרים ונקבות 3 עם עידן החציוני של 57.9 [35-72]) ובמקרים 36 עם שונים מצבים פתולוגיים: מקרה 1 עם אנמיה ורמת קריאטינין נמוך, 3 מקרים עם אנמיה ורמת קריאטינין גבוה, 8 מקרים עם אנמיה של דלקת, במקרה 1 עם אנמיה הנגרמת על ידי ויטמין B12

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

האיכות של מוניטור וביופסיה יכול להשפיע על התוצאות הסופיות. Hemodilution של וביופסיה מוניטור יכול לעוות את חלוקת תאים בשלבים שונים של ההבשלה בשל היעדרם של אבות או תאים סימנים מקדימים. כנראה העסקת בכמויות גדולות lysing שיטת עשוי לעזור בנורמליזציה של מוניטור aspirates עבור hemodilution זרם cytometric בניתוח. בנוסף, לשלבים הקריטיים עבור הערכת דיספלזיה מיאלואידית מוניטור מאת cytometry זרימה הם דגימת ועיבוד מכתים, חדרי קירור והקפאה, פרשנות2,3. המדגם ועיבוד מכתים צריכה ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים. מחלקת Cytometry זרימה, המעבדה להמטולוגיה בבית החולים באוניברסיטה של Saint-Etienne הוא חבר של קונסורציום EuroFlow.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נוגדנים השתמשו במחקר זה נמסרו בידי החיים BD. המחברים רוצה להודות שלהם עמית, ד ר פסקל Flandrin-Gresta, מ המחלקה לביולוגיה מולקולרית, המעבדה להמטולוגיה, אוניברסיטת בית החולים של Saint-Etienne, צרפת, שסיפק מומחיות לפרשנויות של נתונים המיתרים השנייה במקרה של MDS. המחברים מודים ההמטולוגים המטפל שלהם עניין ומעורבות במחקר זה, על המטופלים ועל בריא לתורמים את הסכמתם להשתתף במחקר זה. המחברים רוצה גם להודות הקרן "Les אמיס דה Rémi" תמיכה כספית עבור פרסום.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
BD FACSCanto II זרימה-ציטומטרBD Biosciences, CA, ארה"בSN:3 לייזרים, תצורת 4-2-2, פרטי מסננים ומראות: https://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSCanto_II_FilterGuide.pdf
Awel C48-R צנטריפוגהAWEL Industries, FRSN: 910120016; מספר דגם: 320002001צנטריפוגות במהירות נמוכה; קיבולת 60 צינורות FACS
פיפטים של 10 ומיקרו; L ו-200µ L
פיפטות
15 מ"ל צינורות
צינור פוליפרופילן עבור FACS
עכבר אנטי-אנושי HLA-DRBD Biosciences, קליפורניה, ארה"בשיבוט 655874L243
עכבר BALB/c IgG2a, κ
Fluorochrome Horizon V450
(לדוגמה מקסימום 404 ננומטר/
Em max 448 ננומטר)
עכבר אנטי-אנושי CD45BD Biosciences, CA, ארה"ב560777שיבוט HI30
עכבר IgG1, κ
Fluorochrome Horizon V500 (לדוגמה מקסימום 415 ננומטר/
Em מקסימום 500 ננומטר)
עכבר אנטי-אנושי CD16BD Biosciences, קליפורניה, ארה"ב656146שיבוט CLB/fcGran1 עכבר BALB/c IgG2a, κ
פלואורוכרום FITC
(לדוגמה מקסימום 494 ננומטר/
Em מקסימום 520 ננומטר)
עכבר אנטי-אנושי CD13BD Biosciences, קליפורניה, ארה"בשיבוט 347406L138
עכבר BALB/c X C57BL/6 IgG1, κ
פלואורוכרום PE
(לדוגמה מקסימום 496 ננומטר/
Em max 578 ננומטר)
עכבר אנטי-אנושי CD34BD Biosciences, קליפורניה, ארה"בשיבוט 3472228G12
עכבר BALB/c IgG1, κ
פלואורוכרום PerCP-Cy5.5
(לדוגמה מקסימום 482 ננומטר/
Em מקסימום 678 ננומטר)
עכבר אנטי-אנושי CD117BD Biosciences, קליפורניה, ארה"בשיבוט 339217104D2
עכבר BALB/c IgG1
פלואורוכרום PE-Cy7
(לדוגמה מקסימום 496 ננומטר/
Em max 785 ננומטר)
עכבר אנטי אנושי CD11bBD Biosciences, קליפורניה, ארה"ב333143שיבוט D12
עכבר BALB/c IgG2a, κ
D12, פלואורוכרום APC
(לדוגמה מקסימום 650 ננומטר/
Em max 660 ננומטר
עכבר אנטי-אנושי CD10BD Biosciences, קליפורניה, ארה"ב646783שיבוט HI10A
עכבר BALB/c IgG1, κ
פלואורוכרום APC-H7
(לדוגמה מקסימום 496 ננומטר/
Em מקסימום 785 ננומטר)
עכבר אנטי-אנושי CD35BD Biosciences, קליפורניה, ארה"ב555452שיבוט E11
Mouse IgG1, κ
פלואורוכרום FITC
(לדוגמה מקסימום 494 ננומטר/
Em מקסימום 520 ננומטר)
עכבר אנטי-אנושי CD64BD Biosciences, קליפורניה, ארה"ב644385שיבוט 10.1
עכבר BALB/c IgG1, κ
פלואורוכרום PE
(לדוגמה מקסימום 496 ננומטר/
Em מקסימום 578 ננומטר)
עכבר אנטי-אנושי CD300eImmunostepIREM2A-T100שיבוט UP-H2
עכבר BALB/c IgG1, k
פלואורוכרום APC
(Ex max 496 ננומטר/
Em max 578 ננומטר)
עכבר אנטי אנושי CD14BD Biosciences, קליפורניה, ארה"ב641394שיבוט MoP9
עכבר BALB/c IgG2b, κ
פלואורוכרום APC-H7
(לדוגמה מקסימום 496 ננומטר/
Em max 785 ננומטר)
עכבר אנטי-אנושי CD36BD Biosciences, קליפורניה, ארה"ב656151שיבוט CLB-IVC7
עכבר IgG1, ואפה;
פלואורוכרום FITC
(לדוגמה מקסימום 494 ננומטר/
Em מקסימום 520 ננומטר)
עכבר אנטי-אנושי CD105BD Biosciences, קליפורניה, ארה"ב560839 שיבוט 266
עכבר BALB/c IgG1, κ
פלואורוכרום PE
(לדוגמה מקסימום 496 ננומטר/
Em מקסימום 578 ננומטר)
עכבר אנטי-אנושי CD33345800שיבוט P67.6
עכבר BALB/c IgG1, κ
פלואורוכרום APC
(לדוגמה מקסימום 496 ננומטר/
Em max 578 ננומטר)
עכבר אנטי-אנושי CD71BD Biosciences, קליפורניה, ארה"בשיבוט 655408M-A712
עכבר BALB/c IgG2a, κ
פלואורוכרום APC-H7
(לדוגמה מקסימום 496 ננומטר/
Em מקסימום 785 ננומטר)
תמיסת ליזינג תרכיז פי 10 (IVD)BD Biosciences, קליפורניה, ארה"ב349202
FACSFlow Sheath Fluid BDBiosciences, קליפורניה, ארה"ב342003
FACSDiva CS& חרוזי T IVDBD Biosciences, קליפורניה, ארה"ב656046
חלקיקי כיול קשת, 8 פסגותציטוגנוס, סלמנקה, ספרדSPH-RCP-30-5Aמגרשים EAB01, EAC01, EAD05, EAE01, EAF01, EAG01, EAH01, EAI01, EAJ01, EAK01
חלקיקי פיצוי צבעוניים CompBeads (CE / IVD)BD Biosciences, CA, USAref. #51-90-9001229 + #51-90-9001291
גרסאות תוכנת Diva 6.1.2 ו- 6.1.3BD Biosciences, קליפורניה, ארה"ב
טבליות מלח חוצצות פוספטR& D Systems, מיניאפוליס, ארה"ב5564
אלבומין בסרום בקר ( BSA)סיגמא-אולדריץ', צרפתA9647
נתרן אזיד 99%סיגמא-אולדריץ', צרפת199931
תוכנת אינפיניציט גרסת 1.8.0.eCytognos, סלמנקה, ספרד
V33896301336 פסטרפלקון

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Orfao, A., Ortuño, F., de Santiago, M., Lopez, A., San Miguel, J. Immunophenotyping of Acute Leukemias and Myelodysplastic Syndromes. Cytometry Part A. 58, 62-71 (2004).
  2. Porwit, A., et al. Revisiting guidelines for integration of flow cytometry results in the WHO classification of Myelodysplastic Syndromes - proposal from the International/European LeukemiaNet Working Group for Flow Cytometry in MDS (IMDSFlow). Leukemia. 28 (9), 1793-1798 (2014).
  3. Westers, M. T., et al. Implementation of flow cytometry in the diagnostic work-up of myelodysplastic syndromes in a multicenter approach: Report from the Dutch Working Party on Flow Cytometry in MDS. Leukemia Research. 36, 422-430 (2012).
  4. Meehan, S., et al. AutoGate: automating analysis of flow cytometry data. Immunologic Research. 58, 218-223 (2014).
  5. Greenberg, P. L., et al. NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology: myelodysplastic syndromes. Journal of the National Comprehensive Cancer Network. 9, 30-56 (2011).
  6. Greenberg, P. L., et al. Myelodysplastic Syndromes, Version 2.2017, Clinical Practice Guidelines in Oncology. Journal of the National Comprehensive Cancer Network. 15, (2017).
  7. WHO Classification of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues. Revised 4th Edition. Swerdlow, S. H., et al. (2), IARC Press. Lyon, France. 86-128 (2017).
  8. https://lists.purdue.edu/pipermail/cytometry/2009-March/036889.html. , Available from: https://lists.purdue.edu/pipermail/cytometry/2009-March/036889.html (2018).
  9. Composition of EuroFlow panels and technical information on reagents Version 1.5. , (2017).
  10. EuroFlow Standard Operating Procedure (SOP) for sample preparation and staining Version 1.2.1. , (2015).
  11. Kalina, T., et al. EuroFlow standardization of flow cytometer instrument settings and immunophenotyping protocols. Leukemia. 26, 1986-2010 (2012).
  12. http;//www.miltenyibiotec.com/en/products-and-services/macs-flow-cytometry/reagents/antibodies-and-dyes/recombinant-antibodies.aspx. , Available from: http;//www.miltenyibiotec.com/en/products-and-services/macs-flow-cytometry/reagents/antibodies-and-dyes/recombinant-antibodies.aspx (2018).
  13. van Dongen, J. J. M., et al. EuroFlow antibody panels for standardized n-dimensional flow cytometric immunophenotyping of normal, reactive and malignant leukocytes. Leukemia. 26, 1908-1975 (2012).
  14. Matarraz, S. Introduction to the Diagnosis and Classification of Monocytic-Lineage Leukemias by Flow Cytometry. Cytometry Part B (Clinical Cytometry). 92 (3), 218-227 (2015).
  15. Westers, M. T. Immunophenotypic analysis of erythroid dysplasia in myelodysplastic syndromes. A report from the IMDSFlow working group). Haematologica. 102, 308-319 (2017).
  16. Shen, Q., et al. Flow cytometry immunophenotypic findings in chronic myelomonocytic leukemia and its utility in monitoring treatment response. European Journal of Haematology. 95, 168-176 (2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Flow CytometryBone MarrowMyeloid Cell MaturationMultiparameter Flow CytometryMyeloid Disease DiagnosisSample PreparationData AcquisitionMaturation DatabaseNeutrophil LineageMonocytic Lineage

מאמרים קשורים