הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הערכה תפקודית של חוש הריח מסלולים ב ראשנים של צפרדע רפואית חי

6.9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/58028

⸱

11 בדצמבר 2018

 ,  ,  , 
1Laboratory of Neurobiology, Neuroscience Program, Bellvitge Biomedical Research Institute (IDIBELL), L'Hospitalet de Llobregat, 2Department of Pathology and Experimental Therapy, School of Medicine, University of Barcelona, L'Hospitalet de Llobregat, 3Institute of Neurosciences, University of Barcelona, L'Hospitalet de Llobregat

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

ראשנים של צפרדע רפואית להציע פלטפורמה ייחודית לחקור את תפקוד מערכת העצבים ויוו. אנו מתארים מתודולוגיות להערכה של עיבוד מידע חוש הריח חי צפרדע רפואית הזחלים בתנאים נורמליים לגידול או לאחר פגיעה.

תקציר

ראשנים של צפרדע רפואית להציע פלטפורמה ייחודית לחקור את תפקוד מערכת העצבים. הם מספקים יתרונות ניסיוני מרובים, כגון נגישות רבות הדמיה גישות, שיטות אלקטרופיזיולוגיות של מבחני התנהגות. מערכת הריח של ראשן צפרדע רפואית מתאימה במיוחד כדי לחקור את הפונקציה של הסינפסות הוקמה במהלך התפתחות נורמלית או רפורמה לאחר פציעה. כאן, אנו מתארים מתודולוגיות להערכה של עיבוד מידע חוש הריח חי צפרדע רפואית הזחלים. אנחנו חלוקה לרמות בשילוב של מדידות ויוו של סידן presynaptic תגובות ב glomeruli של הנורה הריח עם מבחני התנהגות מונחות על חוש הריח. ניתן לשלב שיטות חיתוך של הריח עצבים לומד הטיפולי של קישוריות סינפטית. ניסויים מוצגים באמצעות בעלי חיים פראי-סוג והן מהונדס גנטית, המבטאת GFP כתבים תאי מערכת העצבים המרכזית. יישום גישות תיאר ראשנים מהונדסים יכול להיות שימושי עבור להתיר היסודות המולקולריים המגדירים את התנהגות חוליות.

מבוא

צפרדע רפואית ראשנים מהווים מודל חיה מצוינת ללמוד על תפקוד תקין של מערכת העצבים. שקיפות, הגנום במלואו ברצף1,2וכן נגישות כירורגי, אלקטרופיזיולוגיות טכניקות הדמיה הם מאפיינים ייחודיים של הזחלים צפרדע רפואית לאפשר חקירת עצביים פונקציות ויוו3 . חלק מהאפשרויות ניסיוני מרובים של מודל זה בעל חיים מומחשים על ידי מחקרים יסודיים מתבצע על ראשן ורפלקסי מערכות4,5,6. מעגל עצביים במיוחד מתאים היטב ללמוד היבטים רבים של מידע עיבוד ברמה של הסינפסות היא מערכת הריח ראשן צפרדע רפואית 7. ראשית, קישוריות סינפטית שלה היא מוגדרת היטב: קולטני ריח נוירונים (ORNs) פרוייקט הנורה הריח ולבסס קשרים סינפטיים עם דנדריטים של המסתם הדו-צניפי/מצויץ תאים בתוך glomeruli ליצירת מפות ריח. שנית, ORNs שלה ברציפות מופקים על ידי נוירוג'נסיס לאורך החיים כדי לשמור את הפונקציונליות של מסלולים חוש הריח8. שלישית, כי מערכת הריח מראה יכולת ההתחדשות הגדול, ראשנים של צפרדע רפואית הם מסוגלים לחלוטין רפורמה הנורה הריח שלהם אחרי אבלציה9.

בנייר זה, אנו מתארים גישות לשלב הדמיה של חוש הריח glomeruli ב ראשנים חיים עם ניסויים התנהגותיים ללמוד את הפונקציונליות של מסלולים חוש הריח. השיטות שתוארו כאן שימשו כדי ללמוד התאוששות פונקציונליות של קישוריות glomerular בהנורה הריח אחרי חיתוך עצב הריח10. נתונים שהושגו ב ראשנים של צפרדע רפואית הם נציג של חולייתנים מאז עיבוד חוש הריח הוא אבולוציוני והתפאורה.

בשיטות המתוארות הן ביטוי באמצעות X. tropicalis , אבל הם בקלות ניתן ליישם ב- X. זריזה. למרות גודל גדול יותר מבוגר X. laevis, שני המינים דומים בשלבים ראשן. ההבדלים העיקריים לשכון באותה רמת גנומית. X. laevis מציג ללקוחות שלנו גנטי המסכן, נקבע בעיקר על ידי הגנום allotetraploid שלה ואת משך זמן דור (כ- 1 שנה). לעומת זאת, X. tropicalis הוא נוטה יותר שינויים גנטיים בשל זמן דור קצר (5-8 חודשים) שלה הגנום דיפלואידי. הניסויים נציג מומחשים חיות פראי-סוג, שלושה קווים הטרנסגניים שונים: Hb9:GFP (X. tropicalis), NBT:GFP (X. tropicalis), tubb2:GFP (X. laevis).

למתודולוגיות המתוארים העבודה הנוכחית להתייחס לצד התקדמות גנטי בתחום צפרדע רפואית . הפשטות ואת יישום קל של טכניקות הציג הופך אותם שימושי במיוחד להערכת מוטציות שתואר כבר11, כמו גם קווי צפרדע רפואית שנוצרו על-ידי טכנולוגיית CRISPR-Cas912. אנו מתארים גם הליך כירורגי נהגה transect עצבי הריח זה יכול להיות מיושם במעבדה כל גישה ראשנים של צפרדע רפואית . הגישות המשמש להערכת תגובות סידן presynaptic, התנהגות מונחות על חוש הריח דורשת ציוד ספציפי, אמנם לרשותכם קו מתון עלתה. מתודולוגיות מוצגים בצורה פשוטה על מנת לקדם את השימוש בקבוצות מחקר, אפשר להגדיר הבסיסים של מבחני מורכב יותר או על-ידי הטמעת שיפורים או על ידי האגודה טכניקות אחרות, קרי, היסטולוגית או מחלה גנטית גישות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל ההליכים אושרו על ידי ועדת האתיקה מחקר בבעלי חיים ב אוניברסיטה של ברצלונה.

הערה: הראשנים X. tropicalis ו- X. laevis גדלים לפי בשיטות הרגילות13,14. ראשן מים מוגש על-ידי הוספת מלחי המסחרי (ראה טבלה של חומרים) מים שהושג באמצעות אוסמוזה הפוכה. מוליכות מותאמת ∼700 µS, ∼1, 400 µS על ראשנים X. tropicalis ו- X. laevis , בהתאמה. ניתן להשיג את הזחלים לטבעי להזדווגות או הפריה חוץ גופית14. העוברים הם dejellied עם 2% L-ציסטאין שהוכנו בבית ששינה רינגר (MMR של מארק x 0.1). 1 x MMR מכיל (במ מ): 100 NaCl, 2 אשלגן כלורי, 1 MgSO4, 2 CaCl2, 5 HEPES, 0.1 EDTA, pH 7.8. הזחלים מועברים לאחר 2-3 ימים (שלב 25) 2 L מיכלי מים ראשן. כאשר ראשנים מגיע שלב 40 של קריטריונים Nieuwkoop-פייבר (NF)15, הם יכניסו טנקים 5 L, ומתוחזק על צפיפות של 10 חיות/ל' החום נשמר קבוע ב- 23-25 ° C ו- 18 – 20 ° C עבור X. tropicalis ו- X. laevis ראשנים, בהתאמה. בעלי חיים שנמצאו בשלבים 48-52 של הקריטריונים NF משמשים לניסויים.

1. חיתוך של עצבי הריח

  1. להכין פתרון בהרדמת של 0.02% MS-222 ב 50 מ של ראשן מים בטמפרטורת החדר.
  2. הכינו טנק קטן (1-2 L) עם ראשן מים כדי לאפשר התאוששות של בעלי חיים לאחר הניתוח.
  3. חותכים חתיכות מלבני של נייר סינון איכותי תאית (4 ס מ x 3 ס"מ, ראה טבלה של חומרים).
  4. רטוב 2 חתיכות נייר סינון איכותי תאית בפתרון MS-222 0.02% ולמקם אותם מתחת למיקרוסקופ ויבתר.
  5. להרים ראשן ממיכל, לטבול אותו לתוך הפתרון בהרדמת. החיה העוצר שחייה בתוך 2-4 דקות, אינו מגיב לגירויים מכני חלה באותה רמת הזנב באמצעות פינצטה.
  6. במקום הראשן anesthetized על החלקים מלבני של נייר סינון. מקם את החיה עם הצד הגבי שלו פונה כלפי מעלה, כך ניתן לאבחן מבנים במוח.
    1. באמצעות מספריים vannas (ראה טבלה של חומרים) חותכים עצבי הריח אחת או את שתיהן (בהתאם לסוג assay לפועל). Transect עצב יחיד לניסויים הדורשים בקרה פנימית של עצב פציעה.
    2. לניסויים התנהגותיים, transect שני עצבים במטרה לדכא כל המידע odorant להגיע אל הנורה הריח. היעילות של חלוקתה של עצבים הריח יכול להיות שנצפו בקלות מתחת למיקרוסקופ ויבתר; אולם, עמדה פיגמנטציה או בעל חיים יכול להיות הגבלת גורמים.
      הערה: (אופציונלי) הדרך הטובה ביותר כדי לאשר את החוקיות של ההליך משתמש ראשנים הטרנסגניים המבטאים פלורסנט כתבים על מערכת העצבים שלהם (ראה תוצאות נציג). לכוונה זו, יש צורך להשתמש טווח לנתיחה מצויד קרינה פלואורסצנטית (איור 1). אם רק חיות פראי-סוג זמינים, יכול להיות מועסק העקיבה עם ס מ- diI. פעלתי לפי הנהלים 2 (ראה להלן) כדי להזריק פתרון 0.5 מ"ג/מ"ל של ס מ- diI המבושלות 0.3 M סוכרוז בטיל האף לראות 16 לקבלת פרטים על אופן ההכנה ואחסון של ס"מ-diI. דליפה של צבע מתוך החלל העיקרי חייב להיות מזער. לכוונה זו, יש צורך לשנות את הלחץ של הזרקה של הפתח של micropipettes. קרינה פלואורסצנטית ברמה של השכבה glomerular של הנורה הריח הופך ברור 24 שעות לאחר היישום של ס מ- diI. העבודה הנוכחית משתמשת תיוג עם ס מ- diI רק כדי לאשר את ההליך חיתוך; עם זאת, שיטה זו יכול לשמש גם כדי להשיג מידע מורפולוגי של חוש הריח glomeruli באמצעות הליכים היסטולוגית קונבנציונלי.
  7. העברת בעלי חיים למיכל השחזור. ראשנים יחלים שחייה רגילה בתוך ~ 10 דק. ביצוע חקירה מעמיקה לנוכחות של שטפי דם, אשר צפויים ~ 1% של בעלי חיים נתון לניתוח.
  8. המתת חסד בעלי חיים פצועים בפתרון MS-222 0.2%.

2. תיוג של קולטני ריח נוירונים עם סידן פלורסנט אינדיקטורים

  1. להכין פתרון המכיל 12% סידן ירוק-1-לתוספי (ראה טבלה של חומרים), 0.1% טריטון X-100, ו- 1 מ מ NaCl17. אחסן את הפתרון ב-20 ° C או ב- 80 ° C אם זה לא נועד לשמש בתוך חודש.
  2. להתכונן פיפטות זכוכית עם עצה פתחים ~ 1-2 מיקרומטר (דומה קוטר כדי microelectrodes המשמש עבור תיקון-קלאמפ ניסויים) microinjection באמצעות של פולר micropipette (ראה טבלה של חומרים).
  3. כיילו את עוצמת הקול של microinjections. באמצעות מים מזוקקים, להתאים לחץ וזמן הזרקת על מנת לקבל זריקה כרכים של 0.15 – 0.3 µL.
    הערה: הליך פשוט מורכב ב ספירת מספר פולסים הנדרש כדי לרוקן פיפטה מלא 1 µL של מים. פרמטרים טיפוסי הם בלחץ של זמן הזרקת 30 psi ו 50 מילישניות.
  4. מניחים על פיפטה microinjector, לטעון אותו עם ~ 2 µL של פתרון ירוק-1 לתוספי סידן.
  5. להכין את ראשן ביצוע השלבים 1.1 ל 1.6.
  6. להעביר את קצה פיפטה לתוך חלל העיקרי של הקפסולה האף.
    הערה: ראה איור 2A המתארת את המיקום של חוש הריח מסלולים ב ראשן צפרדע רפואית.
  7. באמצעות הגדרות שהושג ב- 2.3, לספק כמה פחזניות. להגביל את צבען נוכחות הקפסולה האף.
  8. תן הראשן לנוח במשך 2-3 דקות באמצעות פיפטה של פסטר, למזוג טיפות של 0.02% פתרון MS-222 על החלקים יותר סימטרית של החיה כדי למנוע ייבוש.
  9. העברת החיה למיכל השחזור.
    הערה: זה אמור להחלים שחייה רגילה בתוך ~ 10 דק מניפולציה של בעלי החיים עלול לגרום לפציעות.
  10. המתת חסד ראשנים לא לשחזר שחייה רגילה התנהגות 15 דקות לאחר ההזרקה באמצעות פתרון MS-222 0.2%.
  11. להתבונן פלורסצנטיות ברמה של השכבה glomerular של הנורה הריח ביום לאחר ההזרקה.

3. הכנה של ראשנים חיים הדמיה של תגובות Presynaptic

  1. 24-48 שעות לפני ביצוע הניסוי, מעיל 4-6 צלחות פטרי של 35 מ מ קוטר עם סיליקון אלסטומר (למשל, Sylgard). ברגע אלסטומר יש polymerized, לפברק לבאר מלבני כדי להתאים את הראשן.
    הערה: ממדים אופייני עבור ראשנים X. tropicalis נמצאו בשלבים NF 48-52 הם 10 מ מ x 4 מ מ.
  2. הכן 100 מ של 160 מיקרומטר לפתרון חומצת אמינו 1 מ מ, מתנהג כמו הגירוי odorant על ראשנים. הפתרון יכול להכיל תערובת של מספר חומצות אמינו: מתיונין, לאוצין, היסטידין, ארגינין, ליזין. לדלל חומצות אמינו בפתרון צפרדע רפואית רינגר, המורכב (במ מ): 100 NaCl, 2 אשלגן כלורי, 1 CaCl2, 2 MgCl2, גלוקוז 10, 10 HEPES, 240 mOsm/kg, pH 7.8. ודא שכי ה-pH נשמר ב- 7.8.
  3. למלא מאגר מוגברות של 20 מ"ל של הפתרון חומצת אמינו. להתחבר למאגר פוליאתילן אבובים על צינור קפילרי 28 גרם (ראה טבלה של חומרים) הממוקמת מעל הקפסולה האף.
    הערה: צינור קפילרי מותקן על micromanipulator (ראה טבלה של חומרים). בועות האוויר חייב להיות נעדר מן המערכת זלוף.
  4. להשיג דיוק טמפורלית ביישום הפתרון חומצת אמינו באמצעות הפקד לוגיקה (TTL) טרנזיסטור-טרנזיסטור של ברזים צביטה (ראה טבלה של חומרים). ממריץ משמש להפקת פולסים TTL (ראה טבלה של חומרים). בדוק את הדיוק הטמפורלי כדי לספק את הפתרון odorant על-ידי שינוי משך הזמן של פולסים TTL, כלומר., 0.1 עד 1 s.
  5. למלא אחר מאגר מוגבה עם 100 מ של תמיסת רינגר צפרדע רפואית .
  6. עזים ומתנגד ראשן והצב אותה מתחת למיקרוסקופ ויבתר (שלבים 1.1 ל 1.6).
  7. היכונו ראשן הדמיה. אם לבקן ראשנים זמינים והמשך לשלב 3.9, אחרת הסרת העור מעל הנורה הריח מכיוון שהוא מכיל מלנוציטים שפוגעים הדמיה (שלב 3.8).
    הערה: קיימות שתי דרכים לביצוע הניסוי בהתאם הפיגמנטציה של החיה. עדיף להשתמש בבעלי חיים לבקנים. הלבקן זנים הינם זמינים עבור X. laevis , קווים X. tropicalis הלבקן לאחרונה נוצרו על-ידי CRISPR-Cas9 12 או TALENs18.
  8. באמצעות מספריים vannas, עושים חתך לרוחב על העור ראשן בקצה של מערכת העצבים המרכזית. להפוך החתך צריכה להיעשות ברמה של הנורה הריח, מגיעים לעולם את המיקום של tectum, אשר ניתן לזהות בקלות לפי המיקום של עצב הראייה.
  9. צובטים את העור לחתוך באמצעות פינצטה ותעביר אותו מעל מערכת העצבים. ודא הסרה מוצלחת בהעדרה של מלנוציטים מעל הנורה הריח. לשמור על לחות החיה על ידי שפיכת טיפות של 0.02% MS-222 הפתרון באמצעות פיפטה של פסטר.
  10. מקם את הראשן לתוך הבאר של המנה מצופה (ראה טבלה של חומרים). לשים על coverslip הזכוכית מצופה עם גריז ואקום גבוה מעל בעל החיים. מקם את coverslip כדי לכסות את החלק העליון של tectum עד הסוף של הזנב.
  11. להבטיח הריח הנורה ואת placodes יישארו חשופים המדיום חוץ-תאית. שמור את הראשן משותק במהלך דימות. למלא את צלחת פטרי עם solutioncontaining 100 מיקרומטר tubocurarine צפרדע רפואית רינגר (ראה טבלה של חומרים) כדי למנוע התכווצות שרירים.
    הערה: Tubocurarine מאוחסן ב- aliquots ב- 80 ° C יותר מאשר 6 חודשים.
  12. מקם את המנה מחזיקה הראשן תחת מיקרוסקופ זקוף. להתחבר למאגר המכיל תמיסת רינגר צפרדע רפואית עם המנה באמצעות צינורות פוליאתילן (ראה טבלה של חומרים) עבור זלוף רציפה של תמיסת רינגר צפרדע רפואית כדי לשמור את החיה בחיים זמן > 1 h.
    הערה: מיני סוגרים מגנטיים (ראה טבלה של חומרים) שימושיות מאוד להתחבר לצנרת stably למנה. צינורות זלוף, שאיבה חייבת להיות ממוקמת בזווית ~ ב- 180°.
  13. התחל פרפוזיה תמיסת רינגר צפרדע רפואית . לשמור על הרמה של הפתרון בקבוע המנה לאורך כל הניסוי. להעריך ללא הפסקה ראשן הכדאיות על ידי התבוננות דרך כלי הדם.

4. חיים הדמיה של Presynaptic Ca2 + שינויים Glomeruli חוש הריח

הערה: ההליך הדמיה מתואר עבור מיקרוסקופיית שדה רחב אבל יכול בקלות להתאים מיקרוסקופ קונפוקלי על-ידי התאמת ההגדרות רכישה. הדמיה צריכה להתבצע במיקרוסקופ זקוף רכוב על טבלת אנטי רטט.

  1. דמיינו את הראשן עם יעד הגדלה נמוכה, למשל 5 x.
  2. הזז את הצירים micromanipulator כדי למקם את נימי אספקת הפתרון odorant בראש כמוסה באף אחת ויוצרים זווית 90 מעלות עם עצב הריח. יש להימנע הזרימה של פתרון odorant מעל הנורה הריח כי זה יכול לגרום turbulences המטים הדמיה.
  3. למצוא הנורה הריח ממוקם ipsilaterally הקפסולה האף (בכפוף גירוי) שימוש בהגדלה גדולה, זמן ומרחק עבודה, מים טבילה המטרה: 60Xx, 0.9 נ. א
  4. בדוק את פליטת קרינה פלואורסצנטית לפי העין. מבנים glomerular צריך להיות ברור (איור 2B).
  5. לבצע רכישה בשידור חי עם מצלמה מתאימה עבור הדמיה סידן. להגדיר תיבה המכילה את הנורה הריח כולה, בדרך כלל של 256 x 256 או 512 x 512 פיקסלים. קבוצת הרכישה קצב רכישת מסגרת ל 20 – 40 הרץ. להתאים את הרווח, כך שהערכים של זריחה הבזליים הם ~ 20% של רוויה. רוכשים וידיאו s 5.
  6. דמיינו את הסרט. בדוק המוקד תמונה, העדר תנועה חפצים ואזורים הכוללת פיקסלים רוויים. קרינה פלואורסצנטית טיפוסי ערכים של אזורים glomerular צריך להיות של 5,000-20,000 א"א אם בעזרת מצלמה 16 סיביות. המשך לשלב הבא אם תנאי ההדמיה הם אופטימליים. חזור על שלב 4.6 במידת הצורך כדי לשפר את איכות התמונה או לכוונן הגדרות רווח.
  7. להתחיל עם רכישת זמן לשגות לרשום תגובות עורר על ידי גירויים חוש הריח.
    הערה: יישום מדויק של הפתרון odorant נשלטת על ידי גירויים TTL. ניסוי טיפוסי מכיל נקודה בסיסית של 4 s, ולאחריו גירוי פעמים ועד 0.1 0.5 s ותקופת ההתאוששות של ש' 6-10.
  8. בצע stimulations חוזרות של odorants עבור מרווחי זמן > 2 דק להגדיר קצב הזרימה 1 – 1.5 mL·min-1. מאז זלוף העולמי נמצא במהלך כל ניסויים, חומצות אמינו מקומית יישומית נשטפים.
    הערה: אמצעי האחסון של פתרון בצלחת נמצא ~ 3 מ.
  9. ניתוח תמונות
    1. זיהוי של תגובות
      1. לייצא סרטים ImageJ.
        הערה: המטרה היא גילוי הנוכחות של אזורים glomerular להגיב לגירויים.
      2. להפוך את רצף תמונות פלורסצנטיות לסרט ΔF/F0 raw. למדוד את השינויים בזריחה הבזליים לפי היחס הבא: (F-F0) /F0, איפה F0 מציין רמות קרינה פלואורסצנטית הבסיס.
      3. לצייר אזורים מעניינים (ROI) מסביב לאזורים מציג בשם זריחה עולה במהלך גירוי ולהקליט את עמדתם במנהל ROI (איור 2E). ציירו רועי כדי לזהות רמות קרינה פלואורסצנטית רקע באזור נטול glomerular מבנים.
    2. כימות של תגובות.
      1. המקום ROIs מוגדרים ברצף פלורסצנטיות תמונות raw. להשיג ערך האפור אכזרי של ROIs שנבחר לכל מסגרת. להעביר את הרצף של הערכים שהתקבלו לתכנית ניתוח (למשל., איגור Pro).
      2. להחסיר רקע זריחה ולאחר מכן לחשב ΔF/F0 שינויים עבור כל רועי (איור 2F). להתוות את העליות ΔF/F0 עבור כל אחד ROIs שנבחרו. חישוב סטיית התקן של ΔF הבסיס/F0 (לפני גירוי).
        הערה: תגובה חיובית נחשבת אם העלאות ΔF/F0 שהתקבל במהלך גירוי הם גדולים יותר מאשר 2 סטיות תקן של ערכי הבסיס.

5. חוש הריח מונחה התנהגות Assay

הערה: תרשים סכימטי של ההתקנה עבור ביצוע וזמינותו מוצג באיור3.

  1. לעשות חורים קטנים כדי להתאים מ"מ 1.57 יתר x מ מ 1.14 זהות אבובים בחלק העליון של כל טוב של מנה 6-. טוב. הוסף את הצנרור. ואחתום באמצעות דבק אפוקסי (ראה טבלה של חומרים).
    הערה: המנה שונה יכול להיות שימוש חוזר פעמים רבות לאחר שטיפה יסודית במים מזוקקים.
  2. להכין 50 מ של פתרון חומצת אמינו המכילה מתיונין, לאוצין, היסטידין, ארגינין, ליזין (ראה שלב 3.2 לפרטים). ריכוז יכול לנוע בין 160 מיקרומטר עד 1 מ מ. מקום 20 מ"ל של הפתרון מאגר מוגברות.
  3. אל תאכילו ראשנים במשך לפחות 12 שעות לפני וזמינותו. לקחת את הראשנים 6 ממיכל הדיור שלהם ולמקם אותם ב 2 ל' מים נקיים ראשן כדי למזער את החשיפה odorants.
  4. במקום המנה המתוקנת 6 בארות על לבן LED-transilluminator (איור 3).
  5. כמה את אינלטס זלוף למאגר המים המכיל את הפתרון חומצת אמינו באמצעות יריעה של (ראה טבלה של חומרים). בדוק את מערכת זלוף, לחסל בועות אוויר. למלא את הבארות 6 בו זמנית. להתאים את הגובה של המאגר כדי לאפשר מסירת מ ≥5 ל odorant פתרון בתוך ~ 30 s.
    הערה: לשטוף היטב 4 פעמים עם מים מזוקקים זוגי לאחר חשיפה הפתרון odorant.
  6. למלא כל אחד עם 10 מ"ל מים ראשן. 1 מקום ראשן/טוב. חופשה לנוח > 3 דקות.
  7. להגדיר ייבוא תמונות. השתמש מצלמת CCD קונבנציונלי כי ניתן לרכוש תמונות ב ≥5 הרץ. לחבר המצלמה למחשב. . הנה, תשתמש מצלמה Zeiss MRC5 נשלט על ידי זן תוכנה אבל תצורות אחרות שוות ערך יכול לשמש. אם יש צורך להגביר את קצב המסגרות, להחיל פיקסל binning. תמונות צריך להראות המנה כל 6-ובכן.
  8. התחל ייבוא תמונות כאלה מכילים סרטים הבזליים (30 s), גירוי (25 – 35 s) ותקופות התאוששות (30 – 60 s).
  9. להחזיר חיות מתוך קערה בארות 6 טנקים לאחר דימות.
  10. לנתח סרטים ImageJ באמצעות תוספים כגון wrMTrck19,20 המספקים פרמטרים מרובים משויך תנועתיות.
  11. כדי להכין תמונות לניתוח, בחר תחילה לבאר על ידי ציור של רועי מלבני של 35 מ"מ x 35 מ"מ (איור 4א). להשיג תמונת רקע על-ידי חישוב של תמונה מוקרנת מרבי של כל רצף. הוא צריך להציג תמונה של הבאר ללא הראשן.
  12. להחסיר את תמונה מוקרנת מרבי מהסרט raw. לבצע קביעת סף על הסרט 32 סיביות שנוצר ולהחיל את התוסף wrMTrck. להתאים את הפרמטרים WrMTrck לעקוב בצורה אמינה תנועות בעלי חיים. להעביר את שהושג X, Y מרכזת לתוך תוכנית ניתוח.
  13. X-Y באמצעות קואורדינטות, לחשב את המרחק אוקלידי למקור odorant (כניסת זלוף הבאר), על-ידי החלת המשוואה הבאה:
    figure-protocol-1
    כאשר מערכת ההפעלה מציין את המיקום של מקור ריח ו טד מציין המיקום ראשן בזמן נתון. ראה איור 4A לפרטים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

בנייר זה, אנו מציגים שילוב של שתי גישות משלימות לבצע מחקר ויוו של הפונקציונליות של מערכת הריח של ראשן צפרדע רפואית : אני) שיטת הדמיה Ca presynaptic2 + שינויים glomeruli של החיים ראשנים באמצעות מחוון סידן פלורסנט, ii) ריח מודרכים assay התנהגותית יכול לשמש כדי לחקור את התגובה odorants waterborne ספציפיים. מאז יש כבר מועסקים גישות אלה כדי להעריך את ההתאוששות של עיבוד חוש הריח אחרי פציעה10, שיטה פשוטה עבור transecting עצבי הריח מתואר גם.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מאמר זה מתאר טכניקות שימושיות לחקור את הפונקציונליות של חוש הריח מסלולים חי ראשנים של צפרדע רפואית . בפרוטוקול הנוכחי שימושי במיוחד עבור מעבדות האלה לעבוד, או גישה צפרדע רפואית; עם זאת, זה גם מעניין עבור אלה החוקרים ללמוד הבסיסים תאית ומולקולרית של התחדשות עצביים ותיקון. התוצאות המתקבלות צפרדע רפואית יכול להיות משולב עם הנתונים שנאספו במודלים חוליות אחרים כדי לזהות מנגנון ההכפלה. בשיטות המתוארות יהנה התפתחות מהונדסים צפרדע רפואית18,2...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים y El Ministerio de Economía Competitividad (MINECO; SAF2015-63568-R) cofunded על ידי אירופה אזורי פיתוח קרן (ERDF), על ידי פרסי מחקר תחרותיים מן האחווה מ ג פ Fuortes ממוריאל, סטיבן. וו קופלר במלגת הקרן, לורה ו ארתור Colwin ניחן הקיץ מלגת קרן מחקרים , המשפחה Fischbach, קרן דור גדול של מעבדה ביולוגית ימית, את נבחרת צפרדע רפואית משאבים RRID:SCR_013731 (חור ביער, MA) שבו נערך חלק של עבודה זו. אנו מודים גם תוכנית סרקא / Generalitat דה קטלוניה לתמיכה מוסדית. א. ל הוא עמית Húnter סרה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מלחים לאקווריומים (מלח אוקיינוס מיידי)TecniplastXPSIO25R
טריקאין (אתיל 3-אמינובנזואט מתאן סולפונט)פינצטה Sigma-AldrichE10521
#5 (קצה 0.025 x 0.005 מ"מ)World Precision Instruments501985
מספריים Vannas (טיפ 0.015 x 0.015)World Precision Instruments501778
Whatman נייר סינון איכותיFisher ScientificWH3030917
X. laevis tubb2-GFPNational Xenopus Resource (NXR), RRID:SCR_013731NXR_0.0035
X.tropicalis NBT-GFPEuropean Xenopus Resource Center (EXRC) RRID:SCR_007164
CellTracker CM-DiIThermoFisher ScientificC-7001
דקסטרן ירוק סידן, מלח אשלגן, 10,000 מגה-וואט, נימיThermoFisher ScientificC-3713
סאטרמיקרו-הזרקהB100-75-10OD = 1.0 מ"מ, מזהה = 0.75 מ"מ.
PullerSutter InstrumentP-97
מיקרו-מזרקParker InstrumentsPicospritzer III
Sylgard-184Sigma-Aldrich761028-5EA
מיקרופיל מיקרופיפטותWorld Precision InstrumentsMF28G-5
מיקרוסקופ זקוףZeissAxioImager-A1
Master-8 ממריץא.מ.פ.י.
מצלמת CCDHamamatsuImage EM
שסתומי סולנואידWarner InstrumentsVC-6 מערכת
Dow Corning גריז ואקום גבוהVWR Scientific636082B
Tubocurarine hydrochlorideSigma-AldrichT2379
CCD מצלמהZeissMRC-5 מצלמהנשלטת על ידי Zen
עדשת מצלמתThorlabsMVL8ML3ישנן מספר אפשרויות שיש להתאים לדגם המצלמה המשמש
שרף אפוקסירכיבי RS סעפת
וורנר אינסטרומנטסMP-6 סעפת
מיקרומניפולטור לאספקה מקומית של פתרונותNarishigeMN-153
מיני מהדקים מגנטייםוורנר אינסטרומנטסMAG-7, MAG-6
צינורות פוליאתילןוורנר אינסטרומנטס64-0755OD = 1.57 מ"מ, תעודת זהות = 1.14 מ"מ.
בורוסיליקט Anionic למכשיר שישה ערוצים תוכנה זלוף

מקורות

  1. Hellsten, U., et al. The genome of the Western clawed frog Xenopus tropicalis. Science. 328 (5978), 633-636 (2010).
  2. Session, A. M., et al. Genome evolution in the allotetraploid frog Xenopus laevis. Nature. 538 (7625), 336-343 (2016).
  3. Zhang, L. I., Tao, H. W., Holt, C. E., Harris, W. A., Poo, M. A critical window for cooperation and competition among developing retinotectal synapses. Nature. 395 (6697), 37-44 (1998).
  4. Li, J., Erisir, A., Cline, H. In vivo time-lapse imaging and serial section electron microscopy reveal developmental synaptic rearrangements. Neuron. 69 (2), 273-286 (2011).
  5. Dietrich, H., Glasauer, S., Straka, H. Functional Organization of Vestibulo-Ocular Responses in Abducens Motoneurons. Journal of Neuroscience. 37 (15), 4032-4045 (2017).
  6. Buhl, E., Roberts, A., Soffe, S. R. The role of a trigeminal sensory nucleus in the initiation of locomotion. Journal of Physiology. 590, Pt 10 2453-2469 (2012).
  7. Junek, S., Kludt, E., Wolf, F., Schild, D. Olfactory coding with patterns of response latencies. Neuron. 67 (5), 872-884 (2010).
  8. Stout, R. P., Graziadei, P. P. Influence of the olfactory placode on the development of the brain in Xenopus laevis (Daudin). I. Axonal growth and connections of the transplanted olfactory placode. Neuroscience. 5 (12), 2175-2186 (1980).
  9. Yoshino, J., Tochinai, S. Functional regeneration of the olfactory bulb requires reconnection to the olfactory nerve in Xenopus larvae. Development, Growth & Differentiation. 48 (1), 15-24 (2006).
  10. Terni, B., Pacciolla, P., Masanas, H., Gorostiza, P., Llobet, A. Tight temporal coupling between synaptic rewiring of olfactory glomeruli and the emergence of odor-guided behavior in Xenopus tadpoles. Journal of Comparative Neurology. 525 (17), 3769-3783 (2017).
  11. Goda, T., et al. Genetic screens for mutations affecting development of Xenopus tropicalis. PLOS Genetics. 2 (6), 91(2006).
  12. Nakayama, T., et al. Simple and efficient CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis in Xenopus tropicalis. Genesis. 51 (12), 835-843 (2013).
  13. Jafkins, A., Abu-Daya, A., Noble, A., Zimmerman, L. B., Guille, M. Husbandry of Xenopus tropicalis. Methods in Molecular Biology. 917, 17-31 (2012).
  14. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early Development of Xenopus laevis. A Laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
  15. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal table of Xenopus laevis (Daudin). A systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , North-Holland Publishing Company. Amsterdam. (1956).
  16. Xu, H., Dude, C. M., Baker, C. V. Fine-grained fate maps for the ophthalmic and maxillomandibular trigeminal placodes in the chick embryo. Developmental Biology. 317 (1), 174-186 (2008).
  17. Friedrich, R. W., Korsching, S. I. Combinatorial and chemotopic odorant coding in the zebrafish olfactory bulb visualized by optical imaging. Neuron. 18 (5), 737-752 (1997).
  18. Ishibashi, S., Cliffe, R., Amaya, E. Highly efficient bi-allelic mutation rates using TALENs in Xenopus tropicalis. Biology Open. 1 (12), 1273-1276 (2012).
  19. Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).
  20. Nussbaum-Krammer, C. I., Neto, M. F., Brielmann, R. M., Pedersen, J. S., Morimoto, R. I. Investigating the spreading and toxicity of prion-like proteins using the metazoan model organism C. elegans. Journalof Visualized Experiments. (95), e52321(2015).
  21. Koide, T., et al. Olfactory neural circuitry for attraction to amino acids revealed by transposon-mediated gene trap approach in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (24), 9884-9889 (2009).
  22. Love, N. R., et al. pTransgenesis: a cross-species, modular transgenesis resource. Development. 138 (24), 5451-5458 (2011).
  23. Tandon, P., Conlon, F., Furlow, J. D., Horb, M. E. Expanding the genetic toolkit in Xenopus: Approaches and opportunities for human disease modeling. Developmental Biology. 426 (2), 325-335 (2017).
  24. Pratt, K. G., Khakhalin, A. S. Modeling human neurodevelopmental disorders in the Xenopus tadpole: from mechanisms to therapeutic targets. Disease Models & Mechanisms. 6 (5), 1057-1065 (2013).
  25. Truszkowski, T. L., et al. Fragile X mental retardation protein knockdown in the developing Xenopus tadpole optic tectum results in enhanced feedforward inhibition and behavioral deficits. Neural Development. 11 (1), 14(2016).
  26. Hassenklöver, T., Manzini, I. Olfactory wiring logic in amphibians challenges the basic assumptions of the unbranched axon concept. Journal of Neuroscience. 33 (44), 17247-17252 (2013).
  27. Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Li, Z., Cline, H. T. Single-cell electroporation for gene transfer in vivo. Neuron. 29 (3), 583-591 (2001).
  28. Sild, M., Van Horn, M. R., Schohl, A., Jia, D., Ruthazer, E. S. Neural Activity-Dependent Regulation of Radial Glial Filopodial Motility Is Mediated by Glial cGMP-Dependent Protein Kinase 1 and Contributes to Synapse Maturation in the Developing Visual System. Journal of Neuroscience. 36 (19), 5279-5288 (2016).
  29. McDiarmid, R., Altig, R. Tadpoles: The biology of anuran larvae. , The University of Chicago Press. 149-169 (1999).
  30. Heerema, J. L., et al. Behavioral and molecular analyses of olfaction-mediated avoidance responses of Rana (Lithobates) catesbeiana tadpoles: Sensitivity to thyroid hormones, estrogen, and treated municipal wastewater effluent. Hormones and Behavior. 101, 85-93 (2018).
  31. Gaudin, A., Gascuel, J. 3D atlas describing the ontogenic evolution of the primary olfactory projections in the olfactory bulb of Xenopus laevis. Journal of Comparative Neurology. 489 (4), 403-424 (2005).
  32. Scheidweiler, U., Nezlin, L., Rabba, J., Müller, B., Schild, D. Slice culture of the olfactory bulb of Xenopus laevis tadpoles. Chemical Senses. 26 (4), 399-407 (2001).
  33. Manzini, I., Schild, D. Classes and narrowing selectivity of olfactory receptor neurons of Xenopus laevis tadpoles. Journal of General Physiology. 123 (2), 99-107 (2004).
  34. Kludt, E., Okom, C., Brinkmann, A., Schild, D. Integrating temperature with odor processing in the olfactory bulb. Journal of Neuroscience. 35 (20), 7892-7902 (2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

דימות בחי (In Vivo)הפקעת הריחדימות סידןבדיקות התנהגותיותכריתת עצברפורטרים של GFPחיווט סינפטי מחדשגירויי חומצות אמינו
הערכה תפקודית של חוש הריח מסלולים ב ראשנים של צפרדע רפואית חי
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.