ניתוח ארכיטקטורות חלבון חלבון-ליגנד מתחמי באמצעות ספקטרומטר מסה מבניים אינטגרטיבית

סיכום

ספקטרומטר מסה (MS) התפתחה כלי חשוב החקירה של מבנה, הדינמיקה של הרכבות macromolecular. כאן, אנחנו משלבים גישות MS לחקור היווצרות מורכבות חלבון ואיגוד ליגנד.

תקציר

חלבונים הם מחלקה חשובה של מקרומולקולות ביולוגיות לשחק תפקידים מרכזיים רבים תאיים כולל ביטוי גנים, ותזרז תגובות חילוף החומרים, תיקון ה-DNA, שכפול. לכן, הבנה מפורטת של תהליכים אלה מספק מידע חיוני על איך תאים פונקציה. שיטות MS מבניים אינטגרטיבית מציע מידע דינמיות מבניים על מכלול מורכבים חלבון, קישוריות מורכבים, יחידת משנה סטויכיומטריה, חלבון oligomerization ואיגוד ליגנד. התפתחויות אחרונות MS מבניים אינטגרטיבית אפשרו עבור אפיון מערכות ביולוגיות מאתגר כולל גדול DNA מחייבת חלבונים וחלבונים ממברנה. פרוטוקול זה מתאר את אופן שילוב נתונים MS מגוונים כגון MS מקורית, יון ניידות-ספקטרומטריית (IM-MS) עם דינמיקה מולקולרית סימולציות לקבלת תובנות לתוך ה-DNA נוקלאז הליקאז תיקון החלבונים. הגישה המתקבלת מספקת מסגרת ללימודי מפורט של ליגנד מחייב מתחמי חלבונים אחרים המעורבים בתהליכים ביולוגיים חשובים.

מבוא

ניתוח המוני spectrometric מקורית של חלבונים שלמים, מתחמי שלהם מתבצעת באמצעות ספקטרומטריית electrospray ו ננו-ספקטרומטריית electrospray יינון (נאסי), המשמרים קיפול חלבונים ואינטראקציות שאינם קוולנטיות במהלך תהליך יינון^{1, 2}. ב- MS מקורית, המבנה של חלבונים, מתחמי שלהם נשמרות במצב קרובה לשפת אם^3,גז-שלב⁴. MS יליד מזהה יונים חלבון טעונה מרובים, אשר מופרדים על-פי מסת לחייב יחס (מ/z) המאפשר את המסה של חלבון או חלבון-ליגנד מורכבים לחשב. מידע זה מאפשר קביעת של חלבון שלם סטויכיומטריה, יחידת משנה הרכב, איגוד ליגנד ו אינטראקציה רשתות^3,4,5,6. MS מקורי יש כמה יתרונות לעומת טכניקות אחרות כגון קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן, תהודה מגנטית גרעינית ספקטרוסקופיה⁵. ראשית, יליד MS הוא טכניקה מהירה, רגישה מאוד, המחייב רק כמה microliters (2-3 µL) מדגם בריכוזים מורכבות נמוכה יחסית הסופי ב- nM גבוהה מיקרומטר נמוכה בטווח⁶. שנית, יליד MS יכול לשמש כדי לחקור דגימות חלבון הטרוגנית בכך ניתן לנתח מספר חלבונים ומדינות oligomeric בו זמנית. שלישית, יליד MS לא דורשת דגימות חלבון כדי להיות שונה לפני ניתוח על-ידי crosslinking כימי או חלבון תוויות. יתרונות אלה הפכו מבניים MS כלי רב עוצמה עבור החקירה מבנית של מתחמי חלבון.

MS מקורית ניתן לשלב עם יון ניידות (IM), טכניקה המודד את הזמן שיון חלבון לוקח לנסוע דרך שדה חשמלי, המאפשר את חתך collisional (מיליגרם) נקבע. CCS מספקת מידע מבניים ברזולוציה נמוכה, המאפשרת טופולוגיה ומידע הסתגלותי הטרוגניות של חלבונים כדי להתקבל. יתר על כן, היא מאפשרת הבחינה של מודלים מבניים חלבון שנוצר על ידי גישות חישובית.

יציבות גז-פאזי חלבון יכול ייחקרו באמצעות התנגשות המושרה התגלגלות (ciu לקדם) נמדד מאת IM-MS. במהלך תהליך ciu לקדם, חלבון יונים מואצת, מופעלת באמצעות מוגברת מאיץ התנגשויות גז אינרטי מאגר בתוך ספקטרומטר מסה^7,8,9. תהליך ההפעלה collisional זה גורם החלבון להתגלות חלקית, אשר מיתרגם עלייה מיליגרם. שינוי זה CCS, האנרגיה הדרושה כדי לגולל את החלבון יכול להיות נמדד באמצעות IM-גב' בגישה זו, ההשפעה של ליגנד מחייב על יציבות חלבון יכול להיות נמדדו¹⁰. ניתן להפיק subcomplexes בתמיסה בשיטות הפרעה בפתרונות כגון התוספת של ממיסים אורגניים לפקח טופולוגיות כמו מקורי של מתחמי חלבון. שיבוש מתחמי חלבון הוא בעיקר עקב שיבוש אינטראקציות אי-קוולנטיות "אינטרה". מתחמי משנה לשמור על ילידים דמויי טופולוגיות, זיהוי MS, לחשוף מידע אודות קישוריות בין יחידה משנית.

גישות אינטגרטיבית בביולוגיה מבנית לשלב שיטות מגוונות כדי ללמוד את המבנה ואת הדינמיקה של חלבונים ו שלהם מתחמי^3,4,5,6. יליד MS ו- IM-MS שימשו לגלות את הפרטים המולקולרי של מערכות ביולוגיות מאתגר. היו מספר דוגמאות של יישומים כולל המחקר של חלבון הרכבה מסלולים^11,12,13,14, לומד רשתות אינטראקציית חלבון-חלבון^{15 , 16 , 17}קרום חלבונים^{6,18,19,20,21}, אינטראקציות חלבון-ליגנד כגון חומצות גרעין^{22,23 ,24}.

עם זאת, יליד MS יש גם המגבלות. יליד MS מדידות מבוצעות לעתים קרובות במאגרי נדיפים כגון אמוניה מימית אצטט שבו כמה חלבונים לא ישמרו שלהם במצב מקופל יליד^3,25. בכל זאת, העבודה האחרונה הראו כי מגבלה זו ניתן להתגבר על ידי אופטימיזציה של ריסוס בקוטר קצה המחט (טיפים 0.5 מ מ) כך חלבון ו יונים מורכבים חלבון יכול להיווצר ישירות מתוך מאגרי לא נדיף עם יונית-חזקה יותר לחקות סביבה פיזיולוגיים²⁶. בנוסף, יליד MS משתמשת ספקטרומטריית electrospray ionize ולהעביר את הרכבות קשרי ערכיות מהפתרון לשלב גז; לכן, שפע יחסי של מתחמי שאותרו לא מלאה מייצג זה פתרון^5,27. יתר על כן, לשם השוואה כדי בתמיסה, אינטראקציות הידרופוביות שלב גז הפך חלש יותר, אלקטרוסטאטיות להתחזק, ולכן העדיף^3,28.

במאמר זה, אנו מספקים פרוטוקולים, ניתוח נתונים, פרשנות עבור זיהוי חלבונים וליגנד איגוד באמצעות MS מקורית, IM-MS, ciu לקדם, הפרעה בפתרונות, ו דוגמנות. המתחם תיקון ה-DNA, הרה-נורא, משמשת כמערכת מודל. מעברי כפול גדילי הדנ א (DSBs) הם אחת הצורות ביותר ציטוטוקסיות, ברישול של נזק לדנ א, וכתוצאה מכך לחוסר יציבות גנטית, ההתפתחות של סרטן בבני אדם. רקומבינציה הומולוגית היא מנגנון תיקון אשר משורשה DSBs, תהליך אשר הוא בניצוחו של ה ATP הליקאז התלויים-נוקלאז מתחם הרה-נורא²².

שילוב מקורי MS ו- IM-MS עם מבחני פונקציונלי, דגמי מותר החקירה של: i) את התפקיד של נורה הרכבה, קונפורמציה ולאחר היציבות של המתחם, ii) האינטראקציה בין dsDNA לבין המתחם והשפעתו על הכולל יציבות של המתחם, ו- iii) סטויכיומטריה וההשפעה של ATP מחייב מכלול²². בסך הכל, הוביל להבנה משופרת הבסיס המולקולרי של המתחם הרה-נורה על-ידי קישור חלבונים מורכבים שינויים הסתגלותי ויציבות עם נוקלאוטיד מחייב. פרוטוקול זה הוא כללי עבור כל complex(es) חלבון אשר מקיים אינטראקציה עם אחד או מספר סוגי ligand(s).

פרוטוקול

1. מדגם הכנה MS מקורית של חלבונים, חלבונים-ליגנד מתחמי

הערה: כדי להשיג הבנה של הבסיס המולקולרי של קומפלקס החלבונים ואיגוד ליגנד באמצעות MS מקורית, הכנת הדוגמא המתאימה היא המפתח. מטרת סעיף זה היא כדי להדגיש את הצעדים הכנה מדגם חיוני לפני ניתוח MS באמצעות המתחם הרה-נורא הכובל DNA ו נוקלאוטידים כדוגמה.

1. להכין 20 aliquots µL של חלבון מטוהרים מרוכז (בדרך כלל 15-30 מיקרומטר) צינור 1.5 מ.
2. לניתוח איגוד ATP או ADP
   הערה: להוסיף הגדלת ריכוזים של ה-hydrolyzable ATP אדנוזין אנלוגי יונקות-O-(3-thiotriphosphate), tetralithium מלח (ATP-γ-S) או אדנוזין יונקות-diphosphate (ADP). Non-hydrolyzable ATP נגזרים ליצור מורכבות יציבה שיאפשר החלבון ATP-מחויב להיות בשבי. אחרים מקבילים שאינם hydrolysable ATP זה נבדק כוללים AMP-PNP ATP-γ-S-Mg^{2 +}.
   1. ללימודים הרה-נורא, מערבבים 5 מיקרומטר של חלבון מטוהרים עם ATP-γ-S ו ADP בריכוזים הנע בין 0-1 מ מ.
   2. כדי ללכוד בו זמנית איגוד ATP-γ-S ו ADP, הוסף שני נוקלאוטידים בריכוזים זהים או שונים.
   3. להוסיף 2 מ מ MgCl₂ , דגירה 25 ° c בחממה יבש אמבטיה עבור 1 h.
      הערה: ניתוח של נוקלאוטיד כריכת נאסי שיליד MS יכול לגרום artefactual מחייב בריכוזים גבוהים, ולכן מחייב שאינם ספציפיים שצריך להתחשב בו חשבון²⁹. כדי לחקור מחייב שאינם ספציפיים, להוסיף ריכוז גבוה יותר של נוקלאוטידים בין 2-5 מ מ).
3. לניתוח איגוד ה-DNA
   1. לערבב חלבונים ו- DNA ביחס של שן טוחנת המאפשרת היווצרות מורכבות חלבון-DNA. הרה, הרה-נורא, מערבבים 5 מיקרומטר של חלבון מטוהרים עם ה-DNA ביחס של 1:1.
   2. דגירה של הרה-נורא או הרה - DNA התערובת במשך 30 דקות ב- 25 ° C בחממה אמבט יבש עד שהוא מגיע שיווי משקל. משך זמן וטמפרטורה של דגירה עשוי להשתנות בהתאם החלבון תחת חקירה.
   3. מאגר exchange חלבון דגימות מאגרי תואמת של MS. בדרך כלל, משמשים אמוניה מימית אצטט פתרון בין 5 מ מ- 1 מ' ב- pH 7-8. אחרים מאגרי תואמת של MS כוללים ethylenediammonium diacetate (EDDA), אצטט (TEAA) Triethylammonium³⁰. ללימודים הרה-נורא, השתמש 200 מ"מ אמוניום אצטט pH 7.
      הערה: קיימות מספר שיטות עבור מאגר exchange לפני ניתוח על-ידי MS כגון שימוש concentrator ספין או עמודות כרומטוגרפיה. MS יליד מוגבל בעיקר על פי איכות המדגם כגון אנשים רגילים או adducts משמש במהלך טיהור. לכן, חיוני לבצע desalting מספיק כדי להשיג פסגות נפתרה.
   4. ללימודים איגוד ליגנד הרה-נורא, מאגר exchange דגימות 6 - 8 פעמים לתוך אצטט אמוניום 200 מ"מ באמצעות רכז. שיטה זו אמנם זמן רב יותר, הוא מבטיח כי נפתרה פסגות מושגות ומאפשר לקביעת מסה מדויק של מינים מאוגד ATP/ADP.

2. יליד MS רכישה וניתוח על חקירת קומפלקסים של חלבונים, חלבונים-ליגנד מתחמי

הערה: צריך להיות מוטבת MS תנאים להשגת פסגות נפתרה מאוד כדי לאפשר מדידות מדויקות המוני. הפרטים בסעיף זה מיטבי פרמטרים ב- Q-תוף ספקטרומטר מסה עם k 32 הגבול העליון מ/z פאול.

1. להתכונן נימים שבאתר ננו-ספקטרומטריית electrospray ולבצע כלי כיול מסה עבור מדידות מדויקות המוני כמפורט מאת קירשנבאום. et al. ¹.
2. בחר את רגישות, רכישת יון חיובי ומצב TOF ניידות.
3. הפעל השמנה, API, IMS הגזים. IM לפרידה, להשתמש חנקן (60 מ לדקה) וארגון (8.4 mL/min עבור האזור מלכודת) כנקודות התחלה ולאחר מכן התאם.
4. הגדר טווח רכישת מ המתאים/z. חלבון לא ידוע, אופטימיזציה הראשונית צעדים עליך להשתמש במגוון רחב כגון 500-32,000 m/z.
5. לטעון 2-3 µL של חלבונים מורכבים לפתרון להיות מנותח לתוך נימי מצופה זהב והכנס אותו בעל נימי.
6. בעדינות להדק את נימי, למקם את נימי בשלב מקור ספקטרומטריית electrospray והחלק את הבמה לעמדה בשביל לרכוש נתונים.
7. הפעילו לחץ גז ננו-זרם נמוך (0.00-0.05 בר) עד טיפה נוצר בקצה נים. אז יכול להיות ירד הלחץ ננו-flow עד הריסוס נשמר.
8. להתאים את נימי ביחס חרוט ידי הזזת את נימי ב- x, y, z עמדות ולנטר את יון הנוכחי כדי להשיג את יון יציב הנוכחי. החל מתח נימי בטווח של 0.9-1.6 kV.
9. הגדר את הדגימה קונוס (50-120 V), מקור היסט (60.0), מקור חום (25 ° C) ואת זרימת הגז קונוס (0.0 L/h). אלה הציע תנאים הראשונית ניתן להתאים.
10. לרכוש קשת המוני לפתרון טוב וכדי להגדיל את יון שידור, להתאים את הפרמטרים MS ונטר בשינוי הספקטרום המתקבל. אלה כוללים התאמת זרימת הגז השמנה (2-8 mL/min), הוא תא (180 mL/min), תא IMS (90 מ לדקה) כדי להשיג את ההפרדה הטוב ביותר על העברה.
11. התאם את האנרגיות התנגשות המלכודת אם ההיסטים מתח אינן מספיקות. נקודת מוצא אופטימלית הוא בין 10-50 V.
    הערה: הגברת האנרגיה השמנה יכולה להסיר ללא covalently מאוגדים adducts. עם זאת, לטפל כדי למנוע התנגשות המושרה דיסוציאציה התגלגלות של המתחם חלבון-ליגנד. לבצע מדידות יון ניידות לבדוק. אם מכשיר תנאים שומרים על החלבון במצב מקופל מקורי (שלב 3).
12. לשפר את desolvation על-ידי מיטוב המתח הסטייה מלכודת. נקודת מוצא אופטימלית הוא V 20-45.
13. למטב את גל מהירות וגובה גל להשיג הפרדה הניידות הטובה ביותר. הסבר מפורט עם פרוטוקול ניתן למצוא כאן³¹. המחקרים הרה-נורא, לשימוש מהירות הגל של 40 (m/s), גובה הגל של 550-650 (V).
14. השתמש פרמטרים אחרים כערכי ברירת המחדל של כלי נגינה.
15. להכין מדגם ליגנד ללא ניתוח כמו פקד עבור כל הפעלה (איור 1). לניסויים איגוד ליגנד, לבצע לפחות שלוש מדידות עצמאי.
16. להשתמש בתוכנה Masslynx כדי למדוד את המוני מינים שנוצר ולזהות הכריכה ליגנד, כגון איגוד ATP ו ADP והברית oligomeric (איור 2 ו- 3). תוכנות אחרות זמינים כוללים UniDec³², פולסר³³ אמפיטריטה³⁴.
17. כדי לכמת את השפע היחסי של מינים, השתמש עוצמות יון המתאימים שנצפתה ספקטרום ESI-MS raw (לדוגמה ליגנד מאוגדים, oligomers שונים, וכו '.). לחלופין, לבצע כימות באמצעות תוכנות מיוחדות כמו UniDec ו- Massign³⁵ (איור 1 ו-3 ).

3. רכישת וניתוח IM-MS

הערה: IM-MS מפריד יונים בשלב הגז-בהתבסס על גודל (מסה) שלהם, צורת תשלום. כל תכונה נפתרה בספקטרום מ/z מזוהה עם התפלגות זמן סחיפה. IM-MS מודד את הזמן הסחף של יון בו ניתן להשתמש כדי לחשב את התנגשות חתך (מיליגרם). ערכי שעה להיסחף נמדד מאמצע IM-MS נתונים רכשה באמצעות שצינור להיסחף ניתן מתואמים באופן ליניארי CCS ערכים³⁶. למסעות מדידות IM-MS (TWIMS) גל, חישוב ערכים CCS מצריך עקומת הכיול המתקבל חלבון סטנדרטים עם ערכים ידועים CCS³⁷. מבנה קומפקטי נעים מהר יותר מורחבת או מבנים מאורכים בשל צמצום אינטראקציות עם מאגר גז תא הניידות³⁸. לכן, IM-MS יכול לשמש כדי לזהות אם המבנה מקופל יליד סודרו ב שלב^39,של גז⁴⁰. סעיף זה מתאר כיצד למדוד IM-MS ולחשב את מיליגרם של חלבון באמצעות TWIMS.

1. לאחר מיטוב לתנאים מכשיר לשידור יציב (שלב 2), להפחית את האנרגיה collisional ואת חרוט הדגימה נמוך ככל האפשר תוך שמירה על איכות טובה ספקטרה.
2. השתמש גל אופטימליים מהירות גובה הגל לרכוש IM-MS (שלב 2).
3. למדוד את הסחף יון פעם עם IM-MS במהירויות שונות גל 3 (למשל, 550, 600 ו 650 m/s) תוך שמירה על גובה גל זהה (למשל, 40 V).
4. כדי לקבוע את היונים חלבון CCS, מדד calibrants חלבון תחת התנאים באותו מכשיר המשמש חלבון תחת חקירה. כיול סחיפה-זמן אופטימלי דורש מידה של חלבונים עם CCS ידוע.
   1. בחר calibrants ארבע, שתיים עם גוש מעל ושתיים עם גוש מתחת לזה של החלבון תחת חקירה³⁷. והכי חשוב, לוודא גובה הגל ואת מהירות גל זהה אלו שנרשמו עבור החלבון תחת חקירה.
5. לחשב סמ ק ידנית⁴¹ או באמצעות תוכנת מיוחדת הפולסר³³ ו אמפיטריטה³⁴ (איור 5).
6. כדי לבדוק אם החלבון מקורי דמוי הגז-בשלב, CCS ניסיוני השווה ל CCS תיאורטי המתקבל מבנים ברזולוציה גבוהה. עבור הרה-נורא, חישוב תיאורטי CCS באמצעות שיטת הקרנה קירוב (PA) המשמשת MOBCAL⁴². שיטות אחרות כוללות מסלול שיטה (TM)⁴² המדויק כדור קשה פיזור (EHS)⁴³.

4. בפתרון שיבוש חלבון מתחמי עבור MS מקורי ו- IM-MS הוביל מכשור לקביעת קשיות ומבנה

הערה: מתחמי משנה חלבון במקרים מסוימים ניתן לזהות מתוך אותו פתרון המתחם ללא פגע. עם זאת, מבניים למידע נוסף כגון קישוריות בין יחידת משנה והרכבה מורכבים בר השגה של שיבוש אינטראקציות חלבון בפתרון, מתחמי משנה צורה. זה יכול להיעשות במספר דרכים כגון התוספת של הממס האורגני, הגדלת כוח יונית או תפעול ה-pH. כדי לזכות בתובנה הרה-נורא מורכבת יחידה משנית קישוריות והרכבה מורכבים, מתחמי משנה נוצרו בפתרון על-ידי הוספת ממיסים אשר perturb אינטראקציות יחידה משנית.

1. להכין חלבון לדוגמה ומאגר ההחלפה לתוך אמוניום אצטט כפי שמתואר בשלב1.
2. להוסיף 10-40% של הממס בדרגות של 10%. ממיסים משמש בדרך כלל הם מתנול (MeOH), דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד) או acetonitrile (לחצן מצוקה).
   הערה: זה ניתן לבצע בתוך צינור פוליפרופילן microcentrifuge.
3. דגירה התערובת בקירור לשעה.
4. רוכשים של ספקטרום IM-MS עבור כל תנאי (שלבים 2 ו- 3) (איור 4).
5. השתמש פסגה תוכנה⁴⁴ כדי להקצות מתחמי משנה חלבון ולהפיק רשתות אינטראקציית חלבון. לחלופין, באופן ידני להפיק רשימה של ההמונים תיאורטי של המין הצפוי.
6. כדי להבטיח subcomplexes מקופלים, לחשב את ערכי CCS ניסיוני עבור מתחמי משנה, להשוות CCS תיאורטי, כמוסבר בשלב 3 (טבלה 1, איור 5 ו- 6 איור).

5. חוקרים חלבונים מורכבים יציבות באמצעות התנגשות המושרה התגלגלות (ciu לקדם)

הערה: ciu לקדם יכול לשמש בדיקה ביציבות הקונסטרוקטיבית של חלבונים ו שלהם תסביכים על איגוד ליגנד. מומחה חבילות תוכנה כגון הפולסר³³, אמפיטריטה³⁴ ו ciu לקדם סוויטה⁹ ואז ניתן ליצור מודל גז-שלב התפתחות של החלבון תחת חקירה עם ובלי ליגנד. לדוגמה, סעיף זה מתאר הליך לניטור גזים-פאזי התגלגלות מסלולים, חוקר את השפעת ייצוב איגוד ה-DNA ו- ATP על המתחם הרה-נורא.

1. נתוני IM-MS הרשומה תוך הגדלת המתח האצת מלכודת מ 10 V ל-200 V במרווחים של 2-10 V להתגלות למחמיר החלבון בשלב-הגז.
   הערה: הקלטת תוצאות במרווחים קטנים יותר בקבצי נתונים נוספים כדי לעבד, אולם לגישה זו נפתרה יותר ונמסר ברצף, אשר חשוב לנתח את נקודות המעבר בין המינים מקופל/פרש.
2. לנתח את הנתונים רכשה באמצעות הפולסר³³, אמפיטריטה³⁴ או ciu לקדם סוויטה⁹ ולהפיק דו מימדי חלקות התגלגלות ביחידות של CCS כפונקציה של האצת מתח (שלב 3). לכל מדינה תשלום, זה נוצר על ידי לערום את עוצמת-מנורמל CCS הפצות במתח כל מאיץ (איור 7 א-Bi).
3. צור ונמסר תיאורטי באמצעות אחת של חבילות תוכנה. הנתונים להיות מותאם מודל התגלגלות. הדבר מאפשר לכמת את האנרגיה collisional שבו המעברים ייפתחו להתרחש ולקבוע את היציבות של חלבונים עם ובלי ליגנדים מאוגד³³. המעבר התגלגלות הוא כאשר מעברים מינים ממצב אחד (מבוסס על ערכיהם CCS ניסיוני) למדינה אחרת עם CCS גדול יותר.
4. כדי quantitate המעברים, לחשב את midpoint(s) המעבר בין מדינות באמצעות אלגוריתמים ותוכנה כגון הפולסר³³. זה נפוץ המדווח CV₅₀, אשר הערך מתח התנגשות (השמנה) שבה תיגמר 50% של מדינה ספציפית.
5. באמצעות הערך₅₀ קורות חיים, לחשב את האנרגיה פנימי הכולל של יון באמצעות אנרגיה (KE_COM) את מרכז-של-המונית התנגשות⁴⁵. קה_COM מוגדרת על-ידי אנרגיה פנימית הכולל הזמינות עבור המעבר התגלגלות של יון ו מחושבת אנרגיה קינטית, גושים של השותפים התנגשות (חלבון יון וגז נייטרלי) כפי שמתואר משוואה (1)¹⁰
   KEcom (eV) = (משוואה 1).
   כאשר Z הוא הטענה יון, M_N הוא המסה של הגז נייטרלי והוא ז_יון המסה של יונים חלבון.
   הערה: זה בגלל ciu לקדם של חלבונים הוא תשלום dependent46, 47. מומלץ לבצע את הניתוח KE_COM למצב תשלום אחד או יותר (כל איור 7).

6. מודלינג הליכים דיפרנציאלית סימולציות דינמיקה מולקולרית בשימוש ב'עין MS

הערה: באמצעות מודלים של החלבוניות או קומפלקסים כמו של מבנים קריסטל, MD דיפרנציאלית סימולציות (חלבון מורכב עם ובלי ליגנד) יכול לשמש כדי לקבוע את ההשפעות של דוגמה ליגנד נוכחות על מבנה החלבון ואת הדינמיקה. סעיף זה מפרט זרימת עבודה וכלים הדרושים עבור דגמי ההליכים הדרושים כדי הגדרת דינמיקה מולקולרית דיפרנציאלית סימולציות.

1. לזהות את subunits אשר מרכיבות את המתחם (איור 8א, ב שלבים 2 ו- 3). מקור מודלים קיימים של subunits, למשל, קריסטל במבני שהזכרון RCSB (https://www.rcsb.org). UniProt כניסת החלבון מכיל רשימה של יודע לחקר הגבישים/NMR מבנים (http://www.uniprot.org). אם אלה אינם זמינים, ניתן להזין את רצף תיאורטי הפיצוץ כדי לזהות תבניות מתאימים עבור הומולוגיה דוגמנות (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/).
2. להרכיב המתחם בטופולוגיית הנכון (איור 8A-ii). ניתן לבצע זאת באמצעות שיטות שונות. Subunits בודדים יכול להיות מצויד לתוך מפות מיקרוסקופ אלקטרונים ניתן למצוא באתר EMDB כדי להרכיב את מתחם שלם (https://www.ebi.ac.uk/pdbe/emdb/). ערכת לימוד על השתלבות PDBs EM המפות באמצעות מולקולרית Dynamics גמיש מתאים (MDFF) ניתן למצוא כאן: http://www.ks.uiuc.edu/Training/Tutorials/science/mdff/tutorial_mdff-html/.
3. לזהות אזורים החסרים של המתחם (איור 8א-iii). ביצוע עימוד רצפים מרובים (מס א) בין PDB רצף התיאורטית לזיהוי שאריות אשר עשוי להיות unfitted לתוך מבנים קריסטל או כל מוטציות בירושה ניסויים לחקר הגבישים. למתקן יכול להתבצע באמצעות את webservers כגון T-קפה (http://tcoffee.crg.cat/apps/tcoffee/do:regular).
4. להתחדש שאריות החסר באמצעות הומולוגיה דוגמנות (איור 8א-iv). חסרים שאריות של החלבונים ניתן לבנות באמצעות התוכנית דגמן (https://salilab.org/modeller/). המעצב יכול פלט אנסמבל של דגמי n בתצורות שונות מחדש. דוגמניות טוב יכול להיות מזוהה בהתבסס על הציון שלהם דיסקרטית ממוטב חלבון אנרגיה (סמים). מדריך מקיף מסופק באתר האינטרנט של התוכנה (https://salilab.org/modeller/tutorial/).
5. ביצוע סימולציות דינמיקה מולקולרית דיפרנציאלית (MD) של החלבונים (איור 8ב') כדי לזהות אזורים של חלבונים אשר מגיבים לשינוי סביבתי מסוים, למשל, המצאות ליגנד. בהדמיות כזה, הפרמטרים התנהגותי סימולציה A (חלבון בלבד) אשר משמש כהפניה, יופחת מ B סימולציה (חלבון + ליגנד). התנודות דיפרנציאלית שורש ממוצע הריבועים (אולי זאבת) מחושב בין סימולציות A ו- B יכול להודיע על אזורים של החלבון אשר להגדיל או להקטין בגמישות באופן תלויות ליגנד.
   1. ביצוע סימולציות MD וניתוח במורד הזרם באמצעות GROMACS (http://www.gromacs.org). ניתן למצוא ערכת לימוד: http://www.bevanlab.biochem.vt.edu/Pages/Personal/justin/gmx-tutorials/Lysozyme/index.html. כדי elimate דגם משוא פנים המבנה של המתחם ליגנד מכורך צריך להיווצר קודם. החלבון מועתק אז מזה בלי ליגנד, להניב דגם חלבונים זהים למתחם מאוגד-ליגנד.

תוצאות

תוצאות MS מקורי חשף את המדינה oligomeric, הלחנה ו טופולוגיה של המתחם הרה-נורא (איור 1). כפי אינטראקציות אי-קוולנטיות נשמרים בשלב-הגז, MS מקורית של ATP-γ-S ו- ADP titrations ניסויים קבעו האיגוד נוקלאוטיד pairwise כדי הרה-נורא (איור 2) וזה מגביר הגדלת ריכוז ATP-γ-S היחסית עוצמת hexameric הרה (איור 3). מבני מידע לגבי אינטראקציות יחידה משנית, התקבלו בבית-פתרון הפרעה ואחריו MS יליד והיו גשר עם, בגושים התיאורטיים (איור 4 , טבלה 1).

הערכים CCS ניסיוני של חלבונים ומתחמי שלהם היה נגזר ניסויים IM-MS (איור 5). ערכים אלה הם גז rotationally בממוצע-שלב החישובים חתך הרוחב של הצורה המולקולרית, לתאר את המדינה תלת-ממדי של החלבון. CCS ערכים לעומת מדידות תאורטית מ קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן, הסכם טוב יסיק כי הצורה המקורית נשמרים ב- גז-פאזי (טבלה 1). זה מאמת באמצעות ערכים CCS לבניית מודלים ברזולוציה נמוכה של חלבון הרכבה⁴⁸.

CCSs ניסיוני ניתן לחשב עבור כל יון המדינה תשלום. Conformer חלבון כמו מקורי עלול להביא לחייב את המדינה יונים עם ערכי CCS דומים. עם זאת, יונים המדינה תשלום גבוה יותר גדל repulsions coulombic, דבר שעלול להוביל חלבון גז-פאזי התגלגלות גדול CCS וערכי בהשוואה את CCSs תיאורטיים. הערך מיליגרם של המדינה תשלום הנמוך יונים ולכן הם בדרך כלל בשימוש⁴⁹. עבור הרה-נורא, ניסויים בפתרון הפרעה על הרה ושל הרה-נורא עם או בלי דנ א תתבקש הדור של מסלול הרכבה החל מונומרים ואז להרכיב את כל hexameric הרה (הרה₆)-מתחם נורא (נורא₂) dimeric עם ה-DNA (איור 6).

הבדלים בין החלקות התגלגלות ciu לקדם בין ליגנד מאוגד apo (חינם ליגנד) להגדיר את השינוי יציבות מורכבים עם איגוד ליגנד. קורות חיים גבוה₅₀ או KE_COM ערך מרמז על יון מיוצב יותר הגז-בשלב. Ciu לקדם וניתוח_COM KE התגלה שהדנ א מכורך הרה-נורא יציב יותר המתחם ללא ה-DNA (איור 7כל). מניתוח ciu לקדם-MS במדינות מחייב ATP, המדינה ארבע-ATP-γ-S המאוגדת יציבות מורכבות מופחתת הגז-השלב, 6 -ATP-γ-S המאוגדת המדינה איפה כל האתרים תפוסים היה הכי יציב (איור 7Bii). יליד MS יכול לחשוף את נוקלאוטיד דיסקרטית איגוד מדינות הרה; עם זאת, זה לא יכול להבחין subunits הרה אשר מחייבות ATP, שם איגוד זה מתקיים. מידע זה יכול להיגזר מפורשת סימולציות MD ממס על hexameric את הרה, את הרה-נורא בעקבות זרימת העבודה summarised (איור 8).

איור 1. חוקר את המדינה oligomeric, הרכב ואת הטופולוגיה של המתחם קשרי ערכיות הרה-נורא. (א) ספקטרה המונית של הרה, הרה-נורא הרה-נורא בנוכחות DNA (15.4 kDa 25 bp כפול גדילי DNA). המתחם תת הרה קיימת של hexamer והן של heptamer. דימר נורא נקשר וכדי hexamer הרה הטלת המרה oligomeric. ה-DNA מאגד המתחם בנוי הרה - נורא (תוצאות מ Ahdash צ. et al., 2017²²). (ב) עוצמות יחסי המינים שזוהו מחושבים באמצעות UniDec³². אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

באיור 2. ESI-MS מקורי חושף את המנגנון של נוקלאוטיד מחייב הרה-נורא. המוני ספקטרה הרה-נורא (א) ו- (ב) הרה-נורא-DNA עם הגדלת ריכוזי (i) ATP-γ-S ו- (ii) ADP. ההמונים נמדד לעומת בגושים התיאורטיים ואת מידת ATP-γ-S או ADP מאוגד נקבעות. ההמונים נמדד מספר נוקלאוטידים מאוגד מוצגים על הספקטרום. ניסויים titrations ATP-γ-S ו ADP קבעו האיגוד נוקלאוטיד pairwise הרה-נורא לבד, כאשר במתחם עם ה-DNA המציינת את מנגנון התגובה מחזורית (תוצאות מ Ahdash צ. et al., 2017²²). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 3. מדידת השפעת ריכוז ATP-γ-S על מצב oligomeric הרה. (א) מסת ספקטרום של הרה-הגדלת ריכוזים של ATP-γ-S. (ב) גרף המציג את עוצמות היחסי של מינים שונים של MS יליד מחושב באמצעות תוכנה deconvolution UniDec³². ריכוז ATP-γ-S גודלת, שהבוטות היחסית של hexameric הרה גם מגביר. מספר מולקולות ATP-γ-S מאוגד מוצג על הספקטרום (תוצאות מ Ahdash צ. et al., 2017²²). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

באיור 4. המוני ספקטרה ומוצרי דיסוציאציה תת מתחם של הרה (א) ו- (ב) הרה-נורא (i) לבד ובפני הבאים (ii) ה-DNA של שיבוש בבית-פתרון. הפרעה בפתרון הניסויים בוצעו באמצעות 10-40% של Acetonitrile, מתנול (MeOH) או דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד) וכתוצאה היווצרות של subcomplexes שונים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 5. יון ניידות ההגעה זמן הפצות שמוצג על ציר CCS מתחמי ואת מתחמי משנה שנוצר. סמל עבור כל תת מתחם לתאם עם אלה מוערת על הספקטרום באיור4. ההמונים ניסיוני ומחושב וערכים מיליגרם של מתחמי משנה מפורטים בטבלה 1 אשר הראה הסכם בין ערכים ניסיוני ומחושב (לאחר ששקל הוודאות טיפוסי בהחלטה מטיילים גל יון ניידות ספקטרומטר מסה של ±5 - 8%³⁷). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 6. מסלול הרכבה של המתחם הרה-נורא שנוצר מהפרעות בבית-פתרון מקורי עיגולים MS ו- IM-גב' צבעוניים לציין תנאי שבו נצפתה בכל מתחם תת: מקורי (ירוק, לפני כדי הפרעה), מתנול (צהוב), דימתיל סולפוקסיד (סגול) או Acetonitrile (אדום). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 7. חוקרים את השפעת ייצוב (א) ה-DNA על הרה-נורא ו- ATP (ב) מחייב הרה-נורא-DNA. (i) גז-שלב ciu לקדם-MS חלקות וחישוב אנרגיות (KEcom) (ii) מרכז-של-המונית התנגשות מראים כי הנוכחות של dsDNA מייצבת את מתחם הרה-נורא, ש ATP-γ-S שישה מאוגד המדינה ויש היציב ביותר. מייצב עבור תשלום שונה הברית מוצג. מגרשים נוצרו באמצעות הפולסר ³³. תוצאות (א) מ Ahdash צ. et al., 2017²². אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 8. זרימת עבודה עבור נהלי דינמיקה מולקולרית דיפרנציאלית סימולציות הדוגמנות. (א) יצירת הקומפלקס תחת חקירה על ידי בניית הטופולוגיה מן הקיים subunits ובנייה מחדש של שאריות חסרים. (ב) זרימת עבודה עבור הפעלת דינמיקה מולקולרית סימולציות על החלבונים עם ובלי ליגנד. דינמיקה מולקולרית ההדמיות רץ החלבון רק אילו מעשים כהפניה, אשר הוא המופחת סימולציה של חלבון בתוספת ליגנד. זה מלווה חישוב התנודות דיפרנציאלית שורש ממוצע הריבועים (אולי זאבת) בין ההדמיות וקביעת ההשפעה של ליגנד מחייב. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

מורכבות / תת מורכבים	תאורטית מסה (kDa)	ניסיוני מסה (kDa)	CCS תיאורטי (Å2)	CCS ניסיוני (Å2) [תשלום]	תנאי, HN
הרה6- נורא2	416.22	417.85	14531	14577 [42 +] 14599 [43 +] 14608 [44 +] 14637 [45 +]	10-20% לחצן מצוקה, דימתיל סולפוקסיד 10-40%, 10% MeOH
הרה6- נורא2- dsDNA...	431.72	432.27	-	14661 [39 +] 14728 [40 +] 14781 [41 +] 14837 [42 +]	לחצן מצוקה 10%, 10% MeOH
נורא1	39.12	38.18	3254	2618 [10 +] 2746 [11 +] 2878 [12 +]	10-40% לחצן מצוקה, 10% MeOH, 20-40% דימתיל סולפוקסיד
נורא2	78.24	78.36	4890	4903 [16 +] 4614 [17 +] 4537 [18 +] 4666 [19 +]	10-40% MeOH, 20-40% דימתיל סולפוקסיד
הרה1	56.33	56.32	4131	3647 [14 +] 3792 [15 +] 3950 [16 +]	לחצן מצוקה 10-40%, 40% דימתיל סולפוקסיד
הרה2	112.66	112.95	6475	5648 [20 +] 5747 [21 +] 5842 [22 +] 5996 [23 +]	40% מתאמפטמין, לחצן מצוקה 10-40%
הרה3	168.99	169.39	8607	7501 [25 +] 7616 [26 +] 7717 [27 +] 7867 [28 +]	10-40% MeOH, פח 10-40%, 40% דימתיל סולפוקסיד
הרה3 + DNA	183.99	184.976	-	7655 [26 +] 7990 [27 +] 8107 [28 +]	לחצן מצוקה 10-30%
הרה4	225.32	226.2	10477	9205 [30 +] 9287 [31] 9493 [32 +] 9961 [33 +]	10-40% MeOH, לחצן מצוקה 10-40%
הרה4 + DNA	240.82	241.33	-	9637 [31 +] 9756 [32 +] 9830 [33 +]	לחצן מצוקה 10-30%
הרה5	281.65	282.75	11853	10847 [36 +] 10958 [37 +] 11161 [38 +]	לחצן מצוקה 30-40%
הרה6	337.98	339.3	12517	12335 [38 +] 12386 [39 +] 12498 [40 +] 12590 [41 +] 12676 [42 +] 13019 [43 +]	10-40% MeOH, לחצן מצוקה 10-40%
הרה6 + DNA	353.48	354.626	-	12890 [40 +] 13081 [41 +] 13184 [42 +] 13273 [43 +] 13463 [44 +] 13576 [45 +]	לחצן מצוקה 30%
הרה7	394.3	395.85	13901	14154 [42 +] 14219 [43 +] 14261 [44 +] 14285 [45 +] 14335 [46 +]	10-40% MeOH, לחצן מצוקה 10-40%, 10-40% דימתיל סולפוקסיד
הרה7 + DNA	409.8	410.62	-	14414 [41 +] 14510 [42 +] 14558 [43 +] 14598 [44 +] 14630 [45 +] 14641 [46 +]	לחצן מצוקה 10%

טבלה 1- ההמונים ניסיוני ומחושב וערכים מיליגרם של הרה-נורא, מתחמי משנה שלה שנוצר טופס בפתרון הפרעה מחקרים.

דיון

MS משחק תפקיד חשוב יותר ויותר באפיון סטויכיומטריה, אינטראקציות ואדריכלות יחידת משנה של מתחמי חלבון. IM-MS נתונים יכול לשמש להגדרת סידורים טופולוגי של subunits בתוך מתחמי. MS, לעומת שיטות אחרות-ביולוגיה מבנית קיים, יש מספר יתרונות. MS מקורית היא טכניקה מהירה, רגישה מאוד והוא יכול לשמש כדי לחקור דגימות חלבון הטרוגנית. כאשר משולב עם הפרעה בפתרון ניסויים, ניתן לנטר דיסוציאציה מסלולים של חלבון הרכבות. יחד עם מבנים קריסטל או מודלים הומולוגיה, המידע המוצעים על ידי MS מבניים מציע כלי עבור חוקרים אינטראקציות חלבון-ליגנד ומספקים הרכבה מסלולים¹¹ומודלים קרובה לשפת אם.

כאן, אנו מתארים נהלי ניסיוני הצורך לנתח את סטויכיומטריה והרכב של אינטראקציות חלבון-ליגנד, עם ליגנדים אחד או יותר, באמצעות MS אינטגרטיבית. זה כולל הכנת הדוגמא MS, חדרי קירור והקפאה, ניתוח נתונים, השילוב של נתונים MS באמצעות כלים חישוביים. כדי לעשות זאת, השתמשנו החלבון הטרו-oligomeric DNA-כריתה הרה-נורא מורכבת, מאוגדים ליגנדים שלוש (דנ א, ATP ו ADP), כמערכת מודל שלנו. הפרוטוקול מראה את השימוש בתוכנה זמין כעת כדי לסייע לניתוח נתונים והצגה.

רכישת ספקטרה באיכות גבוהה חשוב לניתוח איגוד ליגנד, לכן, צעדים הכנה מדגם זהיר הם קריטיים, כולל טיהור חלבון, ליגנד טיטור מאגר exchange. מגבלה אחת של נאסי MS יליד כשלמדתי ליגנד מחייב הוא מחייב שאינם ספציפיים. איגוד שאינו ספציפי מתרחשת במהלך droplet desolvation לאורך כל התהליך ספקטרומטריית electrospray. זה מגביר ריכוז ליגנד ומשנה ולכן יחס חלבון/ליגנד²⁹. הכריכה של נוקלאוטידים יוצרת הבדל מסה קטנה יחסית בין אפו נוקלאוטיד מכורך חלבון אשר אינו משנה את יעילות יינון^50,51.

השתמשנו במערכת Synapt G2-סי MS עבור העבודה שלנו, אבל הפרוטוקולים הינם ישימים עבור חקירות שונים של מתחמי חלבון-ליגנד אחרים באמצעות ספקטרומטרים המונים אחרים זמינים מסחרית ננו-ספקטרומטריית electrospray. MS מבניים אינטגרטיבית יותר ויותר משחק תפקיד חשוב בטיפול בעיות ביולוגיות מורכבות גדולה יותר. זרימת העבודה והטכניקות המתוארים כאן הם מתאים היטב להבנת ההשלכות מבנית, בניית מנגנונים של חלבונים מורכבים, היווצרות חלבון-ליגנד אשר אחרת קשה ללמוד באמצעות טכניקות מבניים קונבנציונלי .

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
אדנוזין 5&פריים;-(3-תיוטריפוספט) מלח טטרליתיום	Merck Millipore	119120-25MG
אדנוזין 5&פריים;-דיפוספט	Sigma-Aldrich	20398-34-9
תמיסת אמוניום אצטט	Sigma-Aldrich	A2706
מיקרו ביו-ספין כרומטוגרפיה עמודות	Bio-Rad	7326204
Vivaspin רכז	Sartorius	Z614041-25EA
מגנזיום כלוריד הקסהידרט	Sigma-Aldrich	246964
Water TraceSelect	סיגמא-אולדריץ'	95305
נימי בורוסיליקט	הרווארד מכשיר	300060