הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מדידה כמותית של מינים חמצן תגובתי, הזדקנות ביולוגית-הקשורים פנוטיפ הפרשה ב Fibroblasts אנושי נורמלי במהלך אונקוגן-induced הזדקנות ביולוגית

7.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/57890

⸱

12 באוגוסט 2018

 ,  , 
1Department of Biochemistry, College of Medicine, Dong-A University, 2Peripheral Neuropathy Research Center, College of Medicine, Dong-A University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

ROS תאיים הוכח לשחק תפקיד חשוב אינדוקציה של הזדקנות ביולוגית הסלולר. כאן, אנו מתארים וזמינותו רגיש לכימות תנועת ROS רמות במהלך הזדקנות ביולוגית הסלולר. אנו מספקים גם פרוטוקולים להערכת את הזדקנות ביולוגית-הקשורים הפרשה פנוטיפ, אשר תורמת הדיווחים תפקוד שונות הקשורות לגיל.

תקציר

הזדקנות ביולוגית הסלולר נחשב למצב של צמיחה בלתי הפיך מעצר על מיצוי של קיבולת המקדימות או חשיפה לחצים שונים. מחקרים שנעשו לאחרונה הרחיבו את התפקיד של הזדקנות ביולוגית הסלולר לתהליכים פיזיולוגיים שונים, כולל פיתוח, ריפוי הפצע, מעקב המערכת החיסונית של תפקוד לקוי של רקמות הקשורות לגיל. למרות מחזור מעצר התא הוא סימן היכר קריטי של הזדקנות ביולוגית הסלולר, ייצור מינים (ROS) חמצן תגובתי תאיים מוגברת גם הוכח כדי לשחק תפקיד חשוב אינדוקציה של הזדקנות ביולוגית הסלולר. בנוסף, מחקרים שנעשו לאחרונה גילה כי תאים senescent שהפגינו פעילויות paracrine חזק על השכן תאים ורקמות דרך פנוטיפ הזדקנות ביולוגית-הקשורים הפרשה (SASP). העלייה החדה אינטרס לגבי אסטרטגיות טיפוליות נגד הזדקנות ביולוגית הסלולר מדגיש את הצורך הבנה מדויקת של מנגנוני הזדקנות ביולוגית, לרבות ROS תאיים על SASP. כאן, אנו מתארים את הפרוטוקולים להערכת רמות ROS תאיים באופן כמותי במהלך ה-Ras-induced הסלולר הזדקנות ביולוגית באמצעות ROS רגיש הפלורסנט cytometry זרימה. בנוסף, אנחנו מציגים רגיש טכניקות לניתוח של אינדוקציה של mRNA הביטוי והפרשת גורמי SASP. פרוטוקולים אלה ניתן ליישם מודלים שונים של הזדקנות ביולוגית הסלולר.

מבוא

יותר מ 50 שנה, Hayflick ולמורהד גילה כי תאים נורמליים להיכנס צמיחה בלתי הפיך מעצר על מיצוי של הפוטנציאל המקדימות שלהם לאחר מספר מסוים של חלוקות תאים1. תופעה זו נקראת עכשיו הזדקנות ביולוגית replicative, הוא האמין בחום לתאם עם הזדקנות organismal2. למרות הסחיפה פרוגרסיבי של טלומרים נחשב הגורם העיקרי replicative הזדקנות ביולוגית, מדגיש הסלולר השונות, כגון ה-DNA נזק, הפעלת oncogenic סטרס חמצוני, דווחו לזירוז סוג נוסף של הזדקנות ביולוגית הסלולר נקרא "הזדקנות ביולוגית מוקדמת" או "מפגינות הזדקנות ביולוגית". מעניין, הזדקנות מוקדמת ביולוגית ממלאת תפקיד הגידול מדכאים חזק בעת ההפעלה של oncogenes כגון H-ראס BRAF. מחקרים של מודלים של העכבר, ברקמות אנושיות יצרו ראיות חזקות שהיו סמנים ביולוגיים של הזדקנות ביולוגית התא בעיקר קיימים נגעים premalignant שבו oncogenic Ras ו- BRAF מופעלים אך היו פחתה ב סרטן ממאיר שהתפתחה מתוך אלה נגעים3,4,5. מעבר להיותו הזדקנות, דיכוי הגידול, הזדקנות ביולוגית הסלולר הוכח במחקרים קודמים לשחק תפקיד בתהליכים פיזיולוגיים שונים, כולל ריפוי הפצע, רקמות תיקון, מעקב המערכת החיסונית של התפתחות6.

למרות הצמיחה מעצר נחקרה בהרחבה כמו סימן היכר של הזדקנות ביולוגית הסלולר7, גוף משמעותי של הראיות עולה שכי מינים חמצן תגובתי תאיים (ROS) תורם גם הזדקנות ביולוגית הסלולר8. העלאת רמות ROS במהלך סוגים שונים של הזדקנות ביולוגית הסלולר, כולל הזדקנות ביולוגית replicative ואונקוגן-induced הזדקנות ביולוגית (OIS), דווח במקור לפני עשרות שנים9,10. יותר ישירות, טיפול אקסוגני עם מנה לא קטלני של H-2-O-2 גורם הזדקנות ביולוגית11,12. עיכוב של אנזימי ניקוי ROS, כגון SOD1, גם גורם הזדקנות מוקדמת ביולוגית13. לעומת זאת, נמוך חמצן הסביבה תנאים והגברת ROS הניקוי עיכוב תחילת הזדקנות ביולוגית10,14,15. תוצאות אלו ללא ספק מציינים כי ROS הם מתווכים חשובים או גורמים האינדוקציה הזדקנות ביולוגית הסלולר. עם זאת, איך ROS לתרום תנאי הגיוס של הזדקנות ביולוגית הסלולר, איך ROS רמות גבוהות במהלך הזדקנות ביולוגית הסלולר לדרוש בהמשך החקירה.

מחקרים שנעשו לאחרונה חשפו תאים senescent שיש פעילויות paracrine חזק על השכן תאים ורקמות עד16,SASP17. ברקמת בגילאי, תאים senescent לקדם רקמות הקשורות לגיל בתפקוד דרך שבילים רבים דרך SASP בנוסף דלדול האוטונומי של שגשוג תאים. גורמים proinflammatory שונים, כגון IL-6, IL-8, TGFβ ו- metalloproteinases מטריצה (MMPs), מופרש על ידי תאי senescent, גורמות בתפקוד רקמת הקשורות לגיל דרך ירידת ערך של רקמות הומאוסטזיס, הרס של רקמות אדריכלות, הזדקנות ביולוגית של התאים הסמוכים, דלקת סטרילית18,19. עם זאת, SASPs יכול להיות השפעות מועילות בהתאם להקשר הביולוגי. בנוסף, הטבע heterogenetic של SASPs תלויה בסוג התא senescent ואת השלב תא, מדגישים את הצורך בהמשך המחקר19.

כאן, אנו מתארים מהיר ורגיש cytometry טכניקות מבוססות להערכת רמות ROS תאיים במהלך OIS. בנוסף, הציג שיטות לניתוח של גורמים SASP באמצעות כמותיים בזמן אמת תגובת שרשרת פולימראזית (qPCR) ואליסה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. גרימת אונקוגן-induced הזדקנות ביולוגית

  1. הכנת H-RasV12 הרטרווירוס
    1. מעיל המנה תרבות 100 מ מ על-ידי הוספת 2 מ ל תמיסת 0.001% פולי-L-ליזין/פוספט במאגר (PBS) עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    2. הסר את הפתרון פולי-L-ליזין באמצעות פיפטה מזכוכית מחובר ואקום, כדי לבשל תרבות על-ידי הוספת 2 מ של 1 x PBS.
    3. צלחת 3 x 106 ecotropic BOSC-23 אריזה תאים על תרבות מצופה צלחת עם Dulbecco ששינה נשר בינוני (DMEM) המכילה 10% סרום שור עוברית (FBS) ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין, תרבות אותם ב 37 מעלות צלזיוס בתרבות רקמה2 CO חממה עבור 1 י.
    4. למחרת, transfect 2 µg של pBabe DNA פורו-H-RasV12 יחד עם אריזה retroviral דנ א (2 µg של pGAG/pol ו 0.25 µg של pVSVG) באמצעות תגובה כימית תקנים עבור 8 שעות בהתאם להוראות היצרן.
    5. מסיר את המדיה תרביות תאים ולהוסיף 8 מ של מדיה חדשה.
    6. לאחר 48 שעות, לאסוף שהמדיה המכילה את חלקיקי נגיפי ולהסיר נפולת התאית על ידי צנטריפוגה ב x 500 g למשך 5 דקות.
    7. מסנן התקשורת המכיל וירוס H-ראס עם מסנן מזרק 0.45 מיקרומטר.
      הערה: להימנע כל הקפאה והפשרה של supernatants וירוס זיהום ויראלי יעיל. כדי להשיג את היעילות ביותר, השתמש וירוס היה שנקטפו באותו יום כמו זיהום.
  2. מדביק WI-38 fibroblasts אנושי נורמלי הרטרווירוס H-RasV12
    1. צלחת 5 x 10 תאים4 WI-38 לצלחת תרבות 60 מ מ עם DMEM המכיל 10% FBS ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין 1 י לפני קציר את הרטרווירוס H-RasV12, ואת תרבות עליהם ליום 1-37 מעלות צלזיוס.
    2. להסיר את מדיום הגידול למחרת ולהוסיף 1 מ"ל של מדיה הרטרו וירוס H-RasV12. להוסיף 1 אוטם שריר נוספים של מדיום הגידול המכיל 2 µL של polybrene מניות פתרון (8 מ ג/מ ל מים מזוקקים). תקופת דגירה המדגם של 1 יום humidified 37 ° c, 5% CO2 תרביות רקמה חממה.
    3. הסר את התערובת הרטרו וירוס H-RasV12 24 שעות מאוחר יותר. ולשטוף את התאים 2 x עם 1 x PBS. להוסיף מדיום הגידול ולטפל בתאים עם 2 µg/mL של puromycin במשך יומיים humidified 37 ° c, 5% CO2 תרביות רקמה חממה.
    4. לאחר ד' 2 של puromycin בחירה, הסר את מדיום הגידול ולאחר לשטוף את התאים 2 x עם 1 x PBS. הוסף את מדיום הגידול, התרבות התאים humidified 37 ° C, 5% CO2 החממה עד הזמן שצוין הצבע (ראה איור 1A עבור תרשים סכימטי).

2. פיקוח על הזדקנות ביולוגית באמצעות הזדקנות ביולוגית-הקשורים β-galactosidase מכתים

  1. הכינו את הפתרונות הבאים מניות.
    1. להכין 20 מ"ג/מ"ל של 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside (X-גל) ב דימתיל formamide (DMF). לאחסן את הפתרון ב-20 ° C.
    2. הכנת מאגר חומצת לימון/סודיום פוספט על ידי המסת g 3.377 של נה2HPO4.7H2O (126 מ מ) ו- g 0.708 של חומצה ציטרית (36.8 מ מ) ב- 100 מ של מים מזוקקים. להתאים את ה-pH עד 6.0, במידת הצורך.
    3. להכין 0.5 M אשלגן ferrocyanide. חנות הפתרון בחושך ב 4 º C.
    4. להכין 0.5 M אשלגן ferricyanide. חנות הפתרון בחושך ב 4 º C.
      הערה: ה-pH של התמיסה מכתימים הזדקנות ביולוגית-הקשורים β-galactosidase (SA β-גל) הוא קריטי עבור תוצאות מדויקות.
  2. הפוך טריים SA β-גל מכתימים פתרון על ידי דילול הפתרון מניות המכיל 150 מ מ NaCl, 2 מ מ MgCl2, ferrocyanide אשלגן 5 מ"מ, 5 מ"מ אשלגן ferricyanide, 20% (v/v) חומצת לימון/סודיום פוספט מאגר ו 1 מ"ג/מ"ל של X-גל.
  3. מסיר את המדיה תרבות. ולשטוף את התאים 1 x 1 x תסיים. לתקן את התאים עם 3% פורמלדהיד למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    הערה: תאים נגועים לא הרטרווירוס אמור לשמש כפקד שלילי. התאים נגוע השליטה צריך להמשיך להיות passaged כדי לשמור על מעמדם proliferating.
  4. הסר את הפתרון קיבוע התאים ולשטוף אותם עם 1 x PBS. הוסף טריה 1 x SA β-גל מכתימים פתרון (1.5 מ לצלחת תרבות 60 מ מ). לאטום את המנה עם סרט פרפין כדי למנוע ייבוש, דגירה זה במשך 24 שעות ביממה ב- 37 מעלות צלזיוס. לחלופין, דגירה של המנות ביחד בחדר לחות.
    הערה: הפתרון מקבע המכיל 3% פורמלדהיד צריך להיות מסולק כפסולת מסוכנת. אינקובטור ללא CO2 רצוי, כדי למנוע שינויים pH במהלך הדגירה.
  5. לבדוק את מצב מכתימים התאים במיקרוסקופ ביום הבא; תאי β-גל-חיוביות SA מופיעים כחולים באזור perinuclear.
    הערה: תאי בקרה proliferating מראים תדירות נמוכה של תאי β-גל-חיוביות SA. אם ההכתמה קל מידי, המשך הדגירה לתקופה ארוכה מעט יותר (ראה איור 1B דוגמאות מיצגות).
  6. רוכשים תמונה צביעת SA-β-גל עם מצלמת CCD באמצעות 10 X או עדשה גדולה יותר אובייקטיבי. ללכוד מספר מספיק של תמונות כדי לחשב את אחוז ההגדלה (> תאים 200).
  7. לחשב את אחוז תאי β-גל-צבעונית SA על-ידי לכימות המספר של תאי β-גל-חיוביות SA ביחס למספר תאים.
    הערה: צביעת β-גל SA יש לחזור באופן עצמאי לפחות 3 x, ואת הערכים אומר צריך להיות מחושב בהתבסס על התוצאות של הניסויים שכפל (איור 1 C). צפיפות תאים מתאים הוא קריטי עבור הניסוי מכתימים SA-β-גל. Confluency גבוהה ניתן להפריע השינוי מורפולוגיה הקשורים הזדקנות ביולוגית, זירוז איתות חיובי-false בתאים שליטה.

3. לכימות של אינדוקציה מינים חמצן תגובתי במהלך ה-Ras-induced הזדקנות ביולוגית

  1. צלחת 2 x 105 WI-38 התאים על תרבות 60 מ מ צלחת, לעורר H-ראס-induced הזדקנות ביולוגית כפי שמתואר בשלב 1.
    הערה: פרוטוקול זה ניתן להחיל סוגים אחרים של דגמי הסלולר הזדקנות ביולוגית.
  2. להסיר את מדיום הגידול בנקודת הזמן המצוין (2, 4 או 6 ימים), לשטוף את התאים עם 1 x PBS. לנתק את התאים אם תתייחס אליהם עם 1 מ"ל של 0.05% טריפסין/EDTA פתרון, בטל את טריפסין על-ידי הוספת 1 מ"ל של מדיום הגידול המכיל 10% FBS. לקבוע את ספירת התאים.
  3. להעביר עונה 1 פרק 105 תאים לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל ולאחר איסוף התאים על ידי צנטריפוגה ב x 500 g למשך 5 דקות.
  4. להכין טרי 2', 7'-dichlorofluorescin diacetate (DCF-DA) מדיה צביעת על-ידי הוספת µL 50 10 מ מ DCF-DA 10 מ"ל של תרבות בינוני (ריכוז העבודה DCF-DA הוא 50 מיקרומטר).
    הערה: DCF-DA הוא רגיש אור. יש להימנע לאור החשיפה. ניתן להתאים את ריכוז DCF-DA והפעם מכתימים בהתאם לסוג התא.
  5. להסיר את מדיום הגידול בקפידה מהצינור חרוט 15 מ"ל ולהוסיף 1 מ"ל שזה עתה הוכנו DCF-DA מכתימים בינוני. בזהירות resuspend בגדר תא, דגירה זה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות בחושך. כוללים מדגם שאינו מוכתם כפקד מכתימים שלילי.
    הערה: צריך להיות מוכן מתרבים תאים לא מוכתם DCF-DA כפקד שלילי.
  6. לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה ב x 500 g למשך 5 דקות ולשטוף אותם 1 x 2 מ של 1 x PBS. Resuspend התאים עם 1 מ"ל של PBS 1 x ולהעביר המדגם המתאים תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון (FACS) שפופרת.
  7. למדוד את 2 ′, 7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCF-DA) זריחה אות של cytometer זרימה מצויד עם מקור לייזר מתאים. לרגש את הדגימות עם לייזר כחול (488 ננומטר) לזהות את קרינה פלואורסצנטית הנפלטים עם גלאי nm 530 ± 30 (FITC) באמצעות סרגל לוגריתמי.
    1. לנתח את התאים שאינם שהוכתמו שליטה שלילי קודם. מגרש נקודה של פיזור קדמי (FSC) לעומת הצד פיזור (האס), בחרו תאים חיים בעזרת כלי המגביל, לסלק תאים מתים ופסולת הסלולר.
      הערה: שינוי גודל התא צריך בזהירות לפקח בעלילה נקודה של FSC נגד האס. אם הגודל של התאים senescent הוא גדל באופן משמעותי, יש להשוות את עוצמת DCF-DA אוכלוסיות תאים בגודל זהה לאחר דרך השער העלילה נקודה של FSC נגד האס.
    2. בהיסטוגרמה פרמטר אחד הצגת DCF-DA (488 ננומטר) זריחה בסולם לוגריתמי של x-ציר, מספר האירועים (מספר תאים) בסולם ליניארי של y-ציר, להתאים את המתח 488 ננומטר לייזר כדי למקם את השיא של התאים שאינם שהוכתמו בקצה השמאלי.
    3. לנתח את התובע-DCF צבעונית דגימות ואירועים לפחות 10,000 רשומות עבור כל דגימה. רוכשים את הערך פלורסצנטיות אכזרי של כל דגימה באמצעות ניתוח תוכנה ספציפית cytometer זרימה.
      הערה: המידות ROS יש לחזור באופן עצמאי לפחות 3 x, ואת הערכים רשע יש לחשב מתוצאות אלה. הזדקנות ביולוגית נציג ה-Ras-induced התוצאות מוצגות באיור2.

4. Quantifying IL-6 ו- IL-8 mRNA ביטוי עבור הזדקנות ביולוגית-הקשורים הפרשה פנוטיפ ניתוח באמצעות תגובת שרשרת של פולימראז בזמן אמת

  1. הכנה RNA סה
    1. צלחת 3 x 10 תאים5 WI-38 על תרבות 100 מ מ פופלרי במטבחים DMEM המכיל 10% FBS ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין, תרבות אותם ב- 37 מעלות צלזיוס חממה תרביות רקמה עבור יום אחד. היכונו תרבויות כפולים לכל נקודת זמן.
    2. לגרום הזדקנות ביולוגית על-ידי מדביק את התאים הרטרווירוס H-RasV12 כפי שמתואר בשלב 1.
    3. ב- 1 יום לפני הקציר, לשטוף את התאים 2 x עם 1 x PBS, ולהוסיף 3 מ"ל של DMEM בלי FBS.
      הערה: שלב זה מבוצע כדי לייצר המדיום ממוזגים המשמש אליסה כפי שמתואר בשלב 5. סרום רעב עלול לגרום ביטוי של IL-6 ו- IL-8 mRNAs בתאים מסוימים רגישים. לפיכך, IL-6 וביטוי IL-8 mRNA בתאים תרבותי עם ובלי סרום רעב צריך להשוות בתחילה. אם סרום רעב גורם לשינויים משמעותיים בביטוי של IL-6 או IL-8 mRNA, את הרנ א הכולל עבור qPCR של המדיום ממוזגים עבור אליסה כדאי להיערך בנפרד.
    4. לאסוף את המדיום ממוזגים כל מדגם 24 שעות מאוחר יותר ולאחסן המדיום ב-80 מעלות צלזיוס על אליסה.
    5. לנתק את התאים אם תתייחס אליהם עם 1 מ"ל של 0.05% טריפסין/EDTA פתרון, בטל את טריפסין על-ידי הוספת 1 מ"ל של מדיום הגידול המכיל 10% FBS. לקבוע את ספירת תאים עבור נירמול של התוצאות אליסה כפי שמתואר בשלב 5. לקצור את התאים צינור microcentrifuge 1.5 mL על ידי צנטריפוגה ב x 500 g למשך 5 דקות.
    6. להסיר את המדיום בשאיבה עדינה ולהוסיף 1 מ"ל של RNA החילוץ פתרון. לאחר מכן, מערבולת הצינור microcentrifuge נמרצות במשך 15 s. לאחר מכן, הוסף 200 µL של כלורופורם, נמרצות מערבולת התערובת שוב על מטוס 15 נוספים s.
    7. Centrifuge צינורות מדגם ב x 17,000 g 10 דקות ב 4 º C. . אז, בזהירות להעביר השלב העליון צינור 1.5 מ ל microcentrifuge.
      הערה: את לאטמוספרה והתחתון אורגני ואסור להפריע במהלך ההעברה של השלב העליון כדי צינור חדש.
    8. הוסף µL 400 של אלכוהול איזופרופיל כדי לזרז את הרנ א ומערבבים אותם היטב על ידי היפוך עדין. לאחר מכן, דגירה הצינור בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות.
    9. Centrifuge את הצינור ב x 17,000 g 10 דקות ב 4 º C. לאחר מכן, למחוק את תגובת שיקוע, דואגת לשמר בגדר RNA. רוחצים את הרנ א על-ידי הוספת 1 מ"ל של 75% כוהל את היפוך הצינור x 2-3. Centrifuge את הצינור עבור 5 דקות ב x 17,000 g ב 4 ° C וזורקים את תגובת שיקוע.
    10. יבש בגדר RNA בטמפרטורת החדר, לפזר את הרנ א ב 50 µL של diethyl pyrocarbonate (DEPC)-יחס מים מזוקקים. שימוש µL 1 של פתרון ה-RNA, לכמת את ריכוז ה-RNA מוחלט עם ספקטרופוטומטרים.
      הערה: Overdrying תפחית את המסיסות RNA; לכן, יש להימנע overdrying את הרנ א.
  2. הכנה cDNA
    1. להכין לתערובת תגובה הפוכה-תמלול עבור כל דגימה על-ידי הוספת הבאות לתוך צינור PCR עם קירות דקים: 2 µg של RNA הכולל (לכוונן את עוצמת הקול כדי µL 10 במים נטולי RNase), 2 µL של 10 x RT מאגר, µL 1 של פריימר אקראי (50 pmol), 0.8 µL של x dNTP 25 מיקס (100 ממ), µL 1 של MMLV רוורס טרנסקריפטאז (U 50/µL), µL 5.2 של RNase ללא מים.
    2. להגדיר את התוכנית התגובה שעתוק במהופך על הצנטרפוגה תרמי עם התנאים הבאים: 42 ° C עבור 60 דקות ו- 95 מעלות צלזיוס במשך 5 דק במקום ה-PCR צינורות הצנטרפוגה תרמי, להתחיל התוכנית.
  3. תגובת שרשרת פולימראזית בזמן אמת
    1. להכין את תערובת הבסיס PCR בזמן אמת כל התגובות. התערובת תגובה עבור כל דגימה הוא כדלקמן: 25 µL של 2 x מיקס מאסטר PCR בזמן אמת, 1 µL כל של תחל ואחורה IL-6 או IL-8 ו- µL 21 של אולטרה טהור מים מזוקקים (DNase, RNase-חינם). ראה טבלה 1.
      הערה: להכין לתערובת בזמן אמת של תגובת ה-PCR כל מדגם המכיל תחל RNA אקטין כפקד פנימי. GAPDH יכול גם לשמש כפקד פנימי של נורמליזציה.
    2. להוסיף מכל קידוח לתוך צלחת qPCR 96-ובכן אופטי 48 µL של מיקס מאסטר ו- 2 µL של מוצר 3-fold cDNA מדולל עם מים. לבצע את התגובה לכל דולר. להכין את פקד טוב שאינו מכיל את התבנית cDNA כפקד PCR.
    3. להגדיר את התוכנית בזמן אמת של תגובת ה-PCR על הצנטרפוגה תרמי עם התנאים הבאים: 10 דקות 95 ° C, מחזורי 40 s of15 ב 95 ° C (דנטורציה), ו- 1 דקות ב 60 מעלות צלזיוס (חישול ואת הסיומת).
    4. לבצע PCR בזמן אמת ולתעד את ערך הסף מחזור (סיטי) לאחר השלמת מחזורי PCR. לחשב את רמות ה-mRNA של IL-6 או באמצעות שיטה- ΔΔCΤ 220IL-8.
      הערה: השינוי היחסי קיפול בביטוי נקבע לאחר נירמול על הרמות אקטין באמצעות הנוסחה הבאה:
      מקפלים שינוי = 2-Δ (ΔCT)
      כאן,
      ΔCT = C.T, IL-6 או IL-8- C.T, אקטין; ו
      Δ (ΔCT) = ΔCT, מגורה- ΔCT, שליטה.
    5. לחשב את הערך הממוצע עבור כל דגימה כפולים.
      הערה: qPCR יש לחזור באופן עצמאי לפחות 3 x, ואת הערכים אומר צריך להיות מחושב בהתבסס על תוצאות אלו. הזדקנות ביולוגית נציג ה-Ras-induced התוצאות מוצגות באיור3. סרום רעב עלול לגרום הביטוי של mRNAs IL-6 ו- IL-8 תאים כמה רגיש. לפיכך, IL-6 וביטוי IL-8 mRNA בתאים תרבותי עם ובלי סרום רעב צריך להשוות בתחילה. אם סרום רעב גורם לשינויים משמעותיים בביטוי של IL-6 או IL-8 mRNA, את הרנ א הכולל עבור qPCR של המדיום ממוזגים עבור אליסה כדאי להיערך בנפרד.

5. לכימות את הרמות של חלבונים על ידי IL-6 ו- IL-8 עבור ניתוח הזדקנות ביולוגית-הקשורים פנוטיפ הפרשה באמצעות אליסה

  1. הפשרה mL 3 בינוני ממוזגים נקצרו מתאי WI-38 senescent כפי שמתואר בשלב 4. להסיר שאריות תאים על ידי צנטריפוגה ב x 500 g למשך 5 דקות.
  2. להתרכז המדיום ממוזגים 10-fold על ידי צנטריפוגה ב x 3000 g למשך 20 דקות באמצעות יחידת צנטריפוגלי מסנן.
    הערה: הריכוז של המדיום ממוזגים עשויים בהכרח תלויה בסוג מדגם.
  3. לבצע את אליסה באמצעות 50 µL של כל מדגם מרוכז של מדיום ממוזגים עם ערכות IL-6 ואליסה IL-8 המתאים.
    הערה: לבחון כל מדגם שתי בארות אליסה. כי כל נקודת זמן משוכפלת בשלב 4, ניתוח זה מאפשר לנו לעקוב אחר וריאציות וזמינותו אליסה והן את הטכניקה הכנת המדגם.
    1. לציפוי בצלחת אליסה, לדלל את IL-6 או נוגדן IL-8 עם PBS 1 x כדי ריכוז של 0.5 µg/mL עבור IL-6 או 0.125 µg/mL עבור IL-8. להוסיף 100 µL של הנוגדנים מדולל מכל קידוח של צלחת אליסה. חותם לצלחת עם צלחת אליסה איטום הסרט, דגירה מבלי לרעוד ללילה בטמפרטורת החדר.
    2. הסר את הפתרון נוגדנים על ידי השאיפה. לשטוף כל 4x טוב עם µL 300 1 x שטיפת מאגר (0.05% Tween-20 ב- PBS). להוסיף 300 µL מאגר חסימה (BSA 1% ב- PBS) כל טוב. דגירה בטמפרטורת החדר מאובטח.
    3. הסר את הפתרון חסימה על ידי השאיפה. לשטוף כל 4x טוב עם µL 300 1 x מאגר לשטוף. להכין אליסה באופן סדרתי מדולל בתקנים במאגר דילול (0.05% Tween-20 ו- 0.1% BSA ב- PBS) ליצירת עיקול רגיל.
      הערה: דילול טורי של IL-6 הוא 31.25 62.5, 125, 250, 500, 1000, 2,000 pg/mL. דילול טורי עבור IL-8 הוא 2.34, 4.69, 9.38, 18.75, 37.5, 75 ו 150 pg/mL.
    4. להוסיף 100 µL של הפתרון רגיל או µL 100 של הפתרון מדגם (50 µL בינוני מרוכז עם 50 µL מאגר דילול) כל טוב. דגירה הבארות בטמפרטורת החדר במשך שעתיים.
    5. הסר את הפתרון רגילה או דוגמה על ידי השאיפה. לשטוף כל 4x טוב עם µL 300 1 x מאגר לשטוף. לדלל הנוגדן זיהוי עם המאגר דילול כדי ריכוז של 0.1 µg/mL עבור IL-6 או 0.25 µg/mL עבור IL-8. להוסיף 100 µL של הנוגדן מדולל לכל טוב. דגירה הבארות בטמפרטורת החדר במשך שעתיים.
    6. הסר את הפתרון נוגדנים על ידי השאיפה. לשטוף כל 4x טוב עם µL 300 1 x מאגר לשטוף. לדלל streptavidin-חזרת peroxidase (HRP) במאגר דילול כדי ריכוז של 0.05 µg/mL. להוסיף 100 µL של streptavidin-HRP פתרון לכל טוב. דגירה הבארות בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
    7. הסר את הפתרון נוגדנים על ידי השאיפה. לשטוף כל 4x טוב עם µL 300 1 x מאגר לשטוף. להוסיף 100 µL של 3, 3′, 5, יונקות-tetramethylbenzidine (שוייץ) המצע לפתרון כל טוב. דגירה הבארות בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות לאפשר פיתוח צבע. לעצור את התגובה על ידי הוספת 100 µL של פתרון עצירה של HCl 1 מ'.
    8. לקרוא את ספיגת של כל טוב בקורא אליסה-450 ננומטר.
    9. התווה את עקומת סטנדרטי עבור הסטנדרטים שנוצר. לחשב את הריכוזים של IL-6 ו- IL-8 במדיום מיזוג על פי העקומות סטנדרטי. להתוות את התוצאות לאחר נורמליזציה לספירת תאים. לחשב את הערכים רעה עבור דגימות כפולים.
      הערה: ELISAs יש לחזור באופן עצמאי לפחות 3 x, ואת הערכים אומר צריך להיות מחושב בהתבסס על תוצאות אלו (איור 4).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

דוגמה של הזדקנות ביולוגית H-ראס-induced מוצג באיור1. זיהום של אינטרנט-38 fibroblasts אנושי נורמלי הרטרווירוס H-RasV12 המושרה שינויים מורפולוגיים דרמטי (איור 1B). בנוסף, כפי שמוצג באיור 1C, SA β-גל פעילות צביעת להפליא הוגדל על הביטוי H-RasV12. יותר מ 70% של התאים הראה SA β-גל מכתים פעילות 6 d לאחר ההדבקה הרטרו וירוס H-RasV12, המציין כי ביטוי של H-RasV12 בהצלחה גורם הזדקנות ביולוגית התאית בתאים WI-38, ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

. הנה, הוצגו שיטות לניטור רמות ROS תאיים במהלך ה-Ras-induced הזדקנות ביולוגית באינטרנט-38 fibroblasts אנושי נורמלי. רמות ROS תאיים תאים חיים ניתן למדוד באופן כמותי באמצעות הכימית תא חדיר DCF-DA ו flow cytometry. על ספיגת הסלולר, DCF-DA deacetylated על ידי esterases תאיים, לאחר מכן, תחמוצת על-ידי ROS להקים מאוד פלורסנט 2', 7'-dichlorofluorescein (DCF). קרינה פלואורסצנטית DCF ניתן להבחין cytometry זרימה באמצעות של גלאי FL1 (זריחה ירוק). שימוש בשיטת DCF-DA מוכתמים, בהצלחה שהבחנו עלייה ברמות ROS במהלך ה-Ras-induced הזדקנות ב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי מענק נבחרת מחקר קרן של קוריאה (2015R1D1A1A01060839) (קים יון יאנג) על ידי מענק הלאומי מחקר קרן של קוריאה (NRF) ממומן על ידי ממשלת קוריאה (MSIT) (לא 2016R1A2B2008887, לא 2016R1A5A2007009) (ליאן Jeanho).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>ריאגנטים
פולי-L-ליזיןסיגמא-אולדריץ'P2636
BOSC 23ATCCCRL-11269
FBSGIBCO16000-044
פניצילין/סטרפטומיציןwellgeneLS202-02
PBSHycloneSH30013.02
DMEMGIBCO12800-082
OPTI-MEM GIBCO31985-070
pBabe puro-H-RasV12 Addgene1768
pGAG/polAddgene14887
pVSVGAddgene1733
TurbofectThermo Fisher ScientificR0531
polybreneSigma-AldrichH92688 מ"ג/מ"ל
puromycinSigma-AldrichP88332 מ"ג/מ"ל 
פורמלדהידסיגמא-אולדריץ'F8775
5-ברומו-4-כלורו-3-אינדוליל ובטא; D-גלקטופירנוזיד (X-gal)סיגמא-אולדריץ'B4252
אשלגן פרוציאנידסיגמא-אולדריץ'B4252
אשלגן פריציאנידסיגמא-אולדריץ'P9387
טריפסין-EDTAwellgeneLS015-01
DCF-DAסיגמא-אולדריץ' D688310 מ"מ 
TrizolThermo Fisher Scientific15596026
MMLV Reverse transcriptasePromegaM1701
SYBR Green PCR master 2x mixTakaraPR820A
פריימר אקראיPromegaC118A
Tween-20Sigma-AldrichP9416
מים מזוקקים טהורים במיוחדInvitrogen10977015
בדיקת IL-6 אנושית ELISAPeproTech#900-TM16
בדיקת IL-8 אנושית ELISAPeproTech#900_TM18
EQUIPMENTS
0.45 μ מסנן מזרק msartorius16555
ParafilmBEMIS PM-996
מיקרוסקופNIKONTS100
ציטומטר זרימהBD BioscienceLSR Fortessa
Amicon Ultra-4mlMerk MilliporeUFC800324
ספקטרופוטומטרNanoDrop BioDrop80-3006-61
מערכת PCR בזמן אמתApplied BiosystemsABI Prism 7500
ELISA קוראמכשירים מולקולרייםEMax קורא
מיקרו-לוחות

מקורות

  1. Hayflick, L., Moorhead, P. S. The serial cultivation of human diploid cell strains. Experimental Cell Research. 25, 585-621 (1961).
  2. Campisi, J. Aging, cellular senescence, and cancer. Annual Review of Physiology. 75, 685-705 (2013).
  3. Braig, M., et al. Oncogene-induced senescence as an initial barrier in lymphoma development. Nature. 436 (7051), 660-665 (2005).
  4. Michaloglou, C., et al. BRAFE600-associated senescence-like cell cycle arrest of human naevi. Nature. 436 (7051), 720-724 (2005).
  5. Collado, M., et al. Tumour biology: senescence in premalignant tumours. Nature. 436 (7051), 642(2005).
  6. Malaquin, N., Martinez, A., Rodier, F. Keeping the senescence secretome under control: Molecular reins on the senescence-associated secretory phenotype. Experimental Gerontology. 82, 39-49 (2016).
  7. Kuilman, T., Michaloglou, C., Mooi, W. J., Peeper, D. S. The essence of senescence. Genes & Development. 24 (22), 2463-2479 (2010).
  8. Lu, T., Finkel, T. Free radicals and senescence. Experimental Cell Research. 314 (9), 1918-1922 (2008).
  9. Furumoto, K., Inoue, E., Nagao, N., Hiyama, E., Miwa, N. Age-dependent telomere shortening is slowed down by enrichment of intracellular vitamin C via suppression of oxidative stress. Life Sciences. 63 (11), 935-948 (1998).
  10. Lee, A. C., et al. Ras proteins induce senescence by altering the intracellular levels of reactive oxygen species. The Journal of Biological Chemistry. 274 (12), 7936-7940 (1999).
  11. Chen, Q., Ames, B. N. Senescence-like growth arrest induced by hydrogen peroxide in human diploid fibroblast F65 cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (10), 4130-4134 (1994).
  12. Dumont, P., et al. Induction of replicative senescence biomarkers by sublethal oxidative stresses in normal human fibroblast. Free Radical Biology & Medicine. 28 (3), 361-373 (2000).
  13. Blander, G., de Oliveira, R. M., Conboy, C. M., Haigis, M., Guarente, L. Superoxide dismutase 1 knock-down induces senescence in human fibroblasts. The Journal of Biological Chemistry. 278 (40), 38966-38969 (2003).
  14. Packer, L., Fuehr, K. Low oxygen concentration extends the lifespan of cultured human diploid cells. Nature. 267 (5610), 423-425 (1977).
  15. Serra, V., von Zglinicki, T., Lorenz, M., Saretzki, G. Extracellular superoxide dismutase is a major antioxidant in human fibroblasts and slows telomere shortening. The Journal of Biological Chemistry. 278 (9), 6824-6830 (2003).
  16. Rodier, F., Campisi, J. Four faces of cellular senescence. The Journal of Cell Biology. 192 (4), 547-556 (2011).
  17. Munoz-Espin, D., Serrano, M. Cellular senescence: from physiology to pathology. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 15 (7), 482-496 (2014).
  18. Tchkonia, T., Zhu, Y., van Deursen, J., Campisi, J., Kirkland, J. L. Cellular senescence and the senescent secretory phenotype: therapeutic opportunities. The Journal of Clinical Investigation. 123 (3), 966-972 (2013).
  19. van Deursen, J. M. The role of senescent cells in ageing. Nature. 509 (7501), 439-446 (2014).
  20. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  21. Kim, Y. Y., et al. Cooperation between p21 and Akt is required for p53-dependent cellular senescence. Aging Cell. 16 (5), 1094-1103 (2017).
  22. Serrano, M., Lin, A. W., McCurrach, M. E., Beach, D., Lowe, S. W. Oncogenic ras provokes premature cell senescence associated with accumulation of p53 and p16INK4a. Cell. 88 (5), 593-602 (1997).
  23. Wu, D., Yotnda, P. Production and detection of reactive oxygen species (ROS) in cancers. Journal of Visualized Experiments. (57), (2011).
  24. Wojtala, A., et al. Methods to monitor ROS production by fluorescence microscopy and fluorometry. Methods in Enzymology. 542, 243-262 (2014).
  25. Duncan, F. E., et al. Age-associated dysregulation of protein metabolism in the mammalian oocyte. Aging Cell. 16 (6), 1381-1393 (2017).
  26. Yang, L., Song, T., Chen, L., Soliman, H., Chen, J. Nucleolar repression facilitates initiation and maintenance of senescence. Cell Cycle. 14 (22), 3613-3623 (2015).
  27. Coppe, J. P., et al. Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor. PLoS Biology. 6 (12), 2853-2868 (2008).
  28. Kosar, M., et al. Senescence-associated heterochromatin foci are dispensable for cellular senescence, occur in a cell type- and insult-dependent manner and follow expression of p16(ink4a). Cell Cycle. 10 (3), 457-468 (2011).
  29. Sharpless, N. E., Sherr, C. J. Forging a signature of in vivo senescence. Nature Reviews. Cancer. 15 (7), 397-408 (2015).
  30. Baker, D. J., et al. Opposing roles for p16Ink4a and p19Arf in senescence and ageing caused by BubR1 insufficiency. Nature Cell Biology. 10 (7), 825-836 (2008).
  31. Baker, D. J., et al. Clearance of p16Ink4a-positive senescent cells delays ageing-associated disorders. Nature. 479 (7372), 232-236 (2011).
  32. Baar, M. P., et al. Targeted Apoptosis of Senescent Cells Restores Tissue Homeostasis in Response to Chemotoxicity and Aging. Cell. 169 (1), 132-147 (2017).
  33. Farr, J. N., et al. Targeting cellular senescence prevents age-related bone loss in mice. Nature Medicine. 23 (9), 1072-1079 (2017).
  34. Chang, J., et al. Clearance of senescent cells by ABT263 rejuvenates aged hematopoietic stem cells in mice. Nature Medicine. 22 (1), 78-83 (2016).
  35. Yosef, R., et al. Directed elimination of senescent cells by inhibition of BCL-W and BCL-XL. Nature Communications. 7, 11190(2016).
  36. Jeon, O. H., et al. Local clearance of senescent cells attenuates the development of post-traumatic osteoarthritis and creates a pro-regenerative environment. Nature Medicine. 23 (6), 775-781 (2017).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

H RasSA Beta galDCF DAPCRELISA
מדידה כמותית של מינים חמצן תגובתי, הזדקנות ביולוגית-הקשורים פנוטיפ הפרשה ב Fibroblasts אנושי נורמלי במהלך אונקוגן-induced הזדקנות ביולוגית
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.