ניתוח דינאמי חלבון מתחמי נאסף בנושא ושוחרר מן Biolayer אינטרפרומטריה ביוסנסור באמצעות ספקטרומטר מסה ואלקטרון

Summary

כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי לנטר את הרכבה ופירוק של הרעלן גחלת באמצעות biolayer אינטרפרומטריה (בלי). בעקבות הרכבה/פירוק על פני ביוסנסור, משתחררים את מתחמי חלבון גדולה מפני השטח עבור פריט חזותי וזיהוי של רכיבי מתחמי באמצעות מיקרוסקופ אלקטרוני ו ספקטרומטר מסה, בהתאמה.

Abstract

אין ויוו, חלבונים הם לעתים קרובות חלק מתחמים גדולים macromolecular בו מחייב ירידה לפרטים, dynamics בסופו של דבר להכתיב פלטי פונקציונלי. בעבודה זאת, הרעלן גחלת pre-endosomal מורכבים, מעבר מיגדרי לתוך endosomal מורכבים. ראשית, תחום N-מסוף של ציסטאין מוטציה קטלנית פקטור (אם_N) מחוברת ביוסנסור אינטרפרומטריה (בלי) biolayer דרך דיסולפידי צימוד בכיוון האופטימלי, המאפשר הגנה אנטיגן (PA) prepore לאגד (K_d 1 ננומטר). מכוונת בצורה אופטימלית אם_N-PA_prepore מורכבים ואז נקשר לקולטן מסיסים נימי morphogenic ג'ין-2 (CMG2) תא השטח (K_ד 170 pM), וכתוצאה מכך מתחם טרום-endosomal נציג גחלת, יציב ב- pH 7.5. זהו מתחם שהורכב ואז נענשים acidification (pH 5.0) נציג של הסביבה אנדוזום מאוחר כדי המעבר של הרשות הפלסטינית_prepore למצב נקבובית ממברנה מוכנס. מצב זה של הרשות הפלסטינית_{הנקבוביות} תוצאות איגוד חלשה בין הקולטן CMG2, אם_N-PA את_{הנקבוביות} , דיסוציאציה משמעותי של CMG2 של הנקבובית המעבר. Thio-ההחזקה של אם_N השטח ביוסנסור זה מתהפך בקלות על-ידי dithiothreitol. הפחתת על פני ביוסנסור רבנות בלי משחרר את אם_N-PA_prepore-מתחם ternary CMG2 או החומצה מעבר מיגדרי אם_N-PA_{הנקבוביות} מתחמי microliter כרכים. מתחמי שפורסמו אז דמיינו, מזוהה באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים וספקטרומטר מסה. ניסויים אלה מדגימים כיצד לפקח על פירוק/ההרכבה קינטי של מתחמי חלבון ספציפי באמצעות מתודולוגיות רבנות בלי ללא תווית ולהעריך את המבנה ואת זהותו של רבנות בלי אלה נאספו מתחמי באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים והמסה מסות, בהתאמה, באמצעות הליכים רציף קל-כדי-שכפול.

Introduction

זיהוי והבנה יחודיות המסדירים חלבונים מורכבים הרכבה ויוו הוא עניין קיצוני לחוקרים הביוכימי. חלבון הטרוגנית גדולה הרכבות הם הנורמה ולא היוצא מן הכלל. מושג זה נתמך על ידי ניטור ספקטרוסקופיות ויוו האספה, לבודד את מתחמי באמצעות טכניקות הפרעה תא עדינה, הערכת מוצרים מ שיטות לטיהור המבוסס על זיקה והצגה של אותם באמצעות ברזולוציה גבוהה מיקרוסקופ אלקטרונים קריוגני (הקפאה-EM). כדי להבין את הפקד היחודיות הרכבה בתוך התא, החוקרים חייבים לבודד באופן שגרתי לזהות, בסופו של דבר לאפיין את המבנים דינמי הרכבה/פירוק. הכלי מולקולרית שימוש אינטנסיבי ביותר לזהות את מרכיבי מהרכבות אלה לעתים קרובות דורשת נוגדן מבוססי immunoprecipitation, אשר נשענת על שמירה על יציבות מורכבים במהלך לשבירת תאים. טכניקות אנליטיות בשילוב שונות פותחו לאחרונה כדי ללכוד מתחמי מדגימות תא שימוש בגישות microfluidic מבוסס, כגון משטח פלזמון תהודה (SPR). בעקבות הסרת של משטחים SPR, דגימות אלה נותחו על ידי לייזר בסיוע מטריקס desorption/יינון שעת הטיסה (MALDI-TOF)^1,2. קידום מתודולוגיה זו משתמשת בפרוטוקול קל יאפשר לחוקרים להמחיש ולאמת מתחמי החזוי המתרחשים חצרו הסלולר. מאז SPR היא מערכת מבוססת מיקרופלואידיקה, בעיות לעיתים קרובות נובעים היווצרות צבירה. עקיפת הבעיה דורשת דילול לדוגמה, אשר בתורו, יכול להפחית את תקינות מכלולי ביולוגי עלול הריכוז.

התקדמות יחסית לאחרונה טכנולוגיות ללא תווית היא הפיתוח של מערכת אינטרפרומטריה (בלי)³biolayer. אלה מסוים השתקפות אור מבוססי מערכות שכפל, או עדיף לחקות, איגוד SPR ותוצאות קינטי בכל חלק של עלות^3,4 במיוחד אם ערוץ אחד יחידות משמשות. מתה על מדידת שינויים בדפוסי משתקף הפרעות קלות בין שכבת אסמכתא (בקרה) על פני biolayer (ניסיוני). השינוי שנוצר בשלב נמדד בזמן אמת כמו readout קינטי, תפוקה⁵. פני השטח ביוסנסור, המכיל ספציפי בטקטיקות בדיקות, הביוכימיה, מועבר פיזית בין פתרונות ולא מאגר שינויים על ידי גישות microfluidic ב SPR, למדידה באמצעות גל שלב deflections. העברה המונית אפקטים תימנע מאת לזעזע את הפתרון. בניגוד SPR, מערכות אלו שימושיות למדי בהערכת קומפלקסים של דגימות ביולוגיות גולמי. הפרמטר הפיזי שנמדד במהלך הניסויים רבנות בלי בעיקר תלוי שינוי מסה או עובי על פני השטח ביוסנסור הנובעת הרכבה מורכב חלבון או פירוק.

אלה ביולוגיים סיב אופטי סיבים הם קל לשימוש וזולה יחסית. אחד ההיבטים שימושי המתעוררים של רבנות בלי הוא הסרת נתיישב חלבון שהורכב מתחמי מפני השטח. יישום האחרונות של שיטה זו אפשרה את המעבדה שלנו כדי לבחון את קינטיקה בזמן אמת של pH בקנה מידה גדול המושרה שחלוף חלבון מבנה של הרכיב מגן אנטיגן (PA) של הרעלן גחלת כמו prepore (הרשות הפלסטינית_prepore) לקביעת שלה טופס נקבובית (הרשות הפלסטינית_{הנקבוביות}). מעבר זה בקצה ביוסנסור אומתה באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים (EM)⁶. הסרה של קומפלקסים של משטחים ביוסנסור מונע נפח גדול יותר דילול אפקטים לעתים קרובות שאירעה בעת שחרור קומפלקסים של שבב משטחים בעת שימוש מיקרופלואידיקה מערכות.

בשנת העבודה הנוכחית, גחלת הרעלן מתחמי הם מורכבים, לפרק על פני ביוסנסור ושוחררתי microliter כרכים הרכיבים המורכבים וכתוצאה מכך מאומתות באמצעות orthogonally EM וספקטרומטר מסה (MS).

Protocol

1. הרכבה של קומפלקסים Macromolecular מוגדר על משטחים ביוסנסור אינטרפרומטריה Biolayer (בלי)

1. הרכבה של הרעלן אנתרקס prepore מורכבים על משטח ביוסנסור תגובתי אמין PDEA-השתנה
   1. מימה אמין תגובתי השני דור (AR2G), רבנות בלי ביוסנסור עצה ב 250 µL של מים במשך עשר דקות.
   2. התוכנית שלב זמני, המפורטים טבלה 1, על תוכנת השליטה היחידה רבנות בלי (ראה טבלה של חומרים).
   3. להתחיל את רבנות בלי לרוץ במועט הטיפ ביוסנסור במים µL 250 למשך 30 s כדי למדוד את התוכנית הבסיסית הראשונית של ביוסנסור עובי וצפיפות.
   4. להפעיל את החיישן במועט הטיפ לתוך µL 250 מ מ 50 NHS (N-hydroxysuccinimide) ו-200 מ מ EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)) במשך שבע דקות.
   5. לטבול את החיישן שהופעל ב 50 מ מ PDEA (מומס מאגר בוראט 0.1 M (pH 8.5) למשך 5 דקות ליצור משטח תיול-תגובתי שהופעל על 2-(2-pyridinyldithio)ethanamine).
   6. לטבול את החיישן שהופעל תיול-תגובתי לתוך µL 250 של פתרון המכיל 100 ננומטר E126C אם_N ב- 10 מ מ סודיום אצטט pH 5.0, 100 מ מ NaCl, מאגר למשך 5 דקות.
   7. לטבול את הטיפ אם_N ב- 50 מ מ L-ציסטאין, 1 M NaCl, 0.1 M סודיום אצטט, pH 5.0, 4 דקות, כדי להרוות את כל שאר תגובתי חינם תיול-תגובתי קבוצות.
   8. לטבול את הטיפ אם_N quenched ב 50 מ מ. טריס, 50 מ מ NaCl למשך 2 דקות להקים מאגר בסיסית.
   9. לטבול את הטיפ אם_N quenched לתוך prepore אנטיגן מגן 0.5 מיקרומטר (הרשות הפלסטינית_prepore), 50 מ מ. טריס, 50 מ מ NaCl למשך 5 דקות כדי ליצור את אם_N-PA_prepore מורכבות.
   10. פעם אחת קשורה הרשות הפלסטינית_prepore , להסיר את הטיפ של הפתרון_prepore הרשות הפלסטינית, לטבול את הטיפ לתוך 50 מ מ. טריס, 50 מ מ NaCl למשך 30 שניות לשטוף את כל הרשות הפלסטינית מאוגד הלא ספציפית_prepore.
   11. לטבול את אם_N-PA_prepore מורכבים לתוך 0.5 מיקרומטר קולטן CMG2 (ללא התחום transmembrane), 50 מ מ. טריס, 50 מ מ NaCl, למשך 5 דקות.
   12. לטבול אם_N-PA_{prepore -}CMG2 מורכבים לתוך 50 מ"מ טריס, 50 מ מ NaCl למשך 30 שניות כדי לשטוף את כל CMG2 לא מאוגד לטופס pre-endosomal מתחם.
   13. לניתוח EM, לשחרר את אם_N-PA_prepore-CMG2 מורכבים מהקצה ביוסנסור במועט הטיפ לתוך µL 5 של 50 מ מ DTT, 50 מ מ. טריס, 50 מ מ NaCl, בתוך צינור ה-PCR.
   14. לניתוח טנדם MS של פפטידים מהמתחם, לשחרר את אם_N-PA_prepore-CMG2 מורכבים מהקצה ביוסנסור במועט את החיישן לתוך 5 µL 50 מ מ DTT, 6 מ' צינור GuHCl (ללא קרטין,) 25 מ מ אמוניום ביקרבונט pH 8.0 בתוך ה-PCR . זה מתבצע על ביוסנסור שונה מזו המשמש לניתוח EM.
2. הרכבה של רעלן גחלת נקבוביות מורכבים על השטח ביוסנסור תגובתי אמין PDEA-השתנה
   1. כדי להציג את המתחם לאחר המעבר המיגדרי pH, לבצע צעדים 1.1.1-1.1.12 בסעיף הקודם כדי ליצור את אם_N-PA_prepore-מתחם CMG2.
   2. לטבול את הטיפ ביוסנסור לתוך אצטט 10 מ מ pH 5.0 למשך 5 דקות ליזום את המעבר של הרשות הפלסטינית_prepore למעבר_{הנקבוביות} הרשות הפלסטינית. מעבר זה מסומן על ידי הגדלת משרעת (כ 0.2 ננומטר) ולאחריו ירידה משרעת גדולה יותר כך המשוערות להיות דיסוציאציה קולטן משמעותי או מלא בשל פחת זיקה מחייבת.
   3. לטבול אם_N-PA_{הנקבוביות} עצה ב- 50 מ"מ טריס, 50 מ מ NaCl, pH 8.0, במשך 30 שניות לשטוף את מאגר חומצי.
   4. עבור המדגם ניתוח EM, לטבול את הטיפ ביוסנסור לתוך פתרון המכיל הקזאין 1.25 מ"מ (2.5 מ"מ MSP1D1, 25 מ מ נה-cholate, מ מ 162.5 POPC) למשך 5 דקות למנוע צבירת בפתרון לאחר הפרסום דיסולפידי.
   5. לניתוח EM, שחרור אם_N-PA_{נקבובית -}מיצלה מורכבים מהקצה ביוסנסור במועט הטיפ לתוך µL 5 של 50 מ מ DTT, 50 מ מ. טריס, 50 מ מ NaCl בתוך צינור ה-PCR.
   6. עבור ניתוח MS טנדם פפטידים מן המתחם, לשחרר את אם_N-PA_הסוס מורכבים (אין מיצלה) מ החיישן עצה במועט את החיישן לתוך 5 µL 50 מ מ DTT, 6 מ' GuHCl (ללא קרטין,) 25 מ מ אמוניום ביקרבונט pH 8.0 בתוך ה-PCR שפופרת. זה מתבצע על ביוסנסור שונה מזו המשמש לניתוח EM.

2. להמחיש ואימות שוחרר הרכבות Macromolecular של רבנות בלי ביולוגיים על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים כתם שלילי

1. זוהר פרוק רשת Cu 300 מצופים פחמן. זוהר טיפוסי פריקה הגדרות הן 0.38 mBar אטמוספירה יציבה לחץ שלילי mAmps 15, 20 שניות, ואז אוורור עם אוויר.
2. רשת מאובטחת בין זוג מלקחיים נקי.
3. פיפטה µL 4 מדגם מורכבים שפורסמו ב- PCR צינור אל הרשת ומאפשרים ספיחה של שנות השישים.
4. לפתיל משם שנותרו נוזלי עם טריז נייר סינון.
5. כתם הרשת על-ידי pipetting 5 µL של 0.75% מיקרון 0.02 נקודות מסונן uranyl formate ו הפתילה הכתם עודף משם לאחר 5 שניות. לאפשר רשת לייבוש בטמפרטורת החדר.
6. תצוגה צבעונית מדגם רשתות באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים.

3. זיהוי של מלאה טרום-endosomal אנתרקס הרעלן מורכבים (אם_N-Pa_prepore-CMG2), מעבר מיגדרי מורכבים (אם_N-Pa_{הנקבוביות} ללא CMG2) באמצעות ספקטרומטר מסה.

1. לדלל דגימות שפורסמו 20 µL, תקופת דגירה של שעה.
2. הוסף µL 2 iodoacetamide 55 מ מ, 25 מ מ אמוניום ביקרבונט, pH 8.0, ולאחר תקופת דגירה של שעה בטמפרטורת החדר בחושך (מכוסה ברדיד אלומיניום).
3. לדלל את הדגימה עם 100 µL של 25 מ מ אמוניום ביקרבונט, pH 8.0, כדי להפחית את ריכוז הידרוכלוריד guanidine מתחת 1 מ'.
4. מוסיפים 5 µL של רצף כיתה ששינה טריפסין-20 ng/µL, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
5. להוסיף חומצה אצטית בריכוז 5% כדי להפחית את רמת ה-pH ל הסופי < 3, ואז להפחית את נפח כדי µL 10 במיכשור.
6. העבר את הפתרון פפטיד לשולחן ההנהלה הדגימה על תעשיה של uHPLC 1200 nLC.
7. לטעון µL 5 הפתרון פפטיד על עמודה שלב הפוכה uHPLC רכוב על הבמה יינון של MS.
8. רחץ עמודה עם 15 µL 0.1% חומצה פורמית בקצב מרבי של 5 ממוצעL/min ו/או לחץ מרבי של 800 psi.
9. Elute פפטידים מן העמודה סי18 הפוך-פאזי בספיקה של nL 350/דקה על פני תקופה 90 דקות שימוש הדרגתי לינאל של 5% עד 40% של הממס B ב- A + B (חומצה פורמית 0.1% ת הממס; הממס ב': 95% acetonitrile עם 0.1% חומצה פורמית).
10. לנתח פפטידים eluting על קו באמצעות טנדם MS.
    1. קבע את מקור יינון וולט 2500, יון טמפרטורה העברת ל 250 מעלות צלזיוס.
    2. לנתח את ספקטרומטר מסה תחת בקרה אוטומטית כדי לבצע סריקה MS באופן רציף אחד ואחריו טנדם רבים MSMS ככל האפשר תוך תקופה s 3, באמצעות CID ואנרגיה התנגשות המנורמל של 35.
11. לזהות מרכיבים פפטיד, חלבון תוך שימוש בשיטות הרגילות. לעבודה זו, בוצעו שתי ערכות של פפטיד וניתוח חלבון.

Results

היכולת לפקח ולאמת ההרכבה של מתחמים גדולים macromolecular היא צעד מכריע לקראת הבנה של ירידה לפרטים והפונקציונליות של מכלולים גדולים למערכות ביולוגיות. התוצאות מהשיטות שהוצגו במסמך זה להפגין הקלות אשר מתחמי חלבון גדול (> 150 kDa המוני) יכולים להיות מורכבים באמצעות אינטרפרומטריה biolayer, כל זאת תוך מעקב אחר קינטיקה של משרעת של הרכבה. טיבה קומפקטי של פני השטח ביוסנסור מאפשר ניתוח מכלול להתרחב על ידי שחרור מתחמי התאספו לתוך microvolumes קטן. אלה microvolumes יכול לשמש כדי להמחיש את המבנה הפיזי הראשוני של מתחמי באמצעות EM וכדי לאמת את הזהות של הרכיבים המורכבים באמצעות MS. סקירה סכמטי של התהליך הזה מוצג באיור1.

רכיב מפתח עבור הרכבה מוצלח ו אימות של מתחם macromolecular על פני השטח ביוסנסור כרוך הכיוון הנכון של החלבון זרע הראשונית. פעולה זו מבטיחה כי האתרים אינטראקציית חלבון-חלבון הם נגישים, לא sterically חסומים, והוצבו בצורה אופטימלית מהמשטח ביוסנסור. כפי שמוצג באיור2, הכיוון הנכון של הרעלן גחלת מורכבים מושגת באמצעות קטע N-מסוף מהונדסים במיוחד של גורם קטלני (אם_N) אז תמיד ממוקם אתר איגוד_prepore אם_N-PA ההפך של^6,7באתר המצורף קוולנטיות ביוסנסור. הצטברות עוקבות של המתחם עם קשירה של הרשות הפלסטינית החיישן אם_N רבנות בלי ואחריו מסיסים CMG2 מחייב את הרשות הפלסטינית יוצרת בסופו של רעלן גחלת המוסמכת רוברטסונית מורכבים.

המעקב אחר sensogram של רבנות בלי הוא קריאה בזמן אמת מתוך השינויים משרעת בשל תוספת ספציפית של הרכיבים הרעלן גחלת בעת הוספתן על גבי החיישן. איור 3 מראה שעקבות נציג לזווג עם דגם של המתחם חזה לטופס זה שלב בתהליך. העלייה הראשונה היא אם_N על הטיפ. לאחר שכבתה בסיסית, הרשות הפלסטינית_prepore ואז נקשר אם_N ואחריו התוספת של הקולטן CMG2 מסיסים וכתוצאה מכך המתחם שהורכב pre-endosomal של הרשות הפלסטינית - אם_Nprepore-CMG2. להתקדם לעבר הסביבה אנדוזום מאוחר, המתחם כולו נענשים דופק pH נמוך (pH 5.0) אשר מחליש את קולטן איגוד, ומאפשר את prepore כדי המעבר שלה קונפורמציה נקבובית מורחבת ממברנה מוכנס. ⁶ Sensogram עקבות הצעד acidification מוצגים באיור4. הגידול הראשוני או "ספייק" משרעת הוא כנראה סיומת נקבובית⁶ חייב להתרחש לפני הירידה האיגוד הקולטן CMG2. הירידה משרעת גדולה יותר היא ככל הנראה דיסוציאציה קולטן משמעותי או מלא בשל זיקה מחייבת מופחתת. העבודות הקודמות במעבדה הצביעו CMG2 מחייב מורחב במלואו הרשות הפלסטינית_{הנקבוביות} הוא זניח לעומת האינטראקציה_prepore ⁶CMG2-PA. בנוסף, הסימן sensogram קינטי, הנהוגות בכל sensograms של הרשות הפלסטינית - אם_Nprepore-מעברים CMG2 אם_N-PA_{הנקבוביות} עם ירידה pH, נגמר לשחזור פועל מרובים.

לפני ואחרי acidification, מתחמי ביוסנסור מצורף משתחררים בקלות עבור ויזואליזציה מאת כתם שלילי EM וזיהוי על ידי MS (איור 5). מתחמי נציג את התוצאות EM מוצגים באיור 6. רשתות דוגמת Pre-endosomal, להראות צפיפויות בקנה אחד עם מתחמי ternary שלם המורכב אם_N-PA_prepore-CMG2. פוסט-acidification רשתות מורכבות, להראות הרשות לקביעת הנקבוביות, solubilized על-ידי הכללתם מיצלה אין צפיפות CMG2 ברור.

זהותם של קדם ואת מתחמי acidification שלאחר אומתו על ידי MS. מסד נתונים שבו הרצפים של הרשות הפלסטינית, P13423; אם_N, P15917; CMG2, P58335 שהיו כלולים ברקע של מסד נתונים חלבונים העכבר נגזר מהמאגר NCBInr. רק את החלבונים של עניין, התקבלו חיפוש במסד הנתונים הראשון זה, עם כיסוי חומצת אמינו הבאים עבור מתחמי ternary ו בינארי: 54%, 22% עבור הרשות הפלסטינית, 36% ו 6% עבור אם ו- 43% עבור CMG2, בהתאמה (CMG2 לא זוהה על המתחם בינארי). על מנת למקסם את הכיסוי חומצת אמינו חלבון, מזהה/אלקטרופיזיולוגיה השני התבצע בעזרת חלבון מסד נתונים המכיל רק את החלבונים שלושה עניין. Pre-endosomal MS דגימות הכיל פפטידים של כל הרכיבים הרעלן שלושה עם 60.46%, 67.97% 54.15% כיסוי עבור אם_N, הרשות הפלסטינית CMG2, בהתאמה (איור 7). פוסט-endosomal תוצאות, המוצגת באיור 8, הכיל רק פפטידים אם_N ו הרשות הפלסטינית (כיסוי 57.41% ל- 67.79%, בהתאמה). חוסר CMG2 הדגימות פוסט-endosomal עקביים עם הירידה nm רבנות בלי נצפתה במהלך היווצרות הנקבובית.

איור 1. סקירה סכמטית לניתוח של מתחמי חלבון על ו מבודד ביוסנסור רבנות בלי שימוש EM וגב' אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 2- ביוסנסור הפעלה: הצעד הראשון הרכבה ספציפיות התמצאות על רבנות בלי ביוסנסור. התחום גורם קטלני E126C N-מסוף, (אם_N) מקושר באמצעות יצירת ממשק_prepore מחייב כראוי orientated של הרשות הפלסטינית הצמדה thio. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 3- פיקוח על גחלת הרעלן הרכבה ופירוק עם רבנות בלי: sensogram מציגה שינויים משרעת כפונקציה של הזמן בשל תוספת ספציפית של האנטרקס הרעלן רכיבים בעת הוספתן על גבי החיישן מתחילה עם טעינת אם_N (שלב 4 ב טבלה 1). הרשות הפלסטינית_prepore טעון ואז על גבי המשטח ואחריו התוספת של הקולטן CMG2 מסיסים. המתחם שהורכב pre-endosomal מורכב אם-PA_prepore- CMG2. להתקדם לעבר הסביבה אנדוזום מאוחר, להרכיב כל גחלת פונקציונלי הרעלן הוא נתון דופק pH נמוך (pH 5.0) אשר מחליש את קולטן איגוד, ומאפשר את prepore כדי המעבר שלה קונפורמציה נקבובית מורחבת ממברנה מוכנס. חשיפה של קרום פורש נקבובית אישר, solubilized על ידי תוספת של הקזאין. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 4. מתה על sensogram של שחרור CMG2: עקבות הצעד acidification להראות עלייה ראשונית או "ספייק" משרעת ולאחריו ירידה משרעת גדולה יותר שסביר הנקבוביות היווצרות של קולטן דיסוציאציה, בהתאמה. קווים אנכיים אדום מנוקד מציינות התחלה של צעד חדש. Sensograms מיושרים על מודגש המנוקד קו אדום. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 5. ב ו ניתוח מתחמי חלבון מבודד ביוסנסור רבנות בלי שימוש EM ו- MS: ביוסנסור מתחמי המצורפת משתחררים בקלות אל µL 5 מאגר המכיל DTT ויזואליזציה מאת כתם שלילי EM וזיהוי על ידי גב' אנא לחץ כאן כדי הצג גרסה גדולה יותר של הדמות הזו.

איור 6- ויזואליזציה של מתחמי חלבון עם EM: רשתות דוגמת Pre-endosomal, להראות צפיפויות בקנה אחד עם מתחמי ternary שלם המורכב אם_N-PA_prepore-CMG2. רשתות מורכבות פוסט-endosomal, להראות הרשות לקביעת הנקבוביות, solubilized על ידי מיצלה עם אין צפיפות CMG2 ברור. דגמים של מתחמי החזוי (בצד שמאל) נמצאים באותו הסולם כמו חלקיקים בודדים המוצג. חלקיקים שנצבעו החזוי חלבון (בהתבסס על הגודל של צפיפות EM) מוצגים להלן כל חלקיק. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 7. אימות של מתחמי חלבון עם MS: Pre-endosomal MS דגימות הכיל פפטידים של כל הרכיבים הרעלן שלושה עם 60.46%, 67.97% 54.15% כיסוי עבור אם_N, הרשות הפלסטינית CMG2, בהתאמה. פפטידים זוהה שיעור גילוי שקר (פד) שווה או גבוה מ-5% שמוצג צהוב, פד ר שווה או גבוהה מ- % 1 מוצגים בירוק. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 8. אימות של מתחמי חלבון עם MS: פוסט-endosomal פפטידים דגימות הכיל אם_N ו הרשות הפלסטינית (כיסוי 57.41% ל- 67.79%, בהתאמה), אך לא CMG2. רוזוולט שווה או גבוה מ-5% שמוצג צהוב, פד ר שווה או גבוהה מ- % 1 מוצגים בירוק. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

שלב	הזמן (s)	תיאור
1	30	התוכנית הבסיסית הראשונית
2	420	הפעלה
3	300	הפעלה
4	300	אםN טעינה
5	240	ציסטאין כבאות
6	120	תוכנית בסיסית
7	300	הרשות הפלסטיניתprepore האגודה
8	30	תוכנית בסיסית
9	300	עמותת CMG2
10	30	תוכנית בסיסית
11	300	המעבר חומצה
12	30	תוכנית בסיסית
13	300	מיצלה האגודה

טבלה 1- שלב זמני עבור יחיד רבנות בלי נוסעות הרכבה גחלת הרעלן מורכבים. שימו לב כי תוכניות בסיסיות משמשים כדי לשטוף את החלבון לא מאוגד מהשלב הקודם ו/או להקים קו בסיס מאגר חדש.

Discussion

ההדגמה ממחיש כיצד היווצרות מורכבות macromolecular ניתן בקלות לנטר שימוש אינטרפרומטריה biolayer, visualized באמצעות EM, ואומתו עם MS, כולם עם microvolumes בפרק זמן קצר. מתחמי שנצפה בצע את התחזיות רלוונטי מבחינה ביולוגית, אימות נוסף מתודולוגיה זו משולב והאסיפה מבנית. כפי שצוין במקטע תוצאות, רכיב המפתח להצלחה הרכבה דורש ציסטאין מהונדס בצורה רציונלית מוטגנזה מכוונת כדי להבטיח כי הממשקים חלבון מורכב כהלכה אוריינטציה מהמשטח ביוסנסור.

מערכות קודמות יש להשתמש בטכניקות רבנות בלי ו- MS כדי להעריך חלבון מחייב של שניים או שלושה מערכות רכיבים, כמו גם שלמות של קולטן איגוד של ביטוי חלבון, אבל, בשני המקרים, השיטות פותחו לא לנצל טנדם EM/MS הגישה^8,9. רק אחרים אינטרפרומטריה מערכת בשילוב ניתוח MS כדי לסייע לאפיין את האינטראקציות היה כפול-קיטוב אינטרפרומטריה¹⁰ למרבה הצער, מערכת זו היא כבר לא זמין לשימוש כללי. כאמור במבוא, היו מספר מחקרים שהושלמו איפה הדגימות היו שהוקמה על משטחים כמו SPR ביוסנסור והוסרו מניתוח MS. אף אחת הדוגמאות האלה גרמו מתחמי visualized באמצעות EM.

המגבלות של רציפים בשיטה זו יכולים להיות רבים אבל פתיר. כדי להפוך את הנייח הראשוני ולכן קרן שלב של ההרכבה, חוסר הידע של משטחים אינטראקציה מבניים בהחלט לעכב התקדמות המשויך פיקוח על שלבי ההרכבה הראשונית. חוסר מידע מבנה ניתן לטפל על-ידי עיצוב תעשייתי של קרן לבנות איפה מצורף בדיקות, הביוכימיה (למשל sulfhydryl moiety דיסולפידי קישורים / שלו מתויג מיצוב) ניתן להעביר אזורים שונים בתוך תוכו מערכת הרכבה. במקרה של הרעלן גחלת מורכבים, זה היה מזל כי המבנה של אם_N מאוגדים הרשות הפלסטינית_prepore הוא זמין¹¹. מיקום רציונלית ציסטאין מהונדסים מקומי אזורי ', מהפנים איגוד '_prepore ' הרשות הפלסטינית. עם בדיקות, הביוכימיה הצמדה ציסטאין, עדיף כי אין cysteines תגובתי אחרים נמצאים על פני חלבון.

יש בדיקות שונות מצורף, הביוכימיה אשר יכול לשמש כדי להנדס מצורפים מסוים באתר על המשטחים של חלבון. אחד הקבצים המצורפים ספציפי הפופולרי ביותר כרוך מיצוב של ביוטין moiety במיקום מוגדר באופן ספציפי על פני שטח חלבון¹². למרבה הצער, ביוטין איגוד streptavidin או אבידין מצופה משטחים די הדוק. היפוך של אינטראקציה הכריכה אינה פשוטה. השימוש מהונדסים שלו-תג-או C-אמיני וקלות עוקבות של קובץ מצורף משטחים Ni-נ הוא יישום אוניברסלי יותר של זיקה הנייח. כמובן, אחד ההליכים לאתרים המצורפים הרכבה הנדסה במערכות שלו מתויג היא הדרישה טרמיני N ו- C של החלבון הרכבה הליבה להישאר חשוף ומופרדים כך הקובץ המצורף הוא קל. כמו עם כל מכלול התהליכים, הממשק האינטראקציה של החלבון הרכבה הליבה חייבת להישאר זמין בהמשך מכלול מורכבים.

אולי החשש הנפוצה ביותר של שימוש ביוסנסור בדיקות משטח, הביוכימיה הוא מחייב שאינם ספציפיים. טיפים Streptavidin לעיתים קרובות מקור של אפקטים משמעותיים שאינם ספציפיים מחייב. דיסולפידי מקושרים ביוטין יכול לשמש כדי לשחרר את מתחמי ספציפית מאוד להשאיר מאחור את הצמדה S-ביוטין מופחתת הלחוצים streptavidin קיבוע ביולוגיים¹³. ישנם אחרים בדיקות הפיך, הביוכימיה הופכים זמינים כגון iminoboronates ו- ketoamide במידה פחותה¹⁴. שדה זה הוא כרגע לא מפותח, אבל יש ריביות גבוהות בפיתוח נוסף הפיך קוולנטיות פרוטוקולים כדי למנוע תופעות רעילות התרופה את המטרה המלוות נפוץ השימוש של פיתוח תרופות יישוב קוולנטיות.

הגבלה של שימוש EM כדי להמחיש מתחמי היא פרשנות, במיוחד במקרים שבו המבנים של מתחמי שהורכב לא בתחילה ידועים. ניתן לזהות את המיקום המרחבי של רכיבים בתוך קומפלקס macromolecular התאספו לא מוגדר באמצעות נוגדנים חד-שבטיים (mAb) כסמני קינטי ומבניים ספציפיים. לדוגמה, ברגע זה נוצר קומפלקס, נוגדנים חד-שבטיים יכולים להתווסף זה לאגד רכיבים ספציפיים. בשיטה זו נעשה שימוש תכוף כדי לזהות רכיבים ספציפיים בתוך מכלולים גדולים¹⁵ב EM. מגבלה נוספת קשורה לגודל של המתחם, אמנם היו מקרים שבו מוגדר סימטרי הרכבות קטנה כפי kDa 70 (GroES heptamer) הם בקלות נפתר באמצעות שלילי הכתם EM מתחמים מורכבים הם נותחו על ידי EM בדרך כלל בטווח גודל של ~ 100 Å בקוטר ומעלה. לאחרונה אולם, חלבונים קטן כמו 20 kDa כבר נפתרה, ברזולוציה נמוכה מבנים הושגו בעת שימוש מעולה מכתים מתודולוגיות¹⁶.

לניתוח MS, רגישות מוגברת מכשור MS הנוכחי עד לרמת femtomolar (attomoles) יכול במקרים מסוימים להגביר את הרגישות של רבנות בלי זיהוי. . זה מאוד מתקבל על הדעת כי אותות חלבון להראות עלייה amplitudes מינימלית אבל הדיר תגרום זיהוי של החלבון המדובר. בנוסף, חיטוט אינטראקציות חלבון-חלבון עם אחד מבני הזוג המחובר את החיישן והשני וחשש הסלולר בתוקף תגרום טיהור וזיהוי לאחר מכן קל של המתחם שהוקם. מגבלה אחת עלולים להיות שנצפו עם מערכות MS מאוד רגיש הנוכחי הוא החלבון של עניין ייתכן במסד הנתונים, אבל התבוננות זו היא נדירה (למשל, proteomes של מינים נדירים). אם הרצף של החלבונים עניין ידועים, בעיה זו נפתרה בקלות על ידי הכללת את רצף חומצות אמיניות protein(s) רקע חלבון מסד נתונים (כמתואר בעבודה זו במקטע לפרוטוקול). הגבלת פוטנציאל אחר התוצאות מתודולוגיה מן ההתנגדות של חלבון כדי trypsinolysis. טריפסין העיכול היא בדרך כלל שיטת ברירת המחדל עבור התחתון למעלה זיהוי חלבונים. עם זאת, חלבונים יכול להיות עמידים בפני טריפסין אם חסר להם שאריות Arg, ליס או גישה משקעים אלה מוגבלים על ידי המבנה מקופל. מגבלות אלה נפתרות, בהתאמה, באמצעות אלטרנטיבית או שילוב של פרוטאזות או כולל של ריאגנט התגלגלות (אוריאה או guanidine HCl, כפי שמעידה 1.1.14 ו 1.2.6) לפני עיכול אנזימטי.

הרחבות אפשריות של מתודולוגיה זו כוללים המאפשר למשתמש לעקוב ולזהות מכלולי הרכבה הסלולר מ lysates תאית גסה. מתברר בדיקות עבור מכלול הרכיבים השונים תמציות מרוכז הסלולר הוא קל לביצוע באמצעות ההליכים אינטרפרומטריה biolayer. בניגוד מתודולוגיות microfluidic הנפוצות מבוסס אשר נוטה סתימת רגישים צבירה, הגישה רבנות בלי יכול לשמש ישירות לטבול biolayer חיישן טיפים לתוך תמציות גולמי להרכיב באופן פוטנציאלי את מתחמי ספציפיים, ישירות אלה מרוכזים דגימות טהורות. ברגע התכנסה, זה ריאלי לחלוטין לשימוש הגששים נוגדן ספציפי מעקב המערכת רבנות בלי לזהות, אפילו quantitate חשד רכיבי תמציות הסלולר שזוהו באמצעות שיטת microvolume MS. שוב, המפתח כאן היא שימוש מוגדר, אוריינטציה כראוי ליבה חלבונים כמו אחווה מסוימות רגשים.

היכולת להציג את prepore כדי הנקבוביות תהליך המעבר kinetically עם רבנות בלי יהיה מאוד שימושי לזיהוי פוטנציאל "נוגד רעל" מעכבי מולקולה קטנה של המעברים חלבון ספציפי לתפקד תחת מאוחר endosomal, pH נמוך (5.0) תנאים. זה prepore pH המושרה על הנקבוביות המעבר מעוכבת בנוכחות קיפול מייצב (osmolytes) כגון גליצרול או סוכרוז, משאיל ובכך תמיכה חזקה לפיתוח מייצבים מתקפלים יישוב מסוים למנוע הרשות הפלסטינית היווצרות_{הנקבוביות} . גישה ספציפית זו מונע והחלפת מבחני גולמי מבוססות, איפה ה-pH יורדת להוביל חלבון משקעים. השיטה השנייה, למרות טוב עבור שיטות prescreening הראשית, מובילה לעיתים קרובות תוצאות חיוביות שגויות איפה תרכובות מסוימות לעכב את המצבור במקום המעברים מולקולרית בפועל.

התצפיות במורד הזרם של מבנה וזיהוי של רכיבים מורכבים בודדים בתוך דגימות microvolume קטן יכול להיות שימושי גם אימות פוטנציאל להוביל תרכובות. זה יכול להיות מיושם במקרים מייצב הרכבה ספציפיים או הקשורה איפה התוצאה היעד. גישה מקבילה זו קינטי/מבנה/זיהוי שימושית ישירות המאשרת את תוקפו של עופרת חשד effectors תרכובת של הרכבה ומגישה שלב ההקרנה משנית סביר או גישה תפוקה בינונית.

הקפאה-EM היא טכניקה שימושית ללמוד את הפרטים אטומי של מתחמי מקרומולקולה במצבים שונים של הרכבה. לפני הכנת דוגמאות הקפאה-EM, חשוב לוודא קודם שהכנה מכיל מתחמי הומוגנית למדי טהור עם כתם שלילי EM. העבודה שהוצגו במסמך זה מדגים הרכבה של חלבון תסביכים על רבנות בלי ביוסנסור משטחים, שחרור של אלה מתחמי להמחשת EM, וזיהוי מרכיבים אלה באמצעות MS. מתודולוגיה זו מסוים של הרכבה מבוקרת ושחרור יכול להיות שימושי ביצירת פרוטוקולים מאוד ספציפיים המשפרים את הכנת הדוגמא רציפים הומוגנית על כתם שלילי EM, צעד הכרחי כי חייב להיות הפגינו לפני מתקדמים. הקפאה-EM. כדי לקבל מבנה תלת-ממד ברזולוציה נמוכה, רק 30-50 חלקיקים של המתחם יהיה צורך לבצע סדרה הטיה חרוט (70 תצוגות שונות תמונה דו-ממדית לכל חלקיק) בתנאי שיש גיוון התמצאות (מספר תצוגות שונות).

לגבי שיפור שיטות MS, ההתקדמות רגישות, צמצום נפח דגימה להמשיך לשפר. ננו זורם, כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה במיוחד וכן פיתוח ספקטרומטרים המוני עם חובה מהר מחזור, רגישות מוגברת ופתרון כוח. היכרות האחרונות ספקטרומטר מסה orbitrap, בפרט הגירסה העדכנית ביותר (orbitrap Fusion Lumos, ו היורשת הצפוי Lumos פיוז'ן Orbitrap 1 מ'), כמו גם אלגוריתמים של חיפוש מאוד להקל על תהליך זה.

המתודולוגיה הנוכחי מנטרת את קינטי הרכבה ופירוק של גחלת הרעלן רכיבים באמצעות מתודולוגיות רבנות בלי ללא תווית, ערך את המבנה ואת זהותו של רכיבים אלה באמצעות EM ו- MS, בהתאמה. השימוש של ערוץ אחד פשוט מתה על המערכת יחד עם שלילי מכתים EM ניתוח שגרתי, טכניקות MS יסודי יותר הולם לאפיין תהליך ההרכבה.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
(1-אתיל-3-(3-דימתילאמינפרופיל)קרבודימיד)) (EDC)	Thermo Scientific	22980
(2-(2-pyridinyldithio)ethanamine) (PDEA)	GE Lifesciences	BR100058
0.5 מ"ל מיקרו-שפופרות שחורות	סיגמא-אולדריץ'	Z688304-500EA
1-פלמיטויל-2-אולויל-sn-גליצרו-3-פוספוכולין (POPC)	Avanti	850457C-25mg
שבחים PepMap 50 μ m x 150 מ"מ, C18, 2 μ מ', 100 וארינג;	ThermoFisher Scientific	164561
חומצה אצטית קרחוני	Fisher	A38SL-212
אצטוניטריל	פישר	A955-4
אמין תגובתי דור שני (AR2G) טיפים	Forte Bio	18-5092
אמוניום ביקרבונט	Fisher	A643-500
Anotop 10 מסנן מזרק, 0.02um	GE Lifesciences	6809-1002
BLItz System	Pall Forte Bio	45-5000
חומצה בורית	Fisher Scientific	10043-35-3
נימי מורפוגני Gene-2			מיוצר ומטוהר בבית
מצופה פחמן Cu 300 רשת	מיקרוסקופיה אלקטרונית מדעי	CF300-CU-50
Dithiothreitol (DTT)	GoldBio	DTT25
חומצות פורמיות	JT Baker	0129-01
גואנידין הידרוכלוריד (GuHCl)	סיגמא-אולדריץ'	G4505-100G
יודואצטמיד	MP-BioMedicals, LLC	100-351
JEM-1400 מיקרוסקופ אלקטרונים שידור	JEOL
L-ציסטיין הידרוכלוריד הידראט	סיגמא-אולדריץ'	C121800-5G
גורם קטלני N-terminal domain			חלבון המיוצר ומטוהר בבית
תוכנת MS גרסה 2.2	ThermoFisher Scientific
N-hydroxysuccinimide (NHS)	Sigma-Aldrich	090M14531V
Orbitrap Fusion Lumos	ThermoFisher
PCR צינורות	ThermoFisher Scientific	AB-0620
Pelco easiמערכת ניקוי פריקת זוהר	זוהר טד פלה, בע"מ	91000
אנטיגן מגן prepore			המיוצר ומטוהר בבית
מעגלי נייר סינון איכותיים	פישר סיינטיפיק	09-795C 5
רצף כיתה שונה טריפסין	Promega	V5111
Sequest HT מנוע חיפוש	ThermoFisher Scientific
נתרן אצטט טריהידרט	פישר סיינטיפיק	BP334-500
נתרן כלורי	פישר סיינטיפיק	S271-10
נתרן כולאט	סיגמא-אולדריץ'	C1254-100G
טריס בסיס	פישר סיינטיפיק	BP152-10
אורניל פורמט (UF)	מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית	22450
Xcalibur	ThermoFisher Scientific	OPTON-30487