מאמר שיטה

לדוגמות כימיים בתאי גזע Pluripotent האנושית המקובלת למצב תמים כמו עם העוצמה התמיינות משופרת Multilineage

9.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/57921

⸱

10 ביוני 2018

 ,  ,  , 
1Department of Oncology, Division of Pediatric Oncology and Institute for Cell Engineering, Johns Hopkins School of Medicine

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

אנו מציגים עבור יעיל בתפזורת, מהירה כימי לדוגמות של תאי גזע pluripotent האנושי שושלת היוחסין-איפה זה מונח קונבנציונאלי (hPSC) לתוך מצב של epiblast דמוי pluripotent יציב epigenomically תמים פרוטוקול. שיטה זו התוצאה ביטוי גנים שושלת היוחסין-איפה זה מונח ירד שיפור ניכר תוך בידול multilineage מכוונת על-פני רפרטואר רחב של קווי hPSC המקובלת.

תקציר

נאיבי האדם גזע pluripotent (N-hPSC) עם פונקציונליות משופרת עשוי להיות בעל השפעה רחב של רפואה רגנרטיבית. המטרה של פרוטוקול זה היא לחזור ביעילות את שושלת היוחסין-איפה זה מונח, קונבנציונאלי האנושי גזע pluripotent (hPSC) נשמר בתנאים או ללא מזין או תלויי-מזין כדי pluripotency כמו תמימה עם פונקציונליות משופרת. שיטה זו לדוגמות תמים כימי מעסיקה את לוקמיה קלאסית מעכבות פקטור (LIF), GSK3β, וניגוד MEK/טיפשה קוקטייל (LIF-2i), בתוספת רק מעכב tankyrase XAV939 (LIF-3עכשיו). LIF-3עכשיו חוזרת hPSC המקובלת למצב יציב pluripotent אימוץ הביוכימי, תעתיק, ותכונות epigenetic של epiblast האנושי טרום השרשה. שיטה זו LIF-3עכשיו דורש תא מינימלי תרבות מניפולציה, והוא מאוד לשחזור ב רפרטואר רחב של תאי גזע עובריים אנושיים (hESC) וקווים תאי גזע (hiPSC) ללא transgene האנושי pluripotent המושרה. השיטה LIF-3עכשיו אינה דורשת צעד priming מחדש לפני הבידול; N-hPSC ניתן להבחין ישירות עם יעילות גבוהה מאוד ולתחזק karyotypic, stabilities epigenomic (כולל ב לוקוסים הדומיננטיות). כדי להגביר את האוניברסליות של השיטה, hPSC המקובלת מתורבתים לראשונה בקוקטייל LIF-3עכשיו בתוספת שתי מולקולות קטנות נוספות פלאטין קינאז (forskolin), סוניק הקיפוד (שקט) (purmorphamine) איתות (LIF-5i). שלב ההסתגלות LIF-5i קצר באופן משמעותי משפר הרחבה המשובטים הראשונית של hPSC קונבנציונלי ו המאפשר להם להיות לאחר מכן תמימה-להחזירה עם LIF-3עכשיו לבד בכמויות, ובכך obviating את הצורך subcloning/איסוף נדיר N-hPSC מושבות מאוחר יותר. LIF 5i-מיוצב hPSCs לאחר מכן נשמרים ב- LIF-3עכשיו לבד ללא הצורך של מולקולות אנטי-מוות. והכי חשוב, לדוגמות LIF-3עכשיו משפר בצורה ניכרת את pluripotency תפקודית של רפרטואר רחב של hPSC המקובלת על-ידי הפחתת ביטוי הגנים בשלה שושלת היוחסין שלהם ומוחקת את ההשתנות interline של התמיינות מכוונת בדרך כלל הבחינו בין השורות hPSC עצמאית. אפיוני נציג של LIF-3עכשיו-להחזירה N-hPSC הם שסופקו, ניסיוני אסטרטגיות להשוואות פונקציונלי של isogenic hPSC היוחסין-איפה זה מונח vs. תמים כמו הברית מתוארים.

מבוא

מערכת התרבות 2i (MEK/טיפשה, GSK3β מעכב) פותח במקור כדי לחדד את העכבר מבוסס-סרום הטרוגנית תרבויות בתאי גזע עובריים (mESC) למצב הקרקע אחידה של pluripotency דומה epiblast של העכבר1. עם זאת, 2i אינו תומך קיום אנושי pluripotent תאי גזע (hPSC) קווים2יציבה. מולקולה קטנה מורכבים, שיושלם פקטורי גדילה, השונים, גישות הטרנסגניים דווחו לאחרונה כדי ללכוד putatively דומה pluripotent תמים כמו האדם מולקולרית קובע2. עם זאת, רבים של הברית "תמים כמו" שנוצרו באמצעות שיטות אלה גם הציג יציבות karyotypic, epigenomic פגמים (למשל, גלובל אובדן הורים החתמה גנומית), או לקוי בידול פוטנציאליים.

ב לעומת זאת, את הקוקטייל של דיכוי כימי משולשת של GSK3β, טיפשה, tankyrase איתות, לוקמיה מעכבות פקטור (LIF-3עכשיו) היה מספיק עבור השחזור תמים כמו יציבה של רפרטואר רחב של קווים hPSC קונבנציונלי3. LIF-3עכשיו-להחזירה תמים hPSC (N-hPSC) karyotypes נורמלי ולא מוגברת שלהם ביטויים של גנים ספציפיים תמים epiblast של האדם (e.g.,NANOG, KLF2, NR5A2, DNMT3L, HERVH, סטלה (DPPA3), KLF17 , TFCP2L1). HPSC לדוגמות גם הענקת LIF-3עכשיו עם מערך של הביוכימי המולקולריים מאפיינים ייחודיים ל- pluripotency כמו mESC תמים שכלל מוגברת phosphorylated STAT3 איתות, ירד טיפשה זרחון, CpG 5 העולמית-methylcytosine hypomethylation, demethylation CpG הגנום כולו-תאי גזע עובריים (ESC)-גנים ספציפיים היזמים ושימוש דומיננטי דיסטלי OCT4 משפר. יתר על כן, לעומת אחרים תמים שיטות לדוגמות שתוצאתם aberrantly hypomethylated טבוע לוקוסים גנומית, להחזירה-LIF-3עכשיו N-hPSC היו ללא אובדן שיטתית של דפוסי CpG הדומיננטיות או ההפסד הדי methyltransferase הביטוי (למשל, DNMT1, DNMT3A, DNMT3B)3.

תרבות LIF-3עכשיו ישיר של מגוון רחב של קונבנציונאלי תאי גזע עובריים (hESC), אנושי המושרה גזע pluripotent (hiPSC) גדל על מזינים או E8 מזין ללא תנאים מושגת לדוגמות מהיר ולא בתפזורת מדינה כמו epiblast תמים. עם זאת, לדוגמות תמים LIF-3עכשיו ישיר עשוי להיות בלתי-יעיל כמה שורות hPSC קונבנציונלי לא יציב בגלל variabilities גנומית, שושלת היוחסין-איפה זה מונח הטבועה הנובעים הרקעים התורם מגוונת מבחינה גנטית.

לפיכך, כדי להרחיב את תוכנית השירות של השיטה LIF-3עכשיו, אופטימיזציה stepwise פותחה והיא מוצגת בזאת, מאפשר לדוגמות תמים אוניברסלי עם כמעט כל hESC קונבנציונאלי או קו hiPSC ללא transgene בתרבית על מזינים. שיטה זו לדוגמות תמים universalized מעסיקה צעד ארעי התרבות הראשונית המקובלת hPSC המשלימים את הקוקטייל LIF-3עכשיו עם שני נוספים מולקולות קטנות (LIF-5i) פלאטין קינאז (forskolin) ו- (סוניק הקיפוד, (שקט) purmorphamine) איתות. פסקה אחת הראשונית hPSC המקובלת ב- LIF-5i עצמו אותם עוקבות לדוגמות LIF-3עכשיו יציב בכמויות. הסתגלות LIF-5i הראשונית מגבירה באופן משמעותי התפשטות המשובטים תא בודד הראשונית של hPSC המקובלת גדל על E8 או כדורים אקדחים סטרט (לפני שלהם עוקבות יציב, מתמשך מעבר LIF-3עכשיו לבד). קווים hPSC המקובלת הותאם קודם על פסקה אחת ב- LIF-5i לסבול בצובר עוקבות המשובטים passaging של תאים להחזירה תמים בתנאים LIF-3עכשיו, אשר obviates את הצורך לאסוף, subcloning של המושבות יציב נדיר או השימוש השגרתי מולקולות אנטי-מוות או מעכבי קינאז (רוק) Rho-הקשורים חלבון.

השיטה LIF-3עכשיו כבר מועסקים בהצלחה להרחיב ולתחזק רפרטואר רחב של stably > 30 קווי hPSC המקובלת עצמאי, מגוונת מבחינה גנטית > פסוקים 10 – 30, בשיטות או דיסוציאציה-אנזימטי או אנזימטיות, ללא עדות אינדוקציה של כרומוזומלית או חריגות epigenomic, לרבות ליקויים ב לוקוסים גן הדומיננטיות. בנוסף, תרבות LIF-5i/LIF-3עכשיו סדרתית היא תמימה היחידה לדוגמות השיטה שדווחו עד כה המשפרת את pluripotency תפקודית של רפרטואר רחב של קווי hPSC המקובלת על ידי הפחתת ביטוי הגנים בשלה שושלת היוחסין שלהם, שיפור דרמטי מחוזקה בידול multipotent. LIF-3עכשיו תמים לדוגמות שיטת ומוחק הגלום לבטן השתנות של בידול של קווי hPSC היוחסין-איפה זה מונח, קונבנציונאלי, ויהיה כלי נהדר של היישום ברפואה רגנרטיבית וטיפולים הסלולר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל ההליכים בבעלי חיים בוצעו על פי הנחיות טיפול בבעלי חיים ופרוטוקולים שאושרו על-ידי ג'ונס הופקינס הספר של המכון לרפואה של טיפול בבעלי חיים, שימוש הוועדה (IACUC).

1. הכנה של העכבר מתחלקים Fibroblasts (MEF) תלויי-מזין Conventional (hESC בינוני/MEF) או להחזירה תמימה (LIF-3עכשיו בינוני/MEF) hPSC תרבות

  1. לרכוש או להכין אספקה נמוך-מעבר ללא צורך במיקור חוץ של מאכילי MEF CF1 או CF1 x DR4 היברידית E13.5 העכבר העוברים בעקבות פרוטוקולים שפורסמו4.
    1. Cryopreserve המעבר נמוך (p1-p2) MEF תרבויות קדם (עבור אחסון לטווח ארוך) או הקרנה שלאחר (עבור עד 6 חודשים) בחנות חנקן נוזלי תיאר כאמור4.
    2. להאיר (5,000 ראד) לרשימת תפוצה MEF מורחבת תחת p5 באמצעות γ - או X-ray-בעוצמה, להכין את aliquots ב 1.5 x 106 תאים לכל מבחנה לאחסון לטווח קצר (פחות מ- 6 חודשים) ב-80 מעלות צלזיוס במקפיא טמפרטורה נמוכה במיוחד.
    3. צלחת בין 1.2 x 106 (טרי מוקרן שאינם cryopreserved) 1.5 x 106 (מוקרן cryopreserved) MEF לכל לוח אחד של gelatinized 6-ובכן להכנת מזין תרבויות, כמתואר להלן.
  2. להכין מצופים ג'לטין צלחות שטופלו תרביות רקמה סטרילי 6-טוב על-ידי הוספת 1.5 מ של פתרון סטרילי של ג'לטין 0.1% מכל קידוח בבטיחות הביולוגי ארון.
  3. דגירה צלחות מצופה ג'לטין ב 37 מעלות צלזיוס במשך לפחות שעה או לינה חממה מעבדה CO2 .
  4. ביום הבא, להפשיר נמוכה מעבר (למשל, P2 כדי P4) cryopreserved דימתיל סולפוקסיד ו לקרינה (rad 5,000) MEF לפי השלבים המצוין להלן.
    הערה: MEF שאינו מוקרן צריך גם להיות הקרת, מורחב, וכן מוקרן מייד לפני השימוש.
  5. מקום של aliquot MEF cryopreserved באמבט מים 37 º C. על מפשיר, לעקר את הצינור עם אתנול, מיד לדלל את cryoprotectant דימתיל סולפוקסיד לפחות 10-fold MEF בינונית (טבלה 1) בתוך ארון אבטחה (למשל העברת 1 מ"ל דימתיל סולפוקסיד-MEF aliquot לתוך 9 מ ל MEF במדיום 15 מ"ל סטרילי חרוט).
  6. Centrifuge התאים MEF מדולל ב 200 x גרם במשך 5 דקות צינורות חרוט סטרילי 15 מ"ל.
  7. באבטחה הקבינט, תשאף למחוק את תגובת שיקוע ללא תא ו resuspend בגדר תא במדיום MEF טרי 1 – 2 מ"ל.
  8. לבטל את הפתרון הג'לטין ולהוסיף בעדינות 2 מיליליטר MEF מחדש מושעה במדיום MEF ל כל טוב של צלחת 6-טוב gelatinized, כמצוין לעיל. MEF ספירת תאים וצלחת 1.2 x 106 (טרי מוקרן הלא-cryopreserved) או 1.5 x 106 (מוקרן cryopreserved) MEF לכל אחד צלחת gelatinized 6-. טוב.
    הערה: כל הצלחות התרבות תאים מועברים מן החממה2 CO כדי אבטחה ארון יכול להימחק בעדינות עם נייר ריססה אתנול אך צריך לא להיות ישירות ריססו על 70% אתנול פתרון כדי למנוע הפצת אתנול ב הבארות.
  9. דגירה MEF צלחות ב 37 מעלות צלזיוס לילה בחממה מעבדה CO2 (5% CO2, אווירה לח) כדי לאפשר מצורף, לפני השימוש.

2. ייצוב של תרבויות hPSC המקובלת עוקבות לדוגמות תמים עם צעד הסתגלות קצרה LIF-5i פרירים

  1. אמת כל הקווים hPSC המקובלת על אחזקת קריוטיפ נורמלי על ידי G-banding (פסים), לפני תחילתו LIF-5i/LIF-3עכשיו השחזור.
    הערה: לדוגמות LIF-3עכשיו של קווי גבוה-מעבר hPSC קונבנציונלי (למשל., P > 40 – 50) יש להימנע, מאז תרבויות אלה עשויים כבר הנמל סטיות גנומית זה עשויה להיות השפעה שלילית על השחזור LIF-3עכשיו בתפזורת, יעיל ויציב של טענתי, convetional hPSC קווים.
  2. לתחזק ולהרחיב תרבויות hPSC קונבנציונאלי עם המאומת karyotypes רגיל מערכת מבוססת-MEF תרבות (כמתואר בסעיף 1) או מערכת תרבות נטולת מזין (בהתאם להעדפות של החוקר).
    הערה: שני תלויי-מזין hPSC/MEF cocultures (למשל, hESC בינוני (טבלה 1) בתוספת 4 – 10 ננוגרם למ"ל bFGF) או ללא מזין (למשל., E8 5 או mTSER 6 מדיה (לפי הוראות היצרן שיטות vitronectin מצופה לוחות) תואמים בצובר תמים השחזור באמצעות מערכת LIF-5i/LIF-3עכשיו/MEF (איור 1). שיטות Non-אנזימטי עדיפים passaging של hPSC המקובלת לפני והכנתם השחזור. ניסוחים מדיה LIF-5i ו LIF-3עכשיו מכיל אנטיביוטיקה או סוכני פטריות. כללי פעולה סטנדרטי עקרות ארון אבטחה ותחזוקה צפויים להיות נצפתה בקפדנות כדי למנוע כל זיהום חיידקי או פטרייתי.
  3. עבור MEF-מבוסס מערכת תרבות, להכין MEF מזיני בצלחת 6-ובכן gelatinized כמתואר בסעיף 1 לפחות יום אחד לפני passaging של תרבויות LIF-5i-הותאם hPSC קונבנציונלי.
  4. לאחר hPSC המקובלת תרבויות הגיעו ~ 50% confluency (קרי, 3-5 ימים לאחר ציפוי ראשוני), להחליף את המדיום תרבות hESC רגיל עם LIF-5i בינוני (2 מ"ל לכל טוב; טבלה 1).
    הערה: בצע את הפעולות הבאות באבטחה ארון.
  5. תרבות ולתחזק hPSC קונבנציונאלי/MEF עד 2 ימים ב- LIF-5i בחממה CO2 (5% CO2, אווירה לח). לשנות המדיום LIF-5i מדי יום כדי להתאים אותם מעבר עוקבות, לדוגמות יציב ב- LIF-3עכשיו.
  6. לחלופין, עבור התרבויות נטולת המזין רגיל (למשל, ב- E8), תרבות hPSC ב LIF-5i רק לילה לפני passaging למחרת בבוקר.
    הערה: תרבויות LIF-5i LIF-3עכשיו שניתן שניהם לתחזק את האטמוספירה (21% O2) או חמצן הפיזיולוגיות (5% או2) רמות בחממה CO2 (5% CO2, אווירה לח).
  7. לפני passaging, למקם את הצלחות תרבות בארון אבטחה, לשטוף LIF-5i-הותאם hPSC המקובלת פעם אחת עם PBS, ומוסיפים 1 מ"ל של ריאגנט דיסוציאציה תא מכל קידוח. תקופת דגירה של 5 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס חממה2 CO, triturate בעדינות עם פיפטה להשעיה תא בודד בימים אבטחה בארון.
    הערה: מאגרי דיסוציאציה-אנזימטי לחלופין ניתן להשתמש להכנת תאים בודדים passaging.
  8. לאסוף את התליה תא hESC בינוני (דילול 2-fold לפחות) צינורות חרוט סטרילי 15 מ"ל, triturate בעדינות תאים על-ידי pipetting כדי לקבל השעיה תא בודד.
  9. צנטריפוגה ב x 300 גרם במשך 5 דקות לשאוב/להשליך תגובת שיקוע, resuspend בגדר תא ב- 1-2 מ"ל של המדיום LIF-5i ב אבטחה הקבינט. לספור את התאים באמצעות hemocytometer או מונה הניתן תא אוטומטית.
  10. לשטוף את הצלחת MEF מצופים מראש פעמיים עם PBS (2 מ"ל לכל טוב טוב 6 צלחות) ולהפיץ 1 – 2 x 106 תאים (בינוני 2 מ"ל LIF-5i) על גבי 1 טוב של צלחת MEF מסוידים PBS.
  11. לכוונן ולמטב את צפיפויות ציפוי הראשוני עבור כל קו hPSC בודדים להיות תמים-להחזירה, replating היעילות יכולה להיות משתנה מאוד. מקם את הצלחת חממה2 CO (5% CO2, אווירה לח).
    הערה: השימוש השגרתי נוגדנים anti-מוות לא מומלץ עבור רוב קווי hPSC בשיטה זו. מערכת LIF-5i כבר באופן משמעותי משפר את היעילות מחדש משוריין המשובטים בצובר הראשונית של קווי hPSC קונבנציונלי. עם זאת, שימוש חד פעמי של רוק מעכב (5 – 10 μM Y-27632) עשויה לשפר עוד יותר את ראשוני LIF-5i המשובטים מחדש משוריין היעילות של תרבויות hPSC המקובלת במעבר הראשון עבור כמה שורות hPSC היוחסין-איפה זה מונח לא יציב עם נטיה עבור ספונטנית בידול.
  12. אם החל מתרבויות נטולת מזין (למשל, E8), ישירות מעביר אחד טוב של hPSC המקובלת dissociated הותאם ב LIF-5i לתוך אחד מוקרן מצופה MEF טוב (כלומר, מעבר 1:1).
  13. למחרת, מערבולת בעדינות את הצלחת כדי להרים את כל התאים שאינם מצורפים, תשאף המדיום (שטיפת PBS היא אופציונלית) ולהחליף עם 2 מיליליטר LIF-5i בינוני. לבצע שלב זה אבטחה בארון מדי יום למשך 3-5 ימים או עד תאים הם 60-70% confluent (איור 1). מקם את הצלחת חממה2 CO (5% CO2, אווירה לח).

3. לטווח ארוך תחזוקה והרחבה של N-hPSC במדיום LIF-3עכשיו

  1. בעקבות הסתגלות LIF-5i הראשונית, המעבר עוקבות תרבויות LIF-3עכשיו יציבה כל 3-4 ימים של אבטחה בארון, או כאשר תרבויות הופכים 60-70% confluent (איור 1).
    הערה: תרבויות LIF-3עכשיו דורשים תחזוקה קפדני, ומאפשר N-hPSC תרבויות להגיע צפיפות גבוהה confluency תא מתרבות ממושך (למשל., > 4 ימים) מקטין את יעילות מחדש משוריין המשובטים עוקבות, ומקדם ספונטנית בידול.
  2. באבטחה הקבינט, למחוק את המדיום תרבות ולשטוף כל טוב של תרבויות LIF-5i/LIF-3עכשיו על-ידי הוספת בעדינות 2 מ"ל ל- PBS. למחוק PBS ולהוסיף 1 מ"ל של פתרון ניתוק התא. תקופת דגירה של 5 דקות ב 37 ° C ב- CO2 מיכלים (5% CO2, אווירה לח).
  3. לאסוף את התליה תא, להוסיף hESC בינוני (ללא מעכבי או גורמי גדילה (טבלה 1); 2-fold לפחות דילול) כדי לשחזר את כל hPSC בעדינות triturate תאים על-ידי pipetting כדי לקבל השעיה תא בודד. להעביר את המתלים צינור חרוטי סטרילי 15 מ"ל.
  4. צנטריפוגה-300 גרם במשך 5 דקות, וביופסיה/הסר תגובת שיקוע. מחדש להשעות בגדר תא במדיום LIF-3עכשיו. לספור את התאים באמצעות hemocytometer או מונה הניתן תא אוטומטית.
  5. צלחת ~ 2 x 105 תאים לכל טוב על גבי MEF לקרינה בצלחת 6-ובכן gelatinized עבור passaging שגרתית של תרבויות LIF-3עכשיו. על התרבויות LIF-5i-הותאם הראשונית, צלחת עם צפיפות גבוהה יותר בתחילה (4 x 105 תאים/טוב) לפני המעבר הראשון לתוך LIF-3עכשיו/MEF.
  6. לוחית רישוי מחדש ולהפיץ LIF-5i-הותאם hPSC על גבי טריים מסוידים PBS לקרינה MEF מזין הצלחות (להכין ביום הקודם כאמור לעיל) המדיום LIF-3עכשיו. החלף את המדיום LIF-3עכשיו מדי יום.
  7. מעבר N-hPSC עבור פחות בצובר רציף 4 – 7 פסוקים המנזר בינוני LIF-3עכשיו לשימוש של N-hPSC מחקרים תפקודית או הקפאה קריוגנית. לרשום את מספר קטעים של N-hPSC גם קונבנציונאלי או מדיה LIF-3עכשיו.
    הערה: לדוגמות LIF-3עכשיו גבוהה-מעבר (למשל > p40) קווי היוחסין-איפה זה מונח, המקובלת hPSC אינו מומלץ. מאמץ צריכה להיעשות כדי לחזור hPSC המקובלת קווי המעבר אפשרי הנמוך ביותר כי הם זמינים. בנוסף, השימוש hPSC LIF-3עכשיו-להחזירה שעברו גדול מ- 10 קטעים LIF-3עכשיו לא מומלץ ללימודים פונקציונלי, מאז תרבויות שכאלה N-hPSC ייתכן הנמל שיבוטים karyotypically חריג בשל הבחירה התרבות התאים המשובטים ממושך. Reversions LIF-5i/LIF-3עכשיו טריים של קווי hPSC המקובלת נמוך-מעבר וצריך להתנהל ללימודים פונקציונלי, אם המלאי של N-hPSC עם < פסוקים 10 LIF-3עכשיו אינם זמינים.

4. הקפאה קריוגנית והפשרתו של LIF-3עכשיו-להחזירה N-hPSC

  1. הרחב להחזירה N-hPSC לפחות 5-7 פסוקים LIF-3עכשיו, כמצוין לעיל, לפני השימוש מחקרים תפקודית או הקפאה קריוגנית לטווח ארוך. לרשום את מספר קטעים בתנאים רגילים, בתנאים LIF-3עכשיו על כל בקבוקון cryopreserved.
    הערה: עודף LIF-3עכשיו-להחזירה N-hPSC בשימוש מבחני תפקודית יכולה להיות cryopreserved על כל קטע, אבל הקפאה של מעברים השחזור שלאחר התחתון (למשל., < p3) עלול לגרום לעניים, או היעילות התאוששות שלאחר הפשרה משתנה מאוד.
  2. באבטחה הקבינט, תשאף המדיום התרבות התאים ב- PBS (2 מ"ל לכל טוב), תשאף PBS וקונטה מביצועם hPSC המושבות לתוך תאים בודדים באמצעות פתרון ניתוק התא (1 מ"ל לכל טוב). מקם את הצלחת. בשביל 5 דקות ב 37 ° C ב- CO2 מיכלים (5% CO2, אווירה לח). לדלל את הפתרון ניתוק התא עם המדיום LIF-3עכשיו (קיפול. כפול), לאסוף את hPSC ב סטרילי חרוט 15 מ"ל, צנטריפוגה תאים ב x 200 גרם במשך 5 דקות, resuspend בגדר תא במדיום LIF-3עכשיו (1-2 מ לכל טוב-שוות-ערך). לספור את מספר התאים באמצעות hemocytometer או מונה הניתן תא אוטומטית.
  3. צנטריפוגה N-hPSC במדיום LIF-3עכשיו (200 x g למשך 5 דקות), resuspend תאים בשידת אבטחה הפתרון קפוא (טבלה 2), על צפיפות של פחות 1 x 106 תאים למ"ל.
  4. להעביר תאים לתוך הצינורות ההקפאה לאחסון לטווח ארוך ומניחים לתוך מיכל קירור איטי. לאפשר את הדגימות להקפיא ללילה במקפיא-80 ° C.
  5. למחרת, להעביר את cryovials לתוך מקפיא חנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך.
  6. עבור מפשיר, למקם את המבחנה קפוא לתוך אמבט מים 37 ° C עבור ~ 2 מינימלית Sterilize המבחנה (קרי, ספריי אתנול), העברה hPSC ב סטרילי חרוט 15 מ"ל, לאט לדלל את המדיום 10-fold hESC בתוך התאים (טבלה 1) בתוספת 5 μM של רו-הקשורים חלבון קינאז (רוק) מעכב Y-27632 בתוך כיסוי סטרילי בטיחות ביולוגית בארון.
  7. צנטריפוגה ב x 200 גרם במשך 5 דקות. אבטחה הקבינט, למחוק את תגובת שיקוע ללא תא, resuspend בגדר תא LIF-3עכשיו בינוני (1 – 2 מ"ל) בתוספת 5 μM רוק מעכבי Y-27632.
    הערה: אי-הכללה של Y-27632 תגרום המסכן היעילות התאוששות שלאחר שהביקושים (איור 2).
  8. העבר את התאים המופשרים resuspended ב LIF-3עכשיו/רוק מעכב על גבי מסוידים PBS מצופה MEF הבארות. Cryopreserve תרבויות LIF-3עכשיו-צפיפות של תאים6 עונה 1 פרק 10 לכל מבחנה. הפשרת כל אחד את שתי המבחנות על גבי אבוסים טוב אחד של צלחת 6-טוב gelatinized.
  9. למחרת, התחל רגיל LIF-3עכשיו הרחבה בינונית ללא מעכבי קינאז רו.

5. מזין להסרת עבור האוסף של דוגמאות N-hPSC

  1. כדי להכין דגימות LIF-3עכשיו/MEF (או hESC/MEF קונבנציונלי) תרבויות (קרי, עבור ביטוי גנים (למשל, כמותיים RT-PCR, מיקרו-מערכים) או חלבון (למשל, תספיג) ניתוחים, לרוקן של מאכילי MEF באמצעות תרבויות LIF-3עכשיו מגנטי הופעל התא מיון (מקינטוש) עם נוגדן anti-TRA-1-81 מצופה גרגרי לפי הפרוטוקול של היצרן.
  2. לחלופין, לנצל את השיטה הבאה ציפוי קדם פשוטה כדי לרוקן תרבויות מזיני, כמפורט להלן.
  3. בשכונה בטיחות ביולוגית סטרילי cabinet, למחוק את תגובת שיקוע ללא תאים, לשטוף את גלולה עם PBS סטרילי 2 מ"ל לכל טוב. ניתוק חסיד תרבויות LIF-3עכשיו/MEF באמצעות פתרון ניתוק התא (1 מ"ל/טוב). תקופת דגירה של 5 דקות ב- CO2 מיכלים (5% CO2, אווירה לח). לאסוף את hPSC ב סטרילי חרוט 15 מ"ל. שטיפת hESC בתוך 2-fold בינוני, העברת תאים לתוך סטרילי 15 מ"ל חרוט צנטריפוגה ב 200 x גרם במשך 5 דקות.
  4. באבטחה הקבינט, מחדש להשעות כל טוב של תאים LIF-3עכשיו/MEF הפומבית לתוך 2 מ"ל של המדיום LIF-3עכשיו, ולהעביר ישירות אל באר חדשה של צלחת 6-ובכן זה יש כבר מצופה טרי עם ג'לטין 0.1%.
  5. דגירה LIF-3עכשיו/MEF תאים hPSC עבור h 1-37 מעלות צלזיוס ב CO2 מיכלים (5% CO2, אווירה לח). איסוף תאים שאינם מחסידי עם פיפטה צינור חרוטי חדש. בעדינות להוסיף 2 מ של hESC בינוני מכל קידוח ו מערבולת כדי לאסוף את התאים שאינם מחסידי הנותרים.
    הערה: רוב MEF לקרינה לצרף הצלחת gelatinized ב 1 h, עוזב את רוב hPSC ההשעיה.
  6. לשלב, צנטריפוגה תאים ב 300 x גרם במשך 5 דק שטיפת ב- PBS. Snap-הקפאת בגדר תא בחנקן נוזלי לאחר צנטריפוגה, או לחלופין מחדש להשעות את כדורי במאגר lysing התואמת הזרם חלבון או חומצות גרעין הניתוח (איור 2B).
  7. לבצע אפיוני LIF-3עכשיו קווים hPSC עם פקד קונבנציונלי hPSC isogenic להתקפת תואמות.
    הערה: בשל השתנות מהותי בין ובתוך תרבויות להתקפת, בקרות רלוונטיות מוכנות ב timepoint תואמים בתרבות או לפני השחזור תמים. פרוטוקולים מפורט וחומרים עבור bioimaging immunofluorescent במורד הזרם, flow cytometry, סופג המערבי, ביטוי גנים (מבחני ה-RT-PCR ומיקרו-מערכים), מחקרים מתילציה (נקודה חשופה, CpG מתילציה microarray), משפר לקרע, OCT4 דומיננטיות כתב מבחני מבחני מעכב איתות ניתנים במקום3.

6. פוסט נאיבי לדוגמות: אימות של תקינות גנומית ואת השמירה של הורים חריטות LIF-3עכשיו-להחזירה N-hPSC לפני השימוש במבחני פונקציונלי

  1. מסך התרבויות hPSC כאשר הבחינה, קונבנציונאלי ההתחלתי על אחזקת קריוטיפ נורמלי (למשל, באמצעות ניתוח צביעת Giemsa-הלהקה באמצעות שיטות שפורסמו 7) לפני ביצוע השחזור LIF-5i/LIF-3עכשיו.
    הערה: זה היא לחסל אוכלוסיות hPSC קונבנציונלי יכול הנמל שינויים גנומית חריג אשר ייתכן כונן יתרון הישרדות סלקטיבי artefactual בתנאים LIF-3עכשיו המשובטים.
  2. לקבלת תוצאות מיטביות, טרי שחזר hPSC המקובלת תרבויות למצב תמים כמו עם LIF-3עכשיו מספר שבועות לפני השימוש בהם במחקרים תפקודית או מכוונת בידול.
    הערה: השגרה ממושך 'תחזוקה' תרבות בתנאים LIF-3עכשיו עבור יותר מ- 10 קטעים לדוגמות תמים הבאים אינו מומלץ. הרחבת שוטף ותחזוקה של קווי hESC ו- hiPSC צריכה להתבצע באמצעות מערכות התרבות קונבנציונאלי (למשל, E8, או MEF/hESC בינוני עם bFGF).
  3. להעריך שלאחר להחזירה N-hPSC קווים עבור השמירה של רגיל karyotypes 5 – 7 קטעים לאחר השחזור LIF-3עכשיו (למשל., עם ניתוח צביעת Giemsa-band,7, או כל שיטה אחרת של הבחירה).
  4. להעריך את כל השורות N-hPSC reverted עבור השמירה של שמירות גנומית הורים רגילה על-ידי בדיקת מתילציה DNA של בחירה (למשלפרוטוקולים עבור ניתוח microarray CpG DNA הטבעה הורית LIF-3עכשיו-להחזירה N-hPSC הינם מסופקים במקום אחר3 ) לאחר 5-10 קטעים לדוגמות LIF-3עכשיו.

7. פוסט נאיבי לדוגמות: הנחיות תכנון ניסויים מבחני התמיינות מכוונת כמותית באמצעות LIF-3עכשיו-להחזירה N-hPSC

  1. ישירות לנצל LIF-3עכשיו N-hPSC לתוך התמיינות מכוונת הוקמה פרוטוקולים ללא מניפולציות התרבות תאים נוספים.
    הערה: אין צורך בשיטה LIF-3עכשיו priming מחדש (קרי, המרת N-hPSC לחזור קונבנציונאלי תנאים כאשר הבחינה לפני השימוש בהם במסגרת מבחני התמיינות מכוונת) והיא אינה מומלצת.
  2. כדי לשלוט על ההשפעות של וזמינותו לבטן השתנות בבדיקת תפקודי של קווי hPSC בודדים, קרוס-לאמת את הלוחמים שושלת היוחסין הספציפי בידול על-ידי הפעלת פרוטוקולים בידול עצמאית לפחות שלושה hPSC קווים נגזר מרקע גנטי עצמאית (קרי, מרובים התורם, נגזר hiPSC, hESC).
  3. להשוואות פונקציונלי, להגדיר את תרבויות בין אחים, במספר שווה ערך מעבר, ומתוך אותו קו hPSC (isogenic) במקביל המקובל שושלת היוחסין-איפה זה מונח ותרבויות להחזירה-LIF-3עכשיו hPSC. לשמור על טענתי/נאיבי אחים isogenic hPSC תרבויות בתקשורת שלהם בהתאמה (למשל., E8 vs. LIF-3i), וההבחנה בו זמנית באמצעות בידול זהים פרוטוקולים וחומרים, לחסל את כל הטיה ניסיוני (איור 4).
  4. עבור isogenic טענתי נגד השוואות hPSC תמים, לכוונן ולמטב צפיפויות ציפוי הראשוני עבור כל assay בידול בודדים.
    הערה: פרוטוקולים מפורט עבור קדמון עצבית, האנדודרם סופית ובידול מכוונת המטו-אנדותל של N-hPSC LIF-3עכשיו-להחזירה ניתנים במקום 3. LIF-3עכשיו-להחזירה N-hPSC יש קיבולת proliferative ובידול עמידים יותר מבחני התמיינות מכוונת יותר hPSC רגיל. N-hPSC בדרך כלל דורש ריכוז ציפוי ראשוני נמוך יותר מאשר hPSC המקובלת, בניגוד hPSC להתקפת קונבנציונלי שלהם עמיתיהם, שאינן מחייבות השימוש של נוגדנים אנטי-מוות כדי לשפר את ההישרדות שלהם המשובטים בעקבות אנזימטי מערכת העיכול של מבחני בידול.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

פרוטוקול זה מייעל יעיל לדוגמות תמים כמו עם LIF-3עכשיו שתי תרבויות תלויי-מזין ועצמאי מזין שושלת היוחסין-איפה זה מונח קונבנציונלי hPSC (איור 1). פרוטוקול מפורט, כפי שיתואר בהמשך, מתאר רציפים ההסתגלות LIF-3עכשיו החל מגם תנאי hPSC תלויי-מזין או נטול המזין רגיל (למשל E8 בינוני).

נציג תוצאות עבור השחזור LIF-3עכשיו של מספר hESC המקובלת, hiPSC ללא transgene קווים מוצגים איורים 1 –3...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מערכת LIF-3עכשיו חל גרסה מותאמת של קלאסי 2i מאתר תמים לדוגמות קוקטייל1 גזע pluripotent אנושי. העצמי-חידוש hPSC (אשר לא יכול להרחיב ב- 2i לבד) הוא התייצב LIF-2i להשלים זה קוקטייל עם החומר המדכא tankyrase XAV939. תרבות LIF-3עכשיו מאפשר בצובר לדוגמות יעיל של hPSC המקובלת מדינה pluripotent הדומה את האדם epiblast של3. למרות מנגנוני הפעולה של XAV939 ב hPSC הם מתחם הסבירות סינרגטי עם 2i, הם ככל הנראה כוללים-מינימום, ייצוב חשוב, הגדלת של התחדשות עצ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

תחת הסכם רישוי בין החיים וטכנולוגיות של ג'ונס הופקינס אוניברסיטת (JHU), ד ר Zambidis זכאי נתח של תמלוגים התקבל לאוניברסיטת רישוי של תאי גזע. תנאי ההסדר הזה מנוהלות על-ידי JHU מדיניותה ניגוד אינטרסים. זה אינו משנה ההקפדה םירצוי יומן מדיניות שיתוף נתונים וחומרים.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים NIH/NEI (R01EY023962), NIH/NICHD (R01HD082098), פרס החדשנות שטיין RPB, מרילנד תאי גזע מחקר הקרן (2018-MSCRFV-4048, 2014-MSCRFE-0742), נובו נורדיסק המדע פורום פרס, קרן מוזלי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
נוגדן anti- SSEA-1/CD15, מצומד APCBD Biosciences561716שימוש 5µL לבדיקה (FACS)
נוגדן anti- TFCP2L1Sigma AldrichHPA029708שימוש בדילול של 1:100 (צביעות חיסוניות)
נוגדן anti-beta-ActinAbcamab6276שימוש ב 1:5000 (Western blot)
נוגדן anti-CD146,  PE מצומד BD Biosciences550315שימוש 5µL לבדיקה (FACS)
נוגדן anti-CD31, APC מצומדeBioscience17-0319-42שימוש 2µL לבדיקה (FACS)
ערכת נוגדן anti-CD31 מיקרופרלMiltenyi Biotec130-091-935
נוגדן anti-NANOGAbcamab109250שימוש בדילול של 1:100 (צביעות חיסוניות)
נוגדן anti-NR5A2Sigma AldrichHPA005455שימוש בדילול של 1:100 (צביעות חיסוניות)
נוגדן anti-p44/42 MAPK (Erk1/2)Cell Signaling4695שימוש ב 1:1000 (Western blot), לזיהוי חלבון כולל
נוגדן anti-phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204)Cell Signaling4370שימוש ב 1:1000 (Western blot)
נוגדן anti-phospho-STAT3 (Tyr705)Cell Signaling9145שימוש ב 1:1000 (Western blot)
נוגדן anti-rabbit immunoglobulin, biotinylatedAgilentE0432שימוש בדילול של 1:500-1:1000 (צביעות חיסוניות)
נוגדן anti-SSEA-4, APC מצומד R&D SystemFAB1435Aשימוש 5µL לבדיקה (FACS)
נוגדן anti-SSEA-4 GloLIVE, NL493 מצומדR&D SystemNLLC1435Gשימוש בדילול של 1:50 (צביעות חיסוניות חיות ומקובעות)
נוגדן anti-STAT3Cell Signaling9139שימוש ב 1:1000 (Western blot), לזיהוי חלבון כולל
נוגדן anti-STELLA/DPPA3MilliporeMAB4388שימוש בדילול של 1:50 (צביעות חיסוניות)
נוגדן anti-TRA-1-60 GloLIVE, NL557 מצומד R&D SystemNLLC4770Rשימוש בדילול של 1:50 (צביעות חיסוניות חיות ומקובעות)
נוגדן anti-TRA-1-60 StainAlive Antibody, DyLight 488 מצומדStemgent09-0068שימוש בדילול של 1:100 (צביעות חיסוניות חיות ומקובעות)
נוגדן anti-TRA-1-81 StainAlive Antibody, DyLight 488 מצומדStemgent09-0069שימוש בדילול של 1:100 (צביעות חיסוניות חיות ומקובעות)
נוגדן anti-TRA1-60, PE מצומדBD Biosciences560193שימוש 10µL לבדיקה (FACS)
נוגדן anti-TRA1-81, PE מצומדBD Biosciences560161שימוש 10µL לבדיקה (FACS)
APEL2-LiStemCell Technologies5271
סרום פרה בקרSigma AldrichA3311
מאגר דילול CellAdhereStemCell Technologies7183חומר מדלל ל-Vitronectin XF™ matrix
עכבר CF1Charles river023
CHIR99021R&D SystemL5283מחזור ב 100mM ב-DMSO
מערכת מיקרוסקופ קונפוקליZeissLSM 510
קו שורש עורקי CD34+ מקורו ב-iPSCThermo Fisher ScientificA18945מכונה גם קו 6.2
צלחות 6 באר מטופלות רקמתית Corning CostarCorning3506
מיכל ספירת תאים Countess Thermo Fisher ScientificC10228
מונה תאים אוטומטי CountessThermo Fisher ScientificAMQAX1000
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) Thermo Fisher Scientific11995-065
DMEM-F12Thermo Fisher Scientific11330-032
DMSO (dimethyl sulfoxide)Sigma AldrichD2650
עכבר DR4The Jackson Laboratory3208
תקן Essential 8 (E8)StemCell Technologies5940
סרום בקר עוברי (FBS)Thermo Fisher ScientificSH30071.03
ForskolinStemgent04-0025מחזור ב 100mM ב-DMSO
ג'לטין (חזיר)Sigma AldrichG1890-100Gהשהייה במים ועיקור באמצעות אוטוקלב
תחליף סרום KnockOutThermo Fisher Scientific10828-028
L-Glutamine (100X)Thermo Fisher Scientific25030-081
MEM Non-essential amino acid (MEM NEAA) (100X)Thermo Fisher Scientific11140-050
תקן mTeSR1StemCell Technologies85850
מכלי

מקורות

  1. Ying, Q. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).
  2. Zimmerlin, L., Park, T. S., Zambidis, E. T. Capturing Human Naive Pluripotency in the Embryo and in the Dish. Stem Cells Dev. 26 (16), 1141-1161 (2017).
  3. Zimmerlin, L., et al. Tankyrase inhibition promotes a stable human naive pluripotent state with improved functionality. Development. 143 (23), 4368-4380 (2016).
  4. Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. (64), e3854(2012).
  5. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nat Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
  6. Ludwig, T. E., et al. Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions. Nat Biotechnol. 24 (2), 185-187 (2006).
  7. Howe, B., Umrigar, A., Tsien, F. Chromosome preparation from cultured cells. J Vis Exp. (83), e50203(2014).
  8. Burridge, P. W., et al. A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability. PLoS One. 6 (4), 18293(2011).
  9. Park, T. S., et al. Growth factor-activated stem cell circuits and stromal signals cooperatively accelerate non-integrated iPSC reprogramming of human myeloid progenitors. PLoS One. 7 (8), 42838(2012).
  10. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25 (6), 681-686 (2007).
  11. Li, X., Krawetz, R., Liu, S., Meng, G., Rancourt, D. E. ROCK inhibitor improves survival of cryopreserved serum/feeder-free single human embryonic stem cells. Hum Reprod. 24 (3), 580-589 (2009).
  12. Collier, A. J., et al. Comprehensive Cell Surface Protein Profiling Identifies Specific Markers of Human Naive and Primed Pluripotent States. Cell Stem Cell. 20 (6), 874-890 (2017).
  13. Liu, X., et al. Comprehensive characterization of distinct states of human naive pluripotency generated by reprogramming. Nat Methods. 14 (11), 1055-1062 (2017).
  14. Choi, J., et al. Prolonged Mek1/2 suppression impairs the developmental potential of embryonic stem cells. Nature. 548 (7666), 219-223 (2017).
  15. Yang, Y., et al. Derivation of Pluripotent Stem Cells with In Vivo Embryonic and Extraembryonic Potency. Cell. 169 (2), 243-257 (2017).
  16. Orlova, V. V., et al. Generation, expansion and functional analysis of endothelial cells and pericytes derived from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 9 (6), 1514-1531 (2014).
  17. Park, T. S., Zimmerlin, L., Zambidis, E. T. Efficient and simultaneous generation of hematopoietic and vascular progenitors from human induced pluripotent stem cells. Cytometry A. 83 (1), 114-126 (2013).
  18. Park, T. S., et al. Vascular progenitors from cord blood-derived induced pluripotent stem cells possess augmented capacity for regenerating ischemic retinal vasculature. Circulation. 129 (3), 359-372 (2014).
  19. Taapken, S. M., et al. Karotypic abnormalities in human induced pluripotent stem cells and embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 29 (4), 313-314 (2011).
  20. Mitalipova, M. M., et al. Preserving the genetic integrity of human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 23 (1), 19-20 (2005).
  21. Beers, J., et al. Passaging and colony expansion of human pluripotent stem cells by enzyme-free dissociation in chemically defined culture conditions. Nat Protoc. 7 (11), 2029-2040 (2012).
  22. Laurent, L. C., et al. Dynamic changes in the copy number of pluripotency and cell proliferation genes in human ESCs and iPSCs during reprogramming and time in culture. Cell Stem Cell. 8 (1), 106-118 (2011).
  23. Hussein, S. M., et al. Copy number variation and selection during reprogramming to pluripotency. Nature. 471 (7336), 58-62 (2011).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

LIF 3iWestern Blot

מאמרים קשורים