מאמר שיטה

התאמת ניגודיות דטרגנט בניסויים פיזור ניוטרון זווית קטנה עבור ניתוח מבנה של חלבון ממברנה ומודלים Initio אלב

DOI:

10.3791/57901

⸱

21 באוקטובר 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Neutron Scattering Division, Oak Ridge National Laboratory, 2School of Chemistry and Biochemistry, Georgia Institute of Technology

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מדגים כיצד להשיג דגם ברזולוציה נמוכה ab initio ופרטים מבנית של חלבון הממברנה solubilized-חומרי ניקוי בתמיסה באמצעות פיזור ניוטרון זווית קטנה עם התאמת ניגודיות של הנוזל.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המכשיר פיזור ביולוגי ניוטרון זווית קטנה במעבדה גבוהה השטף איזוטופ הכור של אלון רכס הלאומי מוקדש החקירה של חומרים ביולוגיים, biofuel עיבוד וחומרים בהשראה ביו כיסוי ננומטר ל מיקרומטר פיסיקליות. השיטות המובאות כאן על חקירת תכונות פיזיקליות (קרי, גודל וצורה) של קרום חלבונים (כאן, MmIAP, פרוטאז aspartyl intramembrane מן Methanoculleus marisnigri) בפתרונות של יוצרי מיצלה חומרי ניקוי? מתאים היטב לכלי פיזור זה זווית קטנה ניוטרון, בין היתר. טכניקות אחרות אפיון biophysical הם מוגבל בשל חוסר היכולת שלהם כדי לטפל דטרגנט סיועה של מבנה מורכב אבקת חלבון. בנוסף, גישה למעבדה ביו-Deuteration מספק יכולות ייחודיות הכנת cultivations בקנה מידה גדול ולבטא את התווית על-ידי דאוטריום חלבונים לאות פיזור משופר של החלבון. בזמן זה טכניקה אינו מספק פרטים מבניים ברזולוציה, הפער בידע מבניים קרום חלבונים מכיל הרבה תחומי המחקר למיעון ללא צורך ברזולוציה ליד-אטומית. לדוגמה, אזורים אלה לכלול נחישות של מדינות oligomeric, היווצרות מורכבות, שינויים הסתגלותי במהלך ההפרעות, קיפול/התגלגלות אירועים. חקירות אלה ניתן להשיג בקלות באמצעות יישומים של שיטה זו.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קרום חלבונים מקודדים של % 30 המשוערת של גנים כל1 , מייצגים את רוב מטרות עבור תרופות מרפא מודרניים חזקים. 2 חלבונים אלה לבצע מגוון רחב של פונקציות חיוני הסלולר,3 אך למרות שפע וחשיבות שלהם – מייצג רק כ 1% של מבנים הכולל שהופקדו Collaboratory המחקר עבור חלבון ביואינפורמטיקה מבנית (RCSB) בנק מידע. 4 בשל טבעם הידרופובי חלקית, נחישות מבנית של חלבוני ממברנה מכורך כבר מאוד מאתגר. 5 , 6 , 7

טכניקות רבות biophysical דרוש monodisperse חלקיקים בתמיסה למדידה, בידוד מהחלבונים ממברנה מקורית ממברנות וייצוב חלבונים אלה ב לחקות מסיסים של הממברנות מקורי היה שטח פעיל של מחקר האחרונים עשורים. 8 , 9 , 10 חקירות אלה הובילו לפיתוח של הרכבות amphiphilic הרומן רבים solubilize קרום חלבונים, כגון nanodiscs,11,12,bicelles13 ,14,15 , amphipols. 16 , 17 . עם זאת, השימוש הקזאין דטרגנט נשאר לאחת הגישות הנפוצות ביותר וברור מספק את הדרישות מסיסות של חלבון נתון. 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 . למרבה הצער, אין סבון יחיד או תערובת הקסם של דטרגנטים כיום קיימת המקיים את כל החלבונים ממברנה; לפיכך, התנאים האלה בטח מדעית שיוקרנו הדרישות הייחודיות של כל חלבון. 26 , 27

חומרי ניקוי עצמי להרכיב בפתרון מעל שלהם ריכוז קריטי מיצלה למבנים צבירה טופס שנקרא הקזאין. הקזאין המורכבות הרבה מונומרים דטרגנט (בדרך כלל בטווח שבין 20-200) עם שרשראות הידרופוביות אלקיל ויוצרים גרעין מיצלה וקבוצות ראש הידרופילית מסודרים בשכבה מעטפת מיצלה מול הממס מימית. ההתנהגות של חומרי ניקוי, היווצרות מיצלה שתיארנו בסגנון קלאסי על ידי צ'ארלס Tanford אפקט הידרופובי,28 , גדלים, צורות של הקזאין של דטרגנטים נפוץ במחקרים חלבון ממברנה היה מאופיין באמצעות פיזור זווית קטנה. 29 , 30 דטרגנט הארגון על קרום חלבונים גם נחקר, וצפויה היווצרות של חלבונים-דטרגנט מתחמי (שיתפקדו) עם מולקולות דטרגנט המקיפים את החלבון בהסדר הדומה הנוזל מסודר הקזאין. 31

אחד הוסיף היתרון בשימוש חומרי ניקוי היא כי ניתן לטפל המאפיינים מיצלה הנוצרת על-ידי שילוב חומרי ניקוי אחרות. חומרי ניקוי רבים שהפגינו ערבוב אידיאלי, אפילו ניתן לחזות בחר מאפייני הקזאין מעורבות מן הרכיבים ואת יחס של ערבוב. 22 . עם זאת, הנוכחות של דטרגנט יכול עדיין להציג אתגרים אפיוני biophysical בתרומה לחברה האות הכללית. לדוגמה, עם צילום רנטגן וטכניקות פיזור אור, האיתות דטרגנט ב PDC הוא כמעט להבחין מגניחותיה חלבון. 32 חקירות עם מיקרוסקופ יחיד-חלקיקים הקפאה-אלקטרונים (הקפאה-EM) בדרך כלל לסמוך על לכוד חלקיקים (קפואים); פרטים מבניים של החלבון מעורפלים. עדיין דטרגנטים מסוימים או ריכוז גבוה של חומרי ניקוי המוסיף הרקע. 33 גישות חלופיות לקראת פענוח המבנה PDC מלאה (כולל הנוזל) נעשו באמצעות שיטות אשר מבקשים לשחזר הנוזל סביב חלבון ממברנה נתון. 34

במקרה של פיזור ניוטרון, הסידור ליבה-קליפה של דטרגנט בתוך מיצלה מייצרת גורם טופס אשר תורמת פיזור התצפיות. למרבה המזל, ניתן לשנות רכיבי פתרון כזה כי הם לא תורמים פיזור התצפיות נטו. תהליך זה "חדות התאמת" מושגת על ידי החלפת דאוטריום מימן להשיג צפיפות אורך פיזור המתאים של הרקע (מאגר). יש לקחת בחשבון בחירה הביוספירה של דטרגנט (עם עמיתיהם deuterated זמין) ואת היחס של ערבוב. עבור הקזאין דטרגנט, החלפה זו יכולה להתבצע באמצעות חומר ניקוי עם אותה הקבוצה בראש אבל העובדה שרשרת אלקיל deuterated (d-הזנב במקום h-הזנב). מאז חומרי ניקוי היטב מעורבת,35 אגרגטים שלהם יש צפיפות אורך פיזור זה השבר-השומה משוקלל ממוצע של שני הרכיבים (h-פלי ו d-פלי). כאשר זה הניגוד הממוצע של ראש הקבוצה, המבנים צבירה במדים ניתן להתאים באופן מלא כדי להסיר את כל התרומות כדי פיזור התצפיות.

אנו מציגים כאן פרוטוקול לתמרן את הניגוד ניוטרון של דטרגנט הקזאין על-ידי שילוב מולקולות דטרגנט מבחינה כימית זהה עם התווית על-ידי דאוטריום אלקיל שרשראות. 19 , 36 , 37 זה מתיר מהניגודים סימולטני התאמת מיצלה core ו- shell, אשר היא יכולת ייחודית של פיזור ניוטרון. 35 , 38 עם רמת פירוט מעודן באופן משמעותי, התאמת ניגודיות יכול לאפשר לימודים אחרת ישים מבני חלבון ממברנה. בנוסף, גישה זו התאמת ניגודיות אפשרות להאריך למערכות אחרות הקשורות דטרגנט, כגון פולימר חילופי תגובות39 ו שמן מים dispersants,40 או אפילו סוכנים אחרים, solubilizing, כגון bicelles,41 copolymers nanodiscs,42 או לחסום. גישה דומה 43 א כמתואר כתב יד זה, אבל העסקת זן דטרגנט יחיד עם החלפות חלקיות דאוטריום-אלקיל שרשרת ו/או ראש הקבוצה, יצא לאור לאחרונה. 37 בזמן זה צפויים לשפר את התפלגות אקראית של מימן, דאוטריום בכל רחבי הנוזל לעומת הגישה המובאת כאן, מספר מוגבל של משרות פתוחות על החומר ניקוי עבור החלפת ושני שלבים סינתזה דטרגנט נדרש מציבה אתגרים נוספים בתמורה.

שלבים 1 ו- 2 של פרוטוקול שיפורטו להלן לעתים קרובות חופפים מאז תכנון הניסוי הראשוני חייב להיעשות להגיש הצעה איכות. עם זאת, הצעת הגשה נחשב כאן בתור הצעד הראשון כדי להדגיש כי תהליך זה אמורה להתחיל הרבה לפני ניסוי ניוטרון. יש גם לציין כי צעד דרישה מוקדמת, אשר צריך ניתן להדגים על ידי ההצעה, הוא שתהיה הביוכימי ופיזית אפיון (כולל טוהר ויציבות) הדגימה התומכים בצורך לימודי ניוטרון. דיון כללי של זווית קטנה ניוטרון פיזור (SAN) חורג מהיקף מאמר זה. הקדמה קצרה אך יסודי זמין העבודה הפניה ואפיון של חומרים על ידי קאופמן,44 וספר לימוד ממוקד ביולוגי זווית קטנה פתרון מקיף פיזור שפורסם לאחרונה. 45 עוד המלצה לקריאה ניתנת במקטע דיון. זווית קטנה פיזור משתמש הווקטור פיזור שנקרא Q הכמות המרכזי המתאר את תהליך פיזור. מאמר זה משתמש בהגדרת נפוצה ומקובלת Q = חטא 4π (θ באמצעות) / λ, איפה θ באמצעות חצי הזווית בין קרן פזורים ונכנסות λ הוא אורך הגל של הקרינה ניוטרון ב אנגסטרום. הגדרות אחרות קיים שימוש שונה סמלים כגון של ' עבור וקטור פיזור, וכי עשויים להשתנות על ידי 2π פקטור או באמצעות ננומטר במקום אנגסטרום (ראה גם הדיון איור 10).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. להכין ולהגיש ניוטרון מתקן קרן ושעה כלי הצעה

  1. התייעץ עם משאבים מקוונים לזיהוי ניוטרון פיזור מתקנים המאפשרים כללי למשתמש ניוטרון קרן זמן גישה, כגון אוק רידג הלאומית מעבדה (ORNL). מפה של נייטרונים מתקני ומידע אודות ניוטרון מחקר ברחבי העולם זמין באינטרנט. 46 להיות מודע כי מתקנים אלה יש בדרך כלל קבוע קול קורא להגשת הצעות; זה קובע מתי בפעם הבאה קרן יהיה זמין. נייטרונים משמשים למגוון רחב של יישומים; חיפוש לכלי פיזור (SAN) זווית קטנה ניוטרון, במיוחד אלה עם יכולות על דגימות ביולוגיות.
  2. השתמש במשאבים המסופקים על ידי המתקנים ניוטרון לעזור נווט תהליך המסירה ניוטרון הצעת הזמן קרן. התייעץ עם נייטרונים פיזור מדען (NSS) המשויך המכשיר שעבורו אתה יחול. סקירה של המתקן ניוטרון מידע עדכני לגבי ההצעה שיחות, מועדים, וייעוץ להגשת; אלון רכס זה זמין באינטרנט. 47 להגיש את ההצעה זמן קרן בעקבות הנחיות כל כניעה מוצלח.
  3. אם החלבון deuterated הינה נדרשת (ראו 2.2), נייטרון פיזור מתקנים נתמכים לעתים קרובות על ידי מעבדות ומומחיות ייעודי לייצור של חומרים deuterated. כדי לבקש גישה ביו-Deuteration מעבדה (BDL) ב ORNL, בחר את BDL ככלי השני במערכת ההצעה. אמנם ההצעה SANS הוא סקר היתכנות, על-ידי ועדה סקירה מדעית, בקשות BDL מוקרנים רק עבור היתכנות. כדי לעזור עם הסקירה היתכנות BDL, להגיש מידע הושלמה בקשה טופס48 המתאר את הפרוטוקול ביטוי חלבון ואת התשואה המשוערת (זמין באינטרנט).
  4. לאחר מוצלחת-ביקורת עמיתים של ההצעה זמן קרן, לאשר את התאריך זכו של קרן זמן לפני הניסוי. ודא כל מדגם ומאגר פרטים ונוסחאות המפורטים כהלכה בהצעה לבדיקה תקין. שינויים בתכנית ניסיונית המוצע, לרבות שינויים בהרכב מדגם ומאגר, מחייבים הודעה על המתקן.
    הערה: שינויים ידונו בהקדם האפשרי עם תוכנית השירות NSS שהוקצו.

2. לקבוע נקודות משחק ניוטרון חדות וניגודיות הדרושים למדידה חלבון

  1. לאסוף מידע (מתוך פרטי המוצר של הספק, מאגרי מידע מקוונים, ערכים שפורסמו, וכו ') הנוגעים יצירות אטומי ואמצעי אחסון עבור רכיבי מערכת דטרגנט חדות-להתאמה. מידע זה משמש כדי לקבוע ניוטרון פיזור אורך צפיפויות (Sld) וחדות ובכך נקודות משחק (CMPs) בתמיסה, אשר חיוני להשגת איכות נטול מידע נתונים מבניים חלבון ממברנלי עניין בהקשר של PDC. טבלה המסכמת מאפייני והניגודיות התאמה נקודות פיזי עבור חומרי ניקוי נפוץ במחקרים ביופיזיקלי של קרום חלבונים הוא כלל (טבלה 1).
  2. לקבוע Sld ניוטרון באמצעות יישום האינטרנט גבבה: מודולים עבור ניתוח של ניגודיות וריאציה נתונים49 (זמין באינטרנט50 חינם of-אחראי). קישור למדריך ממוקם בדף הבית. הגישה שלך לאתר, קרא את התיעוד הנלווה. איור 1 ו- 2 איור מספקים סקירה של ניגודיות מודול הקלט והפלט עבור שתי דוגמאות הקשורות.
    הערה: אתרי אינטרנט אחרים לחישוב Sld הינם זמינים, כמו האחד מתוחזק על ידי המכון הלאומי לתקנים וטכנולוגיה (NIST) מרכז למחקר ניוטרון. 51
    1. לפתוח את המודול החדות על-ידי לחיצה על 'ניגוד' הממוקם בחלונית הניווט השמאלי. לספק טקסט עבור כותרת פרוייקט ולהזין פרטים להלן עבור שני מרכיבים (למשל, דטרגנט קבוצה ראש וזנב) כמו ' יחידת משנה 1', ' יחידה משנית 2'.
    2. הזן את הנוסחה המולקולרית של כל רכיב בתיבת הטקסט 'נוסחה'.
      הערה: לחצן רדיו אני "חייבת להיעשות תחת 'סוג חומר' כדי להזין נוסחה מולקולרית. בנוסף, להשתמש האות 'X' בנוסחה כדי לציין אטומי המימן להחלפה בקלות. ניתן להזין רצפי חלבונים, RNA או DNA אם המקביל 'P', 'R', או היה ' לחצני האפשרויות ייבחרו. אם עותקים מרובים של רכיב קיימים בתוך יחידת משנה הערך עבור 'Nmolecules' יכול להשתנות בהתאם. דוגמה מעשית כאן מתייחס השומנים דמוי דטרגנטים המכיל שני זנבות זהים, המאפשר את הנוסחה עבור אחד זנב שיוזן עם Nmolecules שווה ל- 2.
    3. הזן את אמצעי האחסון אנגסטרום מעוקב עבור כל רכיב בתיבה שמתחת '' עוצמה' (Å3). להשתמש בנוסחה של Tanford28 אלקיל שרשראות של אורך n, Vזנב = 27.4 + n * 26.9, כדי לחשב נפח הזנב משוער, או להשיג מולקולרית אמצעי אחסון של מידע על המוצר שסופק או לאור הערכים הספרות.
    4. הזן פרטים עבור מאגר הרכיבים. לשנות 'מינים של הממס התפרקה מס' באמצעות התפריט הנפתח כדי להוסיף או להסיר שורות עבור כל אחד מהרכיבים מאגר. במקרה של יוצרי מיצלה דטרגנטים, כוללים את מונומרים דטרגנט חינם כרכיבים נפרדים מאגר-ריכוז קריטי מיצלה של הנוזל (CMC).
    5. לחץ על 'שלח' כדי לבצע את החישובים ניגודיות ניוטרון ולהפיק דף תוצאות המספק טבלה של פיזור אורך צפיפות וחדות נקודות משחק, כמו גם נוסחות לקביעת פרמטרים אלה על כל אחוז נתון D2O ב- המאגר. סקור את הפרמטרים פיזור עם תשומת לב מיוחדת רכיב CMPs. הנקודות התאמה דומים (במרחק של-10% D2O), הריכוז מיצלה חינם הוא נמוך, אם הממוצע CMP ניתן להשתמש עבור התאמת ניגודיות התרומות דטרגנט. ברוב המקרים, CMP של דטרגנט קבוצה הראש, הזנב יהיו שונים על ידי יותר מ 10-15%, בהפקת גורם ליבה-קליפה טופס הנתונים SANS obfuscates ישירה אוסף של האות פיזור של החלבון לבד.
  3. להעריך את הניגוד בין דטרגנט קבוצה ראש וזנב. כאשר דטרגנט ראש קבוצה, אלקיל שרשרת הזנב CMPs אינם מתאימים, הזמינות ואת התאגדות של חומר ניקוי שהוחלפו דאוטריום יכולים להרשות פיזור אורך צפיפויות של רכיבים בחר להיות מתומרן. ברוב המקרים, זה ידרוש ויוצרים מיצלה מעורבת באמצעות דטרגנט זהה עם אלקיל שהוחלפו דאוטריום שרשראות. התוספת של דאוטריום מעלה הצפיפות אורך פיזור של הגרעין שהקים את זנבות השרשרת אלקיל. נקודת הקצה הרצוי, במקרה הזה, הוא כזה ראש קבוצה מעטפת CMP, אלקיל רשת הליבה CMP יש כ ערכים שווים.
    1. העלאת CMP גרעין מיצלה דטרגנט להיות כ שווה CMP של המעטפת ראש קבוצה על-ידי קביעת היחס המתאים של ערבוב בין h-פלי d-פלי משיג מהניגודים תואמים עם ראשי הקבוצות. תנאי הכרחי קביעה זו היא הידע CMP עבור זנב שרשרת אלקיל דאוטריום שהוחלפו. מקבילה זמין מסחרית כדי n-Dodecyl β-D-maltoside (DDM) הינו זמין עם כל מימן שרשרת אלקיל הוחלף דאוטריום (d25-DDM). חזור על החישובים ניגודיות המתוארים בשלב 2.1 עבור זנב היה ' במקום "h-הזנב".
    2. חישוב היחס השומה של h-הזנב עד d-זנב הדרושים עבור התאמת ניגודיות עם הקבוצה ראש CMP. הנוסחה הבאה יכול לסייע עם קביעה זו:
      CMPהראש = CMPh-פלי * χזנב h + CMPd-פלי * χd-פלי
      איפה CMP הוא פיזור אורך צפיפות וχ הוא השבר אמצעי האחסון עבור הרכיב הראש דטרגנט, h-פלי, או d-פלי. פתרונות במאגר של DDM, התאגדות של 44% לפי משקל (43% לפי השומה) של החומר ניקוי מוחלט כמו d25-DDM עם שרשראות אלקיל שהוחלפו דאוטריום מייצרת של CMP יחיד ב- 48.5% D2O עבור רכיבי הראש והן זנב.
  4. לשקול את מידת דאוטריום החלפת עבור החלבון ממברנה. למדידת פיזור מספיק, האיתות החלבון, CMP עבור החלבון צריך להיות לפחות 15% D2O בפתרון מן הנוזל CMP ותנאים מדידה. האות עולה עם הריבוע של ההבדל הזה %. מאז CMP החלבון ללא תווית מתרחשת בדרך כלל עם ~ 42% D2O בתמיסה (CMP דומה לקבוצות רבות ראש דטרגנט), דאוטריום תיוג של החלבון היא כמעט תמיד הכרח. 52

3. אקספרס ולטהר את חלבון ממברנלי עניין

  1. להכין ליברות (מרק lysogeny) בינוני ולגדול Escherichia coli (e. coli) תאים מחסה וקטור ביטוי inducible את הרצף חלבון המטרה.
    1. להכין תקשורתי מזערי. H2O או D2O, להמיס 7.0 g/L (NH4)2אז4, ו 5.25 g/L נה2HPO4, 1.6 g/L ח'2PO4, 0.50 g/L דיאמוניום מימן ציטראט, גליצרול 5.0 g/L, 1.0 מ"ל/L של 20% w/v MgSO 4·7H2O ו- 1.0 מ"ל/L של Holme במתכות (0.50 g/L CaCl2·2H2O 0.098 g/L CoCl2, CuSO 0.102 g/L4, 16.7 g/L FeCl3·6H2O, 0.114 g/L MnSO4· H2O, 22.3 g/L נה2EDTA·2H2O ו 0.112 g/L ZnSO4· H2O). 53 , 54
    2. להכין פתרונות מתאימים לאנטיביוטיקה מניות באמצעות H2O או D2O.
    3. להכין פתרון איזופרופיל-β-D-1-thiogalactopyranoside מניות באמצעות H2O או D2O.
    4. מסנן סטרילי כל הפתרונות לתוך יבשה, סטרילי מכולות באמצעות ואקום בקבוק-העליון, מזרק מסננים עם גודל הנקבוביות 0.22 מיקרון.
  2. להתאים את החיידק לתאים התווית על-ידי דאוטריום בינונית לפני הסולם על ביטוי של חלבון deuterated.
    1. לחסן 3 מ"ל של מדיום ליברות של המושבה מבודד מן צלחת אגר Lysogeny מרק (LB) או תאים מניה גליצרול קפוא. לגדל תאים ב- 37 מעלות צלזיוס חממה חזק ב 250 סל"ד או לצמצם את הטמפרטורה עד 30 ° C או להלן כדי למנוע גידול יתר של התרבות בעת המקננת בן לילה.
      הערה: הליך עיבוד יכולים להיות מגוונים. 55 , 56 , 57
    2. ברגע התרבות LB גדלה צפיפות אופטית על 600 nm (OD600) ~ 1, למהול אותו 1:20 ב- 3 מ"ל של מדיום מינימלי של2O H ולגדול יתר600 ~ 1. אני חוזר על 1:20 דילולים באמצעות בינונית מזערי המכיל 50, 75 ו- 100% D2O (או עד את האחוז הרצוי של2O D).
      הערה: כמו D2O תוכן הוא גדל, שיעורי צמיחה יקטן. היחסים בין האחוז2O D בצמיחה דאוטריום ומדיה החלפה חלבון דווח בספרות. 58 , 59 , 60
    3. המשך גידול התרבות במגיב ביולוגי כדי להגדיל את התשואה של תא deuterated המסה (איור 3).
      הערה: הליכים מפורטים לניתוח ביוריאקטור שנסקרו במקום אחר. 61 , 62 , 63 , 64
  3. הקציר ואת lyse e. coli תאים עבור חילוץ ממברנה וטיהור חלבונים
    1. גלולה התאים על ידי צנטריפוגה-g x ~ 6,000 עבור ~ 30-45 דקות ב 4 º C.
    2. להמיס, בגדר תא למסמס במאגר על קרח ~ 30 דקות. ואז, בעדינות resuspend בגדר תא במאגר על ידי בעדינות pipetting עם pipet סרולוגית, או עדין נדנדה על כיסא נדנדה 2D, כדי ריכוז הסופי של מאגר מסה/10 mL רטובים ~ 1 g.
      הערה: מאגר דוגמה הוא 50 מ מ HEPES (-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic 4 חומצה), pH 7.5, 200 מ"מ NaCl שיושלם עם לוח מעכב פרוטאז.
    3. Lyse תאים resuspended עם שלושה מעברים דרך מהמגן בלחץ גבוה ב- 10,000 psi בעודכם נרגעים זרימה החוצה.
      הערה: בהתאם קנה המידה הנדרשות, שיטות אחרות פירוק עשוי להיות בשימוש (לדוגמה, על-ידי העיתונות הצרפתית או sonication).
    4. צניפה שאריות תאים על ידי צנטריפוגה ב g x ~ 4,000-5,000 למשך 15 דקות ב 4 º C. חזור על שלב זה עד תגובת שיקוע מובהר.
    5. Ultracentrifuge (~ 150,000 x g למשך 30-45 דקות) תגובת שיקוע צעד קודם, אשר מכיל את מסיסים, ממברנה שברים. בגדר לאחר ultracentrifugation מכיל את השבר ממברנה.
    6. Resuspend בגדר ממברנה ב מהמגן גדול דאונס, לבודד את השבר ממברנה שוב על-ידי ultracentrifugation (שלב 3.3.5). חזור על שלב זה לפחות פעם אחת כדי להסיר חלבונים מאוגדים באופן רופף.
    7. Solubilize ממברנות במוזיקת עדין ~ 30 דקות ב 4 ° C במאגר המכיל חומרי ניקוי מתאים טיהור. Solubilization בולטת כאשר המתלה הופך מ מעונן לשקוף. להסיר חומרים לא מסיסים על ידי ultracentrifugation (~ 150,000 x g למשך 30-45 דקות).
      הערה: מאגר דוגמה הוא 50 מ מ HEPES, pH 7.5, 500 מ מ NaCl, 20 מ מ imidazole ו- 4% (w/v) DDM לטיהור מאת ני2 + כרומטוגרפיית זיקה.
  4. לטהר את החלבון בעקבות פרוטוקול שפותחו בעבר עבור טפסים protonated.
    הערה: ר' דוד זטלמן et al. עבור פרוטוקול טיהור דוגמה עבור פרוטאז aspartyl (d-MmIAP) intramembrane marisnigri מ JR1 hexahistidine מתויגים. 65 התשואה הסופית היתה ~ 1 מ ג של deuterated מ- 5 L deuterated צמיחת תאים תרבות, אשר שימשה לניסוי SANS (איור 4).
  5. להחליף את חלבון מטוהרים למאגר"הסופי Exchange" להתאמת החדות.
    1. להכין 200 מ"ל"הסופי Exchange מאגר"המכיל את התערובת הנכונה לקבלת ניגודיות תואמים, למשל,20 מ מ HEPES, pH 7.5, 250 מ מ NaCl ו 0.05% סה כ DDM (0.028% DDM ו 0.022% d25-DDM) ב-49% D2O.
    2. Equilibrate אי-הכללה של גודל עמודה עם > 2 עמודות (CV) "מאגר Exchange הסופי" בשני כרכים 3.5.1 באמצעות מערכת מהר חלבון נוזלי כרומטוגרפיה (FPLC).
    3. לאחר הזרקת המדגם, להפעיל את העמודה, לבודד שברים המייצגים החלבון עניין.
    4. רכז החלבון לריכוז הסופי הרצוי (2-5 מ"ג/מ"ל).
      הערה: נפח של μL ~ 300 הוא נדרש למלא cuvette קוורץ גלילי של 1 מ מ המשמש SANS.
    5. שומרים על aliquot של מאגר מתאימים עבור SANS רקע חיסור.
      הערה: ניתן לקחת את aliquot ישירות מתוך המאגר מוכן, או באופן אידיאלי שבר נקי • תנאי בסוף המרוץ FPLC.

4. להפוך את ההכנות האחרונות עבור קרן זמן לאסוף SANS נתונים

  1. לאחר ההצעה התקבלה גישה לאתרי אושרה, להשלים כל האימונים מועד קרן שהוקצו. זה כולל prearrival, הדרכה מעבדה רדיואקטיבית, באתר, ואת כלי הדרכה מבוססת אינטרנט.
    הערה: דרישות ההכשרה עשויה להכתיב ההגעה מראש עבור משתמשים בפעם הראשונה. מידע נוסף זמין באינטרנט. 66
  2. לטעון מאגרים עבור איסוף נתונים ודוגמאות.
    הערה: סקירה כללית של פיזור ניוטרון זווית קטנה ביולוגי (ביו-SANS) מכשיר מדגם סביבת האזור מוצג באיור5.
    1. לטעון מאגרי ודוגמאות לתאים קוורץ. קוורץ תאים זמינים מדען מכשיר או מתקן. השתמש בעצות העמסה ג'ל כדי לגשת הפתח הצר של רוב התאים הדגימה.
    2. להבטיח כי התריס קרן סגורה, לאחר מכן להתקרב לאזור הסביבה לדוגמה, במקום התאים קוורץ במחליף מדגם. לתעד את המיקום מחלף לדוגמה עבור כל תא הדגימה.
    3. . תבדוק את האזור להבטיח הנתיב בים ללא חסימה, ואז לעזוב את האזור סביבה מדגם, פתח את התריס קרן.
      הערה: בזהירות בצע כל מתקן חוקים ותקנות, לציית כל מה שנכתב, לשים לב עצתו של המדען כלי. דוגמאות עשוי להיות לא להסיר מן הקורה, מניפולציות לאחר חשיפה על הקורה ללא אמצעי הזהירות המיוחדים הבאים. התייעץ עם רדיולוגי שליטה טכנאי (RCT) לפני הליכים אלה.
  3. ביצוע סריקה טבלה עבור איסוף נתונים אוטומטיים
    1. להפעיל את המכשיר באמצעות פקד מותאם אישית LabVIEW מבוסס תוכנה, ספקטרומטר כלי בקרת הסביבה (SpICE). בצע את ההוראות עבור כלי פעולה המסופקים על ידי המדען פיזור ניוטרון. סקירה כללית של windows מבצע סריקה שולחן מסופק ב איור 6.
    2. לאחר הזנת המידע הנדרש בתחומים המתאימים, להפעיל את הסריקה טבלה ויתחיל תהליך איסוף נתונים אוטומטיים. עקוב אחר התקדמות דרך הכרטיסיה 'מצב סריקה טבלה'.

5. להפחית SANS לנתונים מתמונת 2D לחלקה 1 י

  1. לזהות כל קובץ נתוני מאגר ולדגום מן המספרים סריקה המוקלט. כל אחת מהמידות יוקצה מספר ייחודי הסריקה. מידע זה שימושי במהלך הפחתה בנתונים כדי לזהות כל זוג מאגר ולדגום המתאימים.
  2. שימוש MantidPlot תוכנה ו- script פיתון להפחתת
    1. נייטרון פיזור המשתמשים מסופקים עם פרטי החשבון לגישה לנתונים שלהם באשכול ניתוח מרוחק. 67 . היכנס לאשכול ניתוח מרוחק ובצע "MantidPlot" מתוך שורת הפקודה. איור 7 איור 8 ניתנים כדי לסייע שלבים אלה.
    2. להשיג הפחתה משתמש ב- Script של המדען פיזור ניוטרון (שזה בדרך כלל יקרה במהלך הניסוי); התסריט הזה הוא מבוסס-Python, יכיל כל צורך בכיול והתאמות קנה מידה כדי להקטין את התמונה פיזור 2D לתוך מגרש 1 י של עוצמות פזורים כפונקציה של פיזור זווית, I(Q).
    3. פתח את התסריט הפחתת למשתמש שסופקו ב MantidPlot ומניחים את מספרי הסריקה המתאימה או זיהוי עבור זוגות מדגם ומאגר ברשימה המתאימה.
    4. ביצוע ה-script ליצור נתוני מופחתת כקובץ טקסט ארבעה טורים (סדר העמודות הוא Q, I(Q), I(Q) שגיאה, Q שגיאה) במיקום שצוין. סביבת העבודה המתאימה ב- MantidPlot קליק ימני ובחר "על מגרש עם שגיאות." בחינה ראשונית של הפרופילים פיזור.

6. לנתח את הנתונים עבור הפרמטרים מבנית של החלקיק פיזור

  1. העבר את קובץ הנתונים מופחת מהשרת ניתוח מחשב מקומי באמצעות העברה מאובטחת של קבצים FTP. זה יכול להתבצע עם השימוש של תוכנות כמו FileZilla או CyberDuck. הוראות נוספות ופרטים עבור חיבור מערכת הקבצים של השרת ניתוח ניתנים בעמוד הכניסה analysis.sns.gov.
  2. הורד את ATSAS תוכנה סוויטת65,68 (כל סוויטה ATSAS). 69 תוכניות בודדות70 הינם גם זמינים באינטרנט לניתוח הנתונים SANS, כלומר קביעת פרמטרים מבניים ומודלים ab initio .
    הערה: אפשרויות רבות זמינות עבור SANS ניתוח נתונים של ובמקרו-מולקולות ביולוגיות. 45
  3. השתמש פרימוס71 על התוויית נתונים, מאגר שינוי קנה מידה, חיסור, וניתוח Guinier.
    1. להפעיל את ATSAS 'ניתוח נתונים מסוג SAS' יישום, לטעון הנתונים מופחת קבצים התואמים זוג מאגר ולדגום.
      1. לשינוי גודל המאגר כראוי, בחר טווח נתונים-Q גבוה (Q > 0.5 Å-1) שבו שני פרופילים דומה ושטוחים, לחץ על לחצן 'סולם' ממוקם תחת 'פעולות' טאב. גורם קנה המידה יחולו על המאגר כזה כי אלה שני אזורים שטוח צריך לחפוף. שימוש באזהרה: צריך להיות סיבה גופנית סבירה שמצדיקה דרוג עוצמתו מאגר כך שתתאים לדוגמה. אם הפער הוא גדול, להתייעץ עם מדען כלי עבור גישות חוקי רקע חיסור. 44 , 45 , 72
      2. להגדיל את טווח הנתונים כדי להציג את כל הנקודות. לחץ על 'החסר' לביצוע פעולה זו. קליק ימני על קובץ נתונים המופחת-מאגר במקרא ולשמור קובץ זה לצורך ניתוח מאוחר יותר. איור 9 מתאר את השימוש הכרטיסיה 'פעולות'.
    2. לבצע ניתוח Guinier של הנתונים לדוגמה המופחת-מאגר באמצעות הכרטיסיה 'ניתוח' של היישום 'ניתוח נתונים מסוג SAS'.
      1. ודא שהקובץ תקין נבחר ברשימה ולחצו על 'רדיוס של רגע'. ניסיון אוטומטית לבצע Guinier מתאים יינתן על-ידי לחיצה על לחצן 'Autorg'.
      2. להרחיב את טווח נתונים המשמשים כדי לכלול את כל הנתונים נמוכים-Q ולהתחיל לצמצם את טווח הנתונים על ידי לקיחת high-Q נקודות עד Qmax * Rg המותרת היא מתחת 1.3. להשתמש העלילה של תמלוגים כדי לוודא כי הנתונים הם ליניאריים בטווח מתאים. Guinier מתאים התשואות משוער Rg ואני0 עבור החלקיקים פיזור.
      3. לעשות שינויים קטנים באזור מתאים ונטר את הרגישות של ערכים אלה טווח נתונים המשמשים את ההתאמה. איור 10A מדגים את השימוש בכלי 'רדיוס של רגע'.
  4. להשיג את פונקציית ההתפלגות של הסתברות (P(r)) ב GNOM. 73 בקובץ הפלט שנוצר כאן ישמש כקלט עבור ab initio מידול תהליך.
    1. התחל באשף הפצת מרחק בתוך הכרטיסיה 'ניתוח' קבלת מתאים לנתונים חיוני להשגת איכות מודל. לקבלת מידע נוסף על קבלת מתאים מדויק, ראה את הסקירה74 מאת פאטנם, et al.
      הערה: GNOM התוכנית מספקת מידע נוסף אודות התאם מעבר באשף הפצת מרחק. איור 10 ב' מדגים שימוש נכון בכלי "מרחק הפצה", איור 11 מדגים חלק השגיאות הנפוצות נתקל.
    2. לקבוע Dmax, interatomic המרחק המקסימלי בתוך המולקולה.
      1. הערכת ערך עבור Dmax על ידי ביטול הסימון בתיבה כדי לכפות Rmax = 0, הזנת ערך גדול עבור Dmax (150, לדוגמה). X-החיתוך הראשון של העלילה של P(r) מניב מהערכה זו.
      2. לבצע שינויים הדרגתיים ערך Dmax זה לבין טווח הנתונים המשמשים או מספר נקודות בשימוש התאם כדי למטב את GNOM שיתאים את הנתונים ואת העקומה המתקבלת P(r).
    3. ממשיכים לחדד את התאמת GNOM לשמור קבצי הפלט GNOM עם פרמטרים בכושר טוב עבור הבאים ab initio דוגמנות צעדים.
  5. לדמות SANS פרופילים של מודלים PDB ברזולוציה גבוהה באמצעות תוכנית CRYSON. 75
    1. פתח את התוכנית, בחר באפשרות '0'. בחר את שם הקובץ PDB הדפדפן קובץ מוקפץ. הקש enter כדי לקבל את הגדרות ברירת המחדל, למעט ציון הרשת deuteration שברים ומספרים את חלק D2O בהממס כדי להשיג את הפרמטרים ניגודיות נאותה.
    2. מתאים למודל ערכת נתונים ניסיוני על-ידי הזנת ה-Y' ובחירה בקובץ הנתונים של הדפדפן קובץ מוקפץ. לקבל את ערכי ברירת המחדל הנותרים, ואת קבצי פלט ייכתבו תוך מיקום הקובץ PDB. הקובץ '.fit' מכיל מידע עבור הפרופיל החזוי פיזור של דגם התלת-ממד ברזולוציה גבוהה.

7. ליצור מודלים אלב Initio מ נטול נתונים.

הערה: DAMMIF76 ו DAMMIN77 בתוך חבילת התוכנות ATSAS משמש לבנייה מחדש של מודלים אטום דמה (סכרים) באמצעות תהליך מחזק מדומה מ GNOM פלט, אשר מכיל P(r) נתונים או מידע אודות ההסתברות או תדירות של מרחקים interatomic בתוך החלקיק פיזור. ניתן להפעיל תוכניות אלה במצב אצווה או בשרת האינטרנט ATSAS-Online.

  1. הפעל את אשף צורה פרימוס מלחצן 'Dammif' בכרטיסיה 'ניתוח' 'ניתוח נתונים מסוג SAS', והשתמש בחירה ידנית של פרמטרים. הקלט עבור האשף מודגם באיור12.
    1. להגדיר את הטווח Guinier של התאם (שלב 6.3.2) והמשך לשלב הבא באמצעות לחצני הניווט. הגדרת הערכים בכושר מן העלילה P(r) (שלב 6.4) והמשך לשלב הבא.
    2. לספק את הפרמטרים עבור ab initio מידול תהליך. הזינו קידומת לשמות הקבצים דגם פלט (לדוגמה, SANSEnvelope), לבחור או דוגמנות במצב 'מהיר' או 'איטי', הזן ערך עבור מספר דגמים (17 מומלצת מובהקות סטטיסטית), בחר מתוך האפשרויות הזמינות עבור חלקיקים סימטריה, anisometry, גודל זוויתי (אם ידוע). ודא התיבות נבדקים מודלים ממוצע עם DAMAVER לחדד את הדגם הסופי עם DAMMIN.
    3. ליזום את התהליך באמצעות לחצן 'בצע'. לאחר השלמת התהליך, להציג ולשמור על ספריית העבודה.
      הערה: תהליך דוגמנות טיפוסי בודד, חלבון קטנה עשויה להימשך עד מספר שעות עם מחשב אישי טיפוסי. תיקיות זמניות עד לשמירת מאוחסנים הקבצים.
  2. כיסוי ו להרכיב הסופי SANS מעטפה עם דוגמנית ברזולוציה גבוהה קשורים באמצעות SUPCOMB בתוך ATSAS. הצבת עותק של המודל PDB ברזולוציה גבוהה שתתאים למעטפה SANS ב ספריית העבודה. ביצוע SUPCOMB משורת הפקודה באמצעות שמות קבצים PDB כמו שני ארגומנטים עם מבנה תבנית ראשון ברשימה: $ supcomb HiRes.pdb SANSEnvelope.pdb
    הערה: הקובץ השני ברשימה, הערך ייכתב כקובץ חדש עם "ר" מצורף לשם סוף וקבלת הציון החדשות עבור superimposition על מבנה תבנית.
  3. דמיינו את ab initio דגם התוצאות תוך שימוש PyMOL (pymol.org), תוכנית צפייה 3D גרפיקה מולקולרית. איור 13 מספק סקירה של פעולות PyMOL.
    הערה: ישנן הנחיות פרסום דוגמנות מבנית של זווית קטנה פיזור נתונים מולקולות בפתרון. 78
    1. להפעיל את היישום PyMOL ופתח את קבצי .pdb המקביל 3D SANS המעטפה ואת המבנה ברזולוציה גבוהה מיושר לימין SUPCOMB להצגה.
    2. דמיינו את המעטפה SANS על ידי המייצג את המודל הזה כמו משטח. לחץ של ' לחצן מודל, בחר ' הצג: כמו: משטח '.
    3. דמיינו את המבנה המרכזי (backbone) של חלבונים ברזולוציה גבוהה על ידי המייצג את המודל הזה כמו קריקטורה. בחר של ' לחצן ליד מודל זה ובחר ' הצג: כמו: קריקטורה '. להציג את השרשרת כמו קשת בענן של N - כדי קרבוקסילי על-ידי בחירת לחצן 'C', ' על ידי שרשרת: Chainbows'.
    4. לשנות את השקיפות של ייצוג פני שטח עבור בהירות. שורת התפריטים 'הגדרה', בחר באפשרות ' שקיפות» משטח» 40% '.
    5. להפוך את הרקע לבן שאינו אטום. שורת התפריט 'תצוגה', בחר באפשרות ' רקע»' ובחר 'אטום' בטל זה והאפשרות 'לבן' כדי לסמן את צבע הרקע.
      הערה: פעולות נוספות ואת שימושים PyMOL ניתן למצוא ב- PyMolWiki.org.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הצעה וזמן מכשיר קרן ברור צריך להעביר את כל המידע הדרוש לוועדה סקירה כך הערכה חוקית של הניסוי המוצע יכול להתבצע. תקשורת עם תוכנית השירות NSS הוא הציע מאוד עבור משתמשים לא מנוסים. תוכנית השירות NSS יכול להעריך היתכנות ראשונית ואת מדריך הקרן כדי להדגיש היתכנות, בטיחות, ואת הפוטנציאל למדע high-השפעה. במידע הנמסר ההצעה צריכה לכלול מידע רקע ולהקשר את המשמעות של המחקר; ידע זה צפוי להיות מושגת, איך זה משפיע על ההבנה הנוכחית בתחום הקשור למדע; תיאור של עבודה, דוגמאות, שיטות, נהלים המעולים; וכן, אם ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

החוקרים בביולוגיה מבנית לנצל משלימים טכניקות מבניים כמו פתרון פיזור להשיג פרטים הביוכימי ומבניים (כגון הכולל גודל וצורה) של מולקולות בפתרון. SANS הוא טכניקה אטרקטיביים במיוחד לצורך קביעת מבנים ברזולוציה נמוכה של קרום חלבונים, מוקד הליבה של ביולוגיה מבנית מודרנית וביוכימיה. SANS דורשת כמויות חלבונים מטוהרים דומות לאלה של ניסויים לחקר הגבישים (מ ג 1/דוגמה). הזמינות המסחרית לאחרונה מתרחבת של טוהר גבוהה דטרגנטים deuterated הרלוונטיים ללימודים חלבון ממברנה הופך נגיש אמצעי לתמרן הזה המימן/דאוטריום תוכן עבור SANS ניסויים של מכל...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים וולקר ס עירוני, סאי ונקאטש Pingali, קווין ל' וייס, ראיין ג אוליבר כשהשרירים מכווצים דרך UT-Battelle עם אותנו DOE כדי לתמוך את תוכנית משתמש המדע ניוטרון וביו -נטול כלי-אוק רידג המעבדה הלאומית להשתמש במאמר זה.

כתב יד זה יש כבר במשותף על ידי UT-Battelle, LLC, תחת חוזה דה-AC05-00OR22725 עם לנו מחלקת האנרגיה (DOE). ממשלת ארה ב שומר ובהיותו המו ל, על-ידי קבלת המאמר לפרסום, כי ממשלת ארצות הברית שומרת על רישיון בלעדיות, הספקות, לעצמם, ברחבי העולם כדי לפרסם או לשחזר את הטופס שפורסם של כתב יד זה, או לאפשר אחרים לעשות כן, למטרות ממשלת ארה ב. DOE תספק גישה ציבורית אלה תוצאות של מחקר ממומן פדרלי על פי תוכנית גישה ציבורית של DOE. 82

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המשרד של ביולוגי, המחקר הסביבתי נתמכת מחקר במרכז של ORNL ביולוגיה מולקולרית מבנית (CSMB), ביו-SANS באמצעות מתקני נתמך על ידי מדעי משתמש מתקני החלוקה, Office Basic אנרגיה למדעים, מחלקת אותנו של אנרגיה. עבודה מבניים על קרום חלבונים במעבדה ליברמן בתמיכתם NIH (DK091357, GM095638), ה-NSF (0845445).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
רכז Amicon Ultra MWCO 50KDa EMD MilliporeUFC905096labware
אמוניום ציטראט dibasicפישר מדעיA663בינוני
רכיב אמוניום גופרתיEMD Millipore2150בינוני רכיב
Bioflo 310 Bioreactor SystemEppendorfM1287-2110ציוד
סידן כלוריד דיהידראטAcros423525000רכיב בינוני
קרבניציליןIBIאנטיביוטיקה
IB02025 כלורמפניקולEMD Millipore3130אנטיביוטיקה
קובלט (II) כלורידAcrosAC21413-0050רכיב בינוני
נחושת (II) סולפטאקרוסAC19771-1000 רכיב בינוני
תחמוצת דאוטריוםסיגמא-אולדריץ'756822מטהר
גז דריריטW.A. Hammond Drierite Co. Ltd.27068
EDTA, דיסודיום, דיהידראטEMD Millipore4010רכיב בינוני
Emulsiflex-C3AvestinEF-C3ציוד
Ä מטהר KTA UPC100GE בריאות ציוד
גליצרולסיגמא-אולדריץ'G5516רכיב בינוני
HEPESסיגמא-אולדריץ'H4034
HiPrep 16/60 Sephacryl S-300 HR עמודהGE בריאות 
ImidazoleVWR97064-622
IPTGTeknovaI3325
ברזל (III) כלוריד הקסהידראטMP ביוכימיקליםICN19404590רכיב בינוני
LB Agar MillerFisher ScientificBP1425-2
מגנזיום סולפט הפטהידראטVWR97062-134רכיב בינוני
מנגן(II) סולפט מונוהידראטAcrosAC20590-5000רכיב בינוני
MaxQ 6000 שייקר מודגר/מקוררThermo ScientificSHKE6000-7 ציוד
n-Dodecyl-d25-β-D-maltopyranosideAnatraceD310T
n-Dodecyl-β-D-maltopyranosideAnatraceD310A
אשלגן פוספט מונו-בסיסיVWR97062-346רכיב בינוני
RC 6 פלוס צנטריפוגהתרמו מדעי Sorvall46910ציוד
SIGMAFAST מעכב פרוטאז טבליות קוקטייל, ללא EDTASigma-AldrichS8830
נתרן כלוריSigma-AldrichS3014
נתרן הידרוקסידSigma-Aldrich795429
נתרן פוספט דו-בסיסיSigma-AldrichS7907רכיב בינוני
מסנן מזרק סטרילי 25 מ"מ עם 0.2µ m PES ממברנהVWR28145-501כלי מעבדה
מסנן עליון בקבוק חד פעמי סטרילי עם 0.2µ m ממברנה PESThermo Scientific596-4520 כלי מעבדה
Superdex 200 10/300 GL GE בריאות 
Superose-12 10/300 GL column GE בריאות 
Ultrospec 10 מד צפיפות תאים GEHealthcare מכשור80211630
אבץ גופרתי מונוהידראטאקרוסAC38980-2500 רכיב בינוני
מדעית בינוני 171167011751750117517301

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wallin, E., Heijne, G. V. Genome-wide analysis of integral membrane proteins from eubacterial, archaean, and eukaryotic organisms. Protein Science. 7 (4), 1029-1038 (1998).
  2. Tautermann, C. S. GPCR structures in drug design, emerging opportunities with new structures. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 24 (17), 4073-4079 (2014).
  3. Cournia, Z., et al. Membrane protein structure, function, and dynamics: A perspective from experiments and theory. The Journal of Membrane Biology. 248 (4), 611-640 (2015).
  4. Doerr, A. Membrane protein structures. Nature Methods. 6, 35(2008).
  5. Bill, R. M., et al. Overcoming barriers to membrane protein structure determination. Nature Biotechnology. 29, 335(2011).
  6. Carpenter, E. P., Beis, K., Cameron, A. D., Iwata, S. Overcoming the challenges of membrane protein crystallography. Current Opinion in Structural Biology. 18 (5), 581-586 (2008).
  7. Sanders, C. R., Sönnichsen, F. Solution NMR of membrane proteins: Practice and challenges. Magnetic Resonance in Chemistry. 44 (S1), S24-S40 (2006).
  8. Garavito, R. M., Ferguson-Miller, S. Detergents as tools in membrane biochemistry. Journal of Biological Chemistry. 276 (35), 32403-32406 (2001).
  9. Privé, G. G. Detergents for the stabilization and crystallization of membrane proteins. Methods. 41 (4), 388-397 (2007).
  10. Wessel, D., Flügge, U. I. A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids. Analytical Biochemistry. 138 (1), 141-143 (1984).
  11. Bayburt, T. H., Grinkova, Y. V., Sligar, S. G. Self-assembly of discoidal phospholipid bilayer nanoparticles with membrane scaffold proteins. Nano Letters. 2 (8), 853-856 (2002).
  12. Bayburt, T. H., Sligar, S. G. Membrane protein assembly into Nanodiscs. FEBS Letters. 584 (9), 1721-1727 (2010).
  13. Skar-Gislinge, N., et al. Elliptical structure of phospholipid bilayer nanodiscs encapsulated by scaffold proteins: Casting the roles of the lipids and the protein. Journal of the American Chemical Society. 132 (39), 13713-13722 (2010).
  14. Sanders, C. R., Schwonek, J. P. Characterization of magnetically orientable bilayers in mixtures of dihexanoylphosphatidylcholine and dimyristoylphosphatidylcholine by solid-state NMR. Biochemistry. 31 (37), 8898-8905 (1992).
  15. Vestergaard, M., Kraft, J. F., Vosegaard, T., Thøgersen, L., Schiøtt, B. Bicelles and other membrane mimics: comparison of structure, properties, and dynamics from MD simulations. The Journal of Physical Chemistry B. 119 (52), 15831-15843 (2015).
  16. Popot, J. -L., et al. Amphipols From A to Z. Annual Review of Biophysics. 40 (1), 379-408 (2011).
  17. Tribet, C., Audebert, R., Popot, J. -L. Amphipols: Polymers that keep membrane proteins soluble in aqueous solutions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 93 (26), 15047(1996).
  18. Fernández, C., Wüthrich, K. NMR solution structure determination of membrane proteins reconstituted in detergent micelles. FEBS Letters. 555 (1), 144-150 (2003).
  19. Hiruma-Shimizu, K., Shimizu, H., Thompson, G. S., Kalverda, A. P., Patching, S. G. Deuterated detergents for structural and functional studies of membrane proteins: Properties, chemical synthesis and applications. Molecular Membrane Biology. 32 (5-8), 139-155 (2015).
  20. Krueger-Koplin, R. D., et al. An evaluation of detergents for NMR structural studies of membrane proteins. Journal of Biomolecular NMR. 28 (1), 43-57 (2004).
  21. Linke, D. Methods in Enzymology. Burgess, R. R., Deutscher, M. P. 463, Academic Press. 603-617 (2009).
  22. Oliver, R. C., et al. Tuning micelle dimensions and properties with binary surfactant mixtures. Langmuir. 30 (44), 13353-13361 (2014).
  23. Orwick-Rydmark, M., Arnold, T., Linke, D. The use of detergents to purify membrane proteins. Current Protocols in Protein Science. 84 (1), (2016).
  24. Tanford, C., Reynolds, J. A. Characterization of membrane proteins in detergent solutions. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Reviews on Biomembranes. 457 (2), 133-170 (1976).
  25. Tulumello, D. V., Deber, C. M. Efficiency of detergents at maintaining membrane protein structures in their biologically relevant forms. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1818 (5), 1351-1358 (2012).
  26. Arachea, B. T., et al. Detergent selection for enhanced extraction of membrane proteins. Protein Expression and Purification. 86 (1), 12-20 (2012).
  27. Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: Not just a soap opera. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1666 (1), 105-117 (2004).
  28. Tanford, C. The Hydrophobic Effect: Formation of Micelles and Biological Membranes. , 2nd edn, John Wiley. (1980).
  29. Littrell, K., Urban, V., Tiede, D., Thiyagarajan, P. Solution structure of detergent micelles at conditions relevant to membrane protein crystallization. Journal of Applied Crystallography. 33 (3 Part 1), 577-581 (2000).
  30. Oliver, R. C., et al. Dependence of micelle size and shape on detergent alkyl chain length and head group. PLOS ONE. 8 (5), e62488(2013).
  31. Maire, M., Champeil, P., Møller, J. V. Interaction of membrane proteins and lipids with solubilizing detergents. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1508 (1), 86-111 (2000).
  32. Hong, X., Weng, Y. -X., Li, M. Determination of the topological shape of integral membrane protein light-harvesting complex LH2 from photosynthetic bacteria in the detergent solution by small-angle X-ray scattering. Biophysical Journal. 86 (2), 1082-1088 (2004).
  33. Vinothkumar, K. R. Membrane protein structures without crystals, by single particle electron cryomicroscopy. Current Opinion in Structural Biology. 33, 103-114 (2015).
  34. Pérez, J., Koutsioubas, A. Memprot: A program to model the detergent corona around a membrane protein based on S-SAXS data. Acta Crystallographica Section D. 71 (1), 86-93 (2015).
  35. Oliver, R. C., Pingali, S. V., Urban, V. S. Designing mixed detergent micelles for uniform neutron contrast. The Journal of Physical Chemistry Letters. 8 (20), 5041-5046 (2017).
  36. Hiruma-Shimizu, K., Kalverda, A. P., Henderson, P. J. F., Homans, S. W., Patching, S. G. Synthesis of uniformly deuterated n-dodecyl-β-D-maltoside (d39-DDM) for solubilization of membrane proteins in TROSY NMR experiments. Journal of Labelled Compounds & Radiopharmaceuticals. 57 (14), 737-743 (2014).
  37. Midtgaard, S. R., et al. Invisible detergents for structure determination of membrane proteins by small-angle neutron scattering. The FEBS Journal. 285 (2), 357-371 (2018).
  38. Gabel, F. Biological Small Angle Scattering: Techniques, Strategies and Tips. Chaudhuri, B., Muñoz, I. G., Qian, S., Urban, V. S. , Springer. Singapore. 201-214 (2017).
  39. Schantz, A. B., et al. PEE-PEO Block copolymer exchange rate between mixed micelles is detergent and temperature activated. Macromolecules. 50 (6), 2484-2494 (2017).
  40. Liyana-Arachchi, T. P., et al. Bubble bursting as an aerosol generation mechanism during an oil spill in the deep-sea environment: Molecular dynamics simulations of oil alkanes and dispersants in atmospheric air/salt water interfaces. Environmental Science: Processes & Impacts. 16 (1), 53-64 (2014).
  41. Dos Santos Morais, R., et al. Contrast-matched isotropic bicelles: A versatile tool to specifically probe the solution structure of peripheral membrane proteins using SANS. Langmuir. 33 (26), 6572-6580 (2017).
  42. Maric, S., et al. Stealth carriers for low-resolution structure determination of membrane proteins in solution. Acta Crystallographica Section D. 70 (2), 317-328 (2014).
  43. Pedersen, J. S., Svaneborg, C., Almdal, K., Hamley, I. W., Young, R. N. A small-angle neutron and x-ray contrast variation scattering study of the structure of block copolymer micelles: Corona shape and excluded volume interactions. Macromolecules. 36 (2), 416-433 (2003).
  44. Urban, V. S. Characterization of Materials. Kaufmann, E. N. , John Wiley and Sons. (2012).
  45. Chaudhuri, B., Muñoz, I. G., Qian, S., Urban, V. S., et al. Advances in Experimental Medicine and Biology. Cohen, I. R. 1009, Springer Singapore. Singapore. 1-268 (2017).
  46. Neutron Facilities WorldWide. , Available from: http://neutronsources.org (2018).
  47. Submitting a Research Proposal. , Available from: https://neutrons.ornl.gov/users/proposals (2018).
  48. Accompanying Bio-Deuteration Laboratory Proposal. , Available from: https://www.ornl.gov/sites/default/files/BDL_info_request.docx (2014).
  49. Whitten, A. E., Cai, S., Trewhella, J. MULCh: Modules for the analysis of small-angle neutron contrast variation data from biomolecular assemblies. Journal of Applied Crystallography. 41 (1), 222-226 (2008).
  50. MULCh: ModULes for the Analysis of Contrast Variation Data. , Available from: http://smb-research.smb.usyd.edu.au/NCVWeb/ (2018).
  51. Scattering Length Density Calculator by National Institute of Standards and Technology (NIST) Center for Neutron Research. , Available from: https://www.ncnr.nist.gov/resources/activation/ (2018).
  52. Ibel, K., Stuhrmann, H. B. Comparison of neutron and X-ray scattering of dilute myoglobin solutions. Journal of Molecular Biology. 93 (2), 255-265 (1975).
  53. Holme, T., Arvidson, S., Lindholm, B., Pavlu, B. Enzymes: Laboratory-scale production. Process Biochemistry. 5 (9), 62-66 (1970).
  54. Larsson, G., Enfors, S. -O. Protein release and foaming in Escherichia coli cultures grown in minimal medium. Bioprocess Engineering. 15 (5), 231-237 (1996).
  55. Artero, J. -B., Hartlein, M., McSweeney, S., Timmins, P. A comparison of refined X-ray structures of hydrogenated and perdeuterated rat [gamma]E-crystallin in H2O and D2O. Acta Crystallographica Section D. 61 (11), 1541-1549 (2005).
  56. Paliy, O., Bloor, D., Brockwell, D., Gilbert, P., Barber, J. Improved methods of cultivation and production of deuteriated proteins from E. coli strains grown on fully deuteriated minimal medium. Journal of applied microbiology. 94 (4), 580-586 (2003).
  57. Sivashanmugam, A., et al. Practical protocols for production of very high yields of recombinant proteins using Escherichia coli. Protein Science. 18 (5), 936-948 (2009).
  58. Hoopes, J. T., Elberson, M. A., Preston, R. J., Reddy, P. T., Kelman, Z. Methods in Enzymology. Kelman, Z. 565, Academic Press. 27-44 (2015).
  59. Leiting, B., Marsilio, F., O'Connell, J. F. Predictable deuteration of recombinant proteins expressed in Escherichia coli. Analytical Biochemistry. 265 (2), 351-355 (1998).
  60. Perkins, S. J. Estimation of deuteration levels in whole cells and cellular proteins by 1H n.m.r. spectroscopy and neutron scattering. Biochemical Journal. 199 (1), 163-170 (1981).
  61. Obom, K. M., Magno, A., Cummings, P. J. Operation of a benchtop bioreactor. Journal of Visualized Experiments. (79), e50582(2013).
  62. Duff, A. P., Wilde, K. L., Rekas, A., Lake, V., Holden, P. J. Methods in Enzymology. Kelman, Z. 565, Academic Press. 3-25 (2015).
  63. Haertlein, M., et al. Methods in Enzymology. Kelman, Z. 566, Academic Press. 113-157 (2016).
  64. Meilleur, F., Weiss, K. L., Myles, D. A. A. T Micro and Nano Technologies in Bioanalysis. Methods in Molecular Biology. 544, 281-292 (2009).
  65. Naing, S. -H., Oliver, R. C., Weiss, K. L., Urban, V. S., Lieberman, R. L. Solution structure of an intramembrane aspartyl protease via small angle neutron scattering. Biophysical Journal. 114 (3), 602-608 (2018).
  66. Training Requirements for First Time and Repeat Users. , Available from: https://neutrons.ornl.gov/users (2018).
  67. Remote Analysis Cluster. , Available from: https://analysis.sns.gov (2018).
  68. Franke, D., et al. ATSAS 2.8: A comprehensive data analysis suite for small-angle scattering from macromolecular solutions. Journal of Applied Crystallography. 50 (4), 1212-1225 (2017).
  69. Software Suite. , Available from: https://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html (2018).
  70. Software Individual Programs. , Available from: https://www.embl-hamburg.de/biosaxs/software.html (2018).
  71. Konarev, P. V., Volkov, V. V., Sokolova, A. V., Koch, M. H. J., Svergun, D. I. PRIMUS: A Windows PC-based system for small-angle scattering data analysis. Journal of Applied Crystallography. 36 (5), 1277-1282 (2003).
  72. Jacques, D. A., Trewhella, J. Small-angle scattering for structural biology-Expanding the frontier while avoiding the pitfalls. Protein Science. 19 (4), 642-657 (2010).
  73. Svergun, D. Determination of the regularization parameter in indirect-transform methods using perceptual criteria. Journal of Applied Crystallography. 25 (4), 495-503 (1992).
  74. Putnam, C. D., Hammel, M., Hura, G. L., Tainer, J. A. X-ray solution scattering (SAXS) combined with crystallography and computation: defining accurate macromolecular structures, conformations and assemblies in solution. Quarterly Reviews of Biophysics. 40 (3), 191-285 (2007).
  75. Svergun, D. I., et al. Protein hydration in solution: Experimental observation by x-ray and neutron scattering. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (5), 2267-2272 (1998).
  76. Franke, D., Svergun, D. I. DAMMIF, a program for rapid ab-initio shape determination in small-angle scattering. Journal of Applied Crystallography. 42 (2), 342-346 (2009).
  77. Svergun, D. I. Restoring Low Resolution Structure of Biological Macromolecules from Solution Scattering Using Simulated Annealing. Biophysical Journal. 76 (6), 2879-2886 (1999).
  78. Jacques, D. A., Guss, J. M., Svergun, D. I., Trewhella, J. Publication guidelines for structural modelling of small-angle scattering data from biomolecules in solution. Acta Crystallographica Section D. 68 (6), 620-626 (2012).
  79. Heller, W. T., et al. The Bio-SANS instrument at the High Flux Isotope Reactor of Oak Ridge National Laboratory. Journal of Applied Crystallography. 47 (4), 1238-1246 (2014).
  80. Svergun, D. I., Koch, M. H. J. Small-angle scattering studies of biological macromolecules in solution. Reports on Progress in Physics. 66 (10), 1735(2003).
  81. Johnson, J. L., Kalyoncu, S., Lieberman, R. L. Heterologous Expression of Membrane Proteins: Methods and Protocols. Mus-Veteau, I. , Springer. New York. 281-301 (2016).
  82. Department of Energy Public Access Plan. , Available from: http://energy.gov/downloads/doe-public-access-plan (2018).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

GuinierSANSPyMOL

מאמרים קשורים