הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

ביולוגיה של התא כמותית של הקשורים ניוון מוחיים ב דרוזופילה דרך ניתוח לא משוחדת של חלבונים מתויגות Fluorescently באמצעות ImageJ

10.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/58041

⸱

3 באוגוסט 2018

 ,  ,  , 
1Department of Molecular and Cellular Pharmacology, University of Miami Miller School of Medicine, 2School of Pharmacy, Key Laboratory of Molecular Pharmacology and Drug Evaluation (Yantai University), Ministry of Education, Collaborative Innovation Center of Advanced Drug Delivery System and Biotech Drugs in Universities of Shandong, Yantai University

במאמר זה

סיכום

פיתחנו זרימת עבודה פשוטה וישימה לחלץ נתונים כמותיים במחקרים ביולוגיים תא המבוססות על ידי קרינה פלואורסצנטית-הדמיה של צבירת חלבון, שטף autophagic במערכת העצבים המרכזית דגמי דרוזופילה הקשורים ניוון מוחיים.

תקציר

עם עליית השכיחות של מחלות ניווניות, חשוב יותר ויותר להבין פתופיזיולוגיה כבסיס שמוביל בתפקוד עצביים ואובדן. כלי דימות מבוססות קרינה פלואורסצנטית וטכנולוגיות לאפשר ניתוח חסר תקדים של תהליכים הנוירוביולוגי subcellular, אך עדיין יש צורך גישות לא משוחדת, הדירים נגיש עבור חילוץ מידע כמיתים הדמיה מחקרים . פיתחנו זרימת עבודה פשוטה וישימה לחלץ נתונים כמותיים מבוסס על-ידי קרינה פלואורסצנטית מחקרי הדמיה באמצעות מודלים דרוזופילה הקשורים ניוון מוחיים. באופן ספציפי, אנו מתארים גישה easy-to-בצע, חצי אוטומטיות באמצעות פיג ' י/ImageJ לנתח שני תהליכים תאיים: קודם כל, אנחנו לכמת חלבון צבירה ותוכן הפרופיל באונה אופטיים דרוזופילה באמצעות מוטציה מתויג פלורסנט huntingtin חלבונים; שנית, נוכל להעריך autophagy-ליזוזום השטף במערכת דרוזופילה חזותית עם מבוססי רציומטרי כימות של עיתונאי פלורסנט טנדם autophagy. חשוב לציין, פרוטוקול שמפורטות כאן כולל צעד פילוח חצי אוטומטי כדי להבטיח שמבנים פלורסנט כל מנותחות כדי למזער את הטיית בחירה וכדי להגדיל את הרזולוציה של השוואות עדין. גישה זו ניתן להרחיב לניתוח של מבנים ביולוגיים אחרים תאים, תהליכים מעורבים הקשורים ניוון מוחיים, כגון puncta proteinaceous (מתח בגרגרים, מתחמי סינפטית), כמו גם כמו קרום מאוגד תאים (המיטוכונדריה, קרום. שלפוחית סחר בבני אדם). שיטה זו מספקת סטנדרטית, אך הפניה וישימה הצבע עבור ניתוח תמונות ו כמת, יכול להקל על אמינות ועל הפארמצבטית לחצות את השדה ואת בסופו של דבר לשפר את ההבנה מכניסטית של הקשורים ניוון מוחיים.

מבוא

מחלות ניווניות משפיעות על מיליוני אנשים מדי שנה ועל השכיחות עולה עם אוכלוסייה הזדקנות1. בעוד כל מחלות ניווניות יש אטיולוגיה ייחודי, צבירה של חלבונים misfolded של התמוטטות של הרשת פרוטוסטאזיס חדישים נפוצות פתולוגיים רבים של מחלות אלו. שחקרתי כיצד הפרעה של תהליכים אלה לתקצב ויסודי משתבשת לתרום למוות בתפקוד של תאים עצביים חיוני להבנת מחלות ניווניות, כמו גם המנחה התערבויות טיפוליות. דימות מבוסס על קרינה פלואורסצנטית מאפשר לחקירה של תהליכים אלה מורכבים ודינאמיים בנוירונים והוא תרם רבות להבנת הביולוגיה דופאמינרגיים. ניתוח של חלבונים מתויגות fluorescently הוא מאתגר, במיוחד כאשר הניסויים מתבצעים ויוו, עקב רקמות קומפקטית מאוד, סוגי תאים שונים, והטרוגניות מורפולוגי. כימות באופן ידני בסיוע במחיר נוח ולא פשוטה, אך היא לעתים קרובות ועתירת בכפוף נטאי אנושי. לכן, אין צורך גישות לא משוחדת, הדירים נגיש עבור חילוץ מידע כמיתים הדמיה מחקרים.

אנחנו המחולקות זרימת עבודה פשוטה וישימה באמצעות פיג ' י/ImageJ, תמונת עוצמה ונגיש באופן חופשי עיבוד תוכנה2,3, כדי לחלץ נתונים כמותיים מלימודי הדמיה פלורסצנטיות ניסיוניות של הקשורים ניוון מוחיים באמצעות דרוזופילה. לפי פרוטוקול זה לכמת צבירת חלבון, שטף autophagic — שני תאים תכונות ביולוגיות שאינן רלוונטיות גבוהה לפתולוגיה מחלות ניווניות — להדגים את הרגישות ואת הפארמצבטית של גישה זו. ניתוח של חלבונים huntingtin מוטציה fluorescently מתויג (Htt) באונה אופטיים דרוזופילה גילה את מספר, גודל, ואת האינטנסיביות של אגרגטים חלבון. אנו דמיינו, עיתונאי פלורסנט טנדם השטף autophagic בתוך מערכת הראייה דרוזופילה , אשר מציג אותות פליטה שונים בהתאם לסביבה compartmental4. ניתוח המבוסס על רציומטרי של הכתב טנדם המותר עבור תצוגה כמותיים ומקיף של השטף autophagy-ליזוזום autophagosome היווצרות, התבגרות, תחבורה כדי השפלה ליזוזום, בנוסף מודגשות. פגיע תאים בהתנאים ניווניות. חשוב, הן בניתוח לנו ליישם סף חצי אוטומטיות והשלבים פילוח פרוטוקול שלנו כדי לצמצם הטיה לא מודעת, להגדיל את כוח דגימה, מספקות תקן כדי להקל על השוואות בין מחקרים דומים. זרימת עבודה פשוטה נועד להפוך עוצמה תוספים פיג ' י/ImageJ (שפותחה על ידי מדעני מחשב מבוסס על אלגוריתמים מתמטיים) נגיש יותר neurobiologists ולקהילה מדעי החיים בכללותו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. שיקולים וההכנות עבור תכנון הניסוי ניתוח תמונה

  1. Predetermine נייד אנטומיים, מתאים, או סמנים subcellular לשמש ציוני דרך עבור סטנדרטיזציה של אזור בעל עניין (ROI) מדגמים שונים, לדוגמה 4', 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי), סמני ממברנה, פלורסנט לשפות אחרות חלבון, וכו '.
  2. בחר בסמן פלורסנט המפרידים puncta דיסקרטית מעבר רמות הרקע למבנה של ריבית.
    הערה: פרוטוקול זה ממוטב מבנים proteinaceous (למשל, אגרגטים חלבון misfolded), קרום מכורך organelles (למשל, כתב autophagy). כדי להמחיש צבירת חלבון, שבר מתויג RFP N-מסוף של חלבון Htt אנושי עם חבל polyQ פתוגניים חזרה 138 (RFP-hHttQ138) היה בשימוש5. מוטציה בחלבון Htt טפסים אגרגטים cytoplasmic כשאני לידי ביטוי תחת עצביים מנהלי התקנים ספציפיים כגון elav-GAL45,6. כדי להמחיש autophagosome-ליזוזום השטף, שימש אקטין-GAL4 לנהוג ubiquitously ביטוי של הכתב mCherry-GFP-Atg8a טנדם. puncta mCherry - וה-GFP-חיוביים מצביעים על autophagosomes, השטף מנוטר כמו GFP פלורסצנטיות הוא מתרצה בסביבה חומצית של ליזוזום, איפה mCherry חומצה-רגישות נשאר עד החלבון מפורק7. לניתוח רציומטרי, ערוץ אחד זה מהווה סמן עקבית של המבנה שניתן משמש פילוח או במידת הצורך שתחזית של שניים או יותר ערוצים יכול לשמש כדי ניסחו מבנים, אבל לא שתואר במפורש ב פרוטוקול זה. בדוגמה זו, mCherry משמש עבור פילוח של חלקיקים Atg8-חיובית, כפי שהוא חסר חומצה-רגישות יישארו בתא ברחבי שטף דרך בשביל.
  3. להוריד ולהתקין קוד פתוח התמונה ניתוח בפלטפורמת ImageJ או פיג'י — ההתפלגות המועדפת של ImageJ עם ארוזות תוספים2,3.
  4. התקן את התוסף עבור h-maxima אינטראקטיבי קו פרשת המים.
    הערה: פרוטוקול זה משתמשת פיג'י; תוספים נוספים עשויות להידרש ImageJ. התוסף שפותחה על ידי בנואה Lombardot עבור SCF-MPI-CBG הוא זמין באינטרנט (https://imagej.net/Interactive_Watershed).
  5. נווט אל "עזרה | עדכן', בחר 'ניהול עדכון אתרים' מ "המעדכן ImageJ," בחר SCF-MPI-CBG עדכון האתר מהרשימה, ואז לסגור ולהפעיל מחדש פיג'י.

2. המוח לנתיחה, Immunofluorescence מכתים

  1. להפוך סיליקון לנתיחה מצופה elastomer מנות.
    1. שופכים סיליקון elastomer רכיבים לתוך גביע כמצוין על-ידי היצרן ומערבבים היטב עד ביסודיות מעורב.
    2. השתמש פיפטה למילוי 5 ס מ תרביות רקמה מנות שליש עד חצי מלאה (בערך 10 מ"ל של אלסטומר תערובת). לאפשר בועות לעלות אל פני השטח ולהסיר בעדינות עם נייר טישיו. לכסות את הכלים ומניחים על משטח רמת לרפא עבור 48-72 שעות בטמפרטורת החדר (RT).
  2. לנתח דרוזופילה במוח, ואת מערכת הראייה במידת הצורך.
    1. לבצע ניתוח מוחי דרוזופילה כפי שתואר לעיל8,9. לבצע את הקרע במאכלים לנתיחה מצופה elastomer, שימוש של התחתון elastomer לייצב את המוח כדי למנוע נזק לרקמות או מלקחיים.
    2. כדי לשמור על הנדן שלם במהלך ניתוח, שקופיות מלקחיים שני מתחת הרשתית, לקרוע בעדינות דרך האמצע של העין כדי להסיר את הרשתית. למשוך משם כל רקמת רשתית המצורפת הנדן עם מלקחיים שנערך במקביל למשטח פרופריה.
      הערה: פיגמנט שיורית ייעלמו בכביסה בשלבים הבאים, בדרך כלל אינם מפריעים עם נוגדן מכתים והדמיה.
    3. לדלל 37% פורמלדהיד בתוך תמיסת מלח באגירה פוספט (PBS) כדי להפוך ריכוז סופי של 3.7% טרי לפני השימוש בצינור microcentrifuge 500 µL. להעביר את המוח גזור microcentrifuge צינור עם פתרון, תקופת דגירה של 15 דקות ב RT עם נדנדה עדין.
      הערה: פורמלדהיד יש נטייה טבעית להיות מחומצן, בהפקת חומצה פורמית. לכן, הוא הציע aliquot 37% פורמלדהיד לאחסון לדלל 3.7% טרי לפני כל שימוש. קיבוע יתר או תת קיבוע ישפיעו על היושרה של רקמות, קרינה פלואורסצנטית10.
    4. תשטוף 3 פעמים עם PBTx (PBS עם 0.4% טריטון X-100) למשך 15 דקות כל אחד.
  3. לבצע אימונוהיסטוכימיה והר דגימות.
    1. אם הנוגדן מכתים נחוצה, להסיר PBTx להוסיף נוגדן ראשוני מדולל ב PBTx עם סרום עז רגילה 5%, דגירה על מיקסר aliquot בין לילה ב 4 º C.
    2. הסר נוגדן ראשוני, לשטוף 3 פעמים עם PBTx למשך 15 דקות כל אחד. הוספת נוגדנים משניים מדולל ב PBTx עם סרום עז רגילה 5% ו תקופת דגירה של 1 h RT או לילה ב 4 º C. לשטוף 3 פעמים עם PBTx למשך 15 דקות כל אחד.
    3. אם נדרשת דאפי מכתים, להסיר PBTx, להוסיף פתרון דאפי (במניה פתרון: 5 מ"ג/מ"ל, לדלל את ריכוז העבודה של µg/mL 15 ב- PBTx), דגירה 10 דקות בשטיפת RT. 3 פעמים עם PBTx למשך 15 דקות כל אחד.
    4. כדי לנקות את הרקמה, במקום טיפה של הרכבה בינונית במרכז שקופית מיקרוסקופ עם כרווח של שכבה אחת של הסרט השקוף משני הצדדים. להעביר את המוח על גבי הירידה של הרכבה בינונית ולאחר לחכות 1-2 דקות עד המוח הופך שקוף. הסר בזהירות את המדיום הרכבה עם פיפטה.
    5. כדי לטעון, החל טיפה של הרכבה טרי בינוני אל המוח בשקופית. בזהירות כיסוי זכוכית מכסה הימנעות בועות. לאטום את הקצוות עם דבק גומי, מילה נהדרת-RT במשך 20 דקות להמשיך כדי ייבוא תמונות לקבלת התוצאות הטובות ביותר.

3. ייבוא תמונות

  1. למטב את המיקרוסקופ רכישה פרמטרים, כולל רזולוציה מרחבית, אובייקטיבי, זום, סריקה מהירות, וצעד גודל, כדי להגדיל את הרזולוציה של המבנים עניין כדי להקל על פילוח אוטומטית למחצה במהלך ניתוח תמונות.
    הערה: זה עשוי להיות שימושי כדי ללכוד תמונה לדוגמה ובדוק פילוח חצי אוטומטיות (בשלב 5 של הפרוטוקול) לפני הדמיה כל דוגמאות ניסיוני. בדרך זו המשתמש יכול לשנות הגדרות הדמיה כך כלים אנליטיים ניתן בקלות להבחין המבנה הביולוגי של ריבית.
  2. כוונן פקדי תמונה גלאי כדי ללכוד את יחס אות לרעש הגבוה ביותר ואת טווח דינמי הגבוהה של הדגימה.
    1. השתמש LUT (להסתכל למעלה בטבלה) המציין פיקסל רוויה (חשיפה גבוהה מדי) או undersaturation (אופסט נמוך מדי) תוך התאמת הגדרות (איור 3B, אדום מציין פיקסל הרוויה על ידי LUT Hi/נמוך).
    2. ודא היסט ורווח הגדרות מתאימות עבור כל קבוצות הניסוי, כפי סביר ניסיוני מניפולציות לשנות את המבנה של ריבית.
      הערה: זה הכרחי כי באותן ההגדרות משמשים עבור כל קבוצות לערוך השוואות כמותית.
  3. תמונה דרך רקמות כדי ללכוד את כל הנתונים.
    הערה: מומלץ כדי ללכוד את כל הנתונים הזמינים במהלך מושב הדמיה אחד וכדי להגדיר אזור מדויקת יותר במהלך רועי הבחירה בשלב 4 במידת הצורך.
  4. שמור את התמונה סוג הקובץ נתמך על ידי תוכנת הדמיה כדי לשמר מטה-נתונים כגון רכישת פרמטרים וכיול מרחבית. לשמור את התמונה עם שם קובץ כולל נוגדנים תאריך, הרקע הגנטי או כתבים פלורסנט, ניסיוני, או צבעים המתאים ערוצי סריקה כגון _Ch1 _ [ניסוי תאריך] _ [הדגימה שם] [שם קבוצה ניסיונית]. [Fluorophore-יעד /Dye]_Ch2.[Fluorophore-target/Dye], וכו

4. ייבוא תמונה פיג ' י/ImageJ ומבחר רועי

  1. פתח תמונה בפיג'י. השתמש בתיבת הדו-שיח 'אפשרויות ייבוא ביו-תבניות', בחר "נוף מחסנית עם: Hyperstack" ולהגדיר "מצב צבע: גווני אפור".
    הערה: מומלץ לפתוח את סוג הקובץ של מיקרוסקופ, כמטא-נתונים כגון כיול מרחבית יכול לקרוא פיג'י.
  2. זיהוי אזור z-מטוס בודד או הקרנה בהתבסס על פרופיל סמן זה יכול לשמש של רועי מתוקננת על פני דגימות (איור 1, רועי בחירה).
    1. השתמש בפס הגלילה "C" כדי להציג את פרופיל להשתמש כדי ללכוד את marker(s) המיועד בשלב 1.1.
    2. השתמש בפס הגלילה "Z" כדי לעבור בין המטוסים מוקד. בחרו פרוסה אחת או ליצור תחזית של פרוסות מרובות על-ידי לחיצה על "תמונה | ערימות | פרויקט Z", קבע"התחל slice","עצור slice"כדי להקיף את רועי.
      הערה: הגדרת סוג "הקרנה" כדי "מקס בעוצמה" בפרוייקט"Z" בתיבת הדו-שיח לעיתים קרובות המתאימה ביותר כדי להדגיש מבנים עבור פילוח של סעיף 5, אבל זה עשוי לא להיות מתאים עבור כל היישומים. אם סוג נוסף של השלכה נדרשת לצורך ניתוח, לטפל כדי לשמור ולתעד את קובץ זה ככזה לחילוץ כוללים סעיף 6 או 7.
    3. ליצור תמונה חדשה המכילה את פרופיל ואת plane(s) מוקד עניין כדי לפשט את הפעולות הבאות בפרוטוקול ניתוח התמונה. בחר "תמונה | כפולים", הגדר את הרצוי"ערוצים"(ג) ואת"פרוסות"(z) ושנה את שם הקובץ כדי לשקף את הבחירה (למשל, _ _ [שם הדגימה] [קבוצה ניסיוני שם] [הניסוי date]_[Channel(s)]_[z-plane(s)]).
  3. השתמש באחת "כלי הבחירה" בסרגל הכלים פיג'י לבחירה ידנית של רועי מתוקננת בהתבסס על הקריטריונים לבחירת שנקבע בשלב 4.2.
  4. להוסיף את רועי מנהל רועי על ידי לחיצה על "נתח | כלים | רועי מנהל "ולחצו על 'הוסף' בתפריט מנהל רועי. להציל את רועי ' מתפריט ' רועי מנהל על ידי לחיצה על "יותר | שמור"ולאחר מכן שם לקובץ כדי לשקף את רועי (לדוגמה, [קבוצה ניסיוני שם] _ [שם הדגימה] _ [ניסוי תאריך] _ _ [פרופיל] [z-plane(s)] _ [רועי תיאור]).
    הערה: זה יכול להיות מחדש בפיג'י בהמשך מנתח או שניתן להחיל על ערוצים או תמונות כמו סעיף 5.3 אחרים.

5. preprocessing ואת פילוח עם h-maxima Watershedding

  1. לבצע preprocessing בערוץ להשתמש כדי ללכוד את המבנים של ריבית.
    1. אם קובץ התמונה מורכבת ערוצים מרובים, הפרד את הערוצים על ידי לחיצה על "תמונה | צבע | לפצל ערוצים"כדי לבודד את הערוץ של עניין.
    2. החל מסנן כגון מסנן החציוני כדי להקטין רעש או טשטוש לפי עקומת גאוס להחלקת על ידי לחיצה על "תהליך | מסננים | לסנן סוג"(למשל, 'סינון' חציון' או"טשטוש לפי עקומת גאוס").
      1. לטעום מסננים שונים ולסנן פרמטרים על תמונות מכל קבוצה ניסיונית. המשך דרך שלב 6.2 עם דוגמה נציג מכל קבוצה כדי לבדוק את הביצועים פילוח. בחר את המסנן ואת הגדרות המאפשרים חלוקת המבנים של ריבית.
    3. להקליט את המסנן ואת ההגדרות. להחיל פרמטרים אלה קבוצות הניסוי.
    4. שמור עותק של התמונה כקובץ tiff כולל את המסננים שהוחלו לעיון. השתמש בשם נתונים היסטוריים כגון [קבוצה ניסיוני שם] _ [שם הדגימה] _ [ניסוי תאריך] _ _ [ערוץ] [z-plane(s)] _ [מסנן עם פרמטרים].
  2. לבצע פילוח של מבנים מעניינים עם הכלי קו פרשת המים h אינטראקטיבי-maxima על התמונה עיבוד מקדים נוצר ונשמר בשלב 5.1.
    1. עם התמונה עיבוד מקדים פעיל בפיג'י, ליזום כלי אינטראקטיבי קו פרשת המים של h-maxima על ידי לחיצה על "SCF | תיוג | H_Watershed אינטראקטיב".
      הערה: תוסף זה מחשב תחילה פרשת המים ולאחר מכן מאפשרת למשתמש לחקור את ההשפעות של maxima המקומי והאפשרויות הסף פילוח באמצעות דימוי הפלט מעודכן באופן מיידי.
    2. מהחלונית ' בקרה ', להתאים את הזרע דינמיקה (ח) עוצמת סף (T), שיא הצפה (%) כדי למטב את פילוח.
      הערה: תמיד להפנות לתמונה raw לפני preprocessing מ סעיף 4.2 לבחון באופן ידני הביצועים של פילוח של המבנים של עניין.
    3. כשאתה מרוצה פילוח התוצאות, בחר "ייצוא אזורים מסכת" ובחר "לייצא". פעולה זו תיצור תמונה בינארית של התוצאות קו פרשת המים (איור 1, סגמנטציה).
    4. להקליט את הפרמטרים פילוח; פרמטרים אלה צריך להיות מוחל על פני קבוצות ניסיוני להשוואות כמותיות. להציל את המסכה תוצאות בינארי במידת הצורך לעיון עם פרמטרים פילוח מפורט שם כגון [קבוצה ניסיוני שם] _ [הדגימה שם] _ [ניסוי תאריך] _ _ [ערוצי] [z-plane(s)] _ _ [מסנן עם פרמטרים] [פרמטרים H_Watershed].
  3. לחלץ את המבנים עניין מתוצאות קו פרשת המים.
    1. תפתח את רועי שנשמרו שלב 4.4, במנהל ROI. עם המסכה אזורים בינארי מהשלב 5.2.4 הפעיל, בחר רועי מהמנהל רועי כדי להחיל על התמונה כדי להגביל הדמיה כדי רועי סטנדרטית.
    2. עם רועי פעיל על המסכה פרשת בינארי, לבחור "נתח | ניתוח חלקיקים"עם"להוסיף את מנהל"שבחרת בתיבת הדו-שיח כדי לחלץ תכונות.
      הערה: פעולה זו תוסיף מזהה חלקיקים עבור כל מבנה מאפשרת במהלך פילוח למנהל ROI. אפשרויות זמינות בתפריט זה כדי לא לכלול תכונות בהתבסס על גודל או מעגליות במידת הצורך כדי ללטש מבנים כלולים בניתוח.
    3. להציל את החלקיקים על ידי לחיצה על "יותר | שמור"בתפריט מנהל רועי. ודא מזהי הן מסומנות כל החלקיקים כל יישמרו בקובץ ה-zip. השתמש בשם נתונים היסטוריים כגון [קבוצה ניסיוני שם] _ [הדגימה שם] _ [ניסוי תאריך] _ _ [ערוצי] [z-plane(s)] _ [מסנן עם פרמטרים] _ _ [H_Watershed פרמטרים] [מבני].

6. כמות, אזור, ואת עוצמת כימות וניתוח

  1. פתחו את התמונה גלם שהופקו ונשמרו בשלב 4.2. גלול כדי ערוץ המשמש עבור לכידת המבנים של ריבית.
    הערה: חיוני לקחת מידות העוצמה מתוך התמונה raw (לפני preprocessing) כמו החלת מסננים שלב 5.1 השינויים ערכי הפיקסלים.
  2. פתח את החלקיקים המתקבל הדמיה בשלב 5.3, בחר 'הצג הכל' ממנהל ROI.
    הערה: פעולה זו כיסוי מיתאר של כל החלקיקים על "רועי מנהל" על גבי התמונה, צריך להתאים את הקצוות של המבנים של הריבית (איור 1, הדמיה).
  3. להגדיר את המידות הרצויות על-ידי לחיצה על "נתח | קביעת המידות".
    הערה: אזור, אינטנסיביות וצפיפות של חלקיקים נמדד על ידי בחירת "אזור" ו "צפיפות משולב". כשבוחרים צפיפות משולב, פיג'י יהיה לייצר שני ערכים: 'משולב צפיפות' מחושבת המוצר אזור אפור הערך הממוצע ואת 'גלם משולב צפיפות' נמדד כסכום של ערכי פיקסלים. צפיפות של החלבון הניאון של החלקיקים מחושב כסכום של ערכי פיקסלים מחולק לאזור. מספר החלקיקים שנוצרו בשלב 5.3 מציין את כמות חלקיקים בתוך רקמת שרועי שהוגדרו בשלב 4.4.
  4. מתפריט רועי מנהל בחר "מדידה". התוצאות מבוטא ביחידות מכוילות כל עוד המידות לקוחים מתוך קבצי נגזר בפיג'י תוכנת הדמיה. להעתיק את התוצאות בחלון תוצאות ולהדביק לתוך תוכנת הגיליון האלקטרוני עבור ההידור וחישובים נוספים.

7. רציומטרי כמת וניתוח נתונים

  1. בצע שלבים 6.1 ו- 6.2 לפתיחת מזהים חלקיקים בערוץ גולמי הראשון מעניין.
  2. להגדיר את המידות הרצויות על-ידי לחיצה על "נתח | קביעת המידות".
    הערה: ניתן למדוד את העוצמה הממוצעת לכל חלקיק על-ידי בחירת "מתכוון ערך אפור".
  3. ממנהל רועי בחר "מדידה". העתק נתונים מחלון תוצאות והדבק לתוך תוכנת הגיליון האלקטרוני.
  4. לעבור הגלילה "C" בערוץ השני raw של עניין, GFP בדוגמה זו (איור 4A), וחזור על הצעדים 7.2. 7.3.
    הערה: החלקיקים הציל בשלב 5.3 יוגדרו כברירת מחדל הערוץ ופרוסות שממנו הוא הופק. לטפל כדי לוודא חלקיקים יוחלו לערוץ הנכון של עניין.
  5. לחשב את היחס שבין עוצמת מערוץ אחד ללחץ של השני במשך כל חלקיק בתוכנת הגיליון האלקטרוני.
  6. השתמש מגרש פיזור כדי להמחיש ולכמת נתונים רציומטרי fluorophores כי התערוכה רעיוני של תהליכים ביולוגיים כבסיס בודדים שינויים.
    1. צור מגרש פיזור graphing לתוכנה.
      הערה: כל נקודת נתונים מייצגת מבנה עניין כאשר עוצמת fluorophore הראשון של עניין הוא הערך"x" ועוצמת fluorophore השני הוא "ערך y" נמדד מאמצע כל חלקיק.
    2. הגדר gating סף עבור כל fluorophore להגדיר את הגזרות.
  7. השתמש פרופיל כדי להמחיש את עוצמת fluorophore על פני מבנה של ריבית.
    1. בחר רועי שנוצר בשלב 5.3 ולהשתמש בכלי קו ישר בסרגל הכלים כדי לצייר קו ישר דרך רועי. הוסף את השורה רועי למנהל ROI.
    2. בכל אחד מהערוצים של עניין, עם קו פעיל, רועי בחר "נתח | מגרש פרופיל".
      הערה: הפונקציה פרופיל מגרש יפיק מגרש היסטוגרמה וטבלה של הערכים של עוצמת לאורך הקו. העתק תוצאות נמדד מאמצע כל ערוץ ולהדביק לתוך תוכנת הגיליון האלקטרוני כדי לייצר מגרש מציג שני ערוצי לאורך הקו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כימות של המספר, אזור, בעוצמה של מוטציה fluorescently מתויג Htt אגרגטים באונה אופטיים דרוזופילה

לחקור חלבונים misfolded צבירה במערכת העצבים המרכזית של מודל דרוזופילה של מחלת הנטינגטון, מוטציה מתויג RFP Htt אנושיים שאינם פתולוגיים (UAS-RFP-hHttQ15) או הרחבה פתולוגית ( UAS-RFP-hHttQ138), קרום GFP (UAS-mCD8::GFP)11 היו ביטוי משותף תחת הנהג פאן עצבית elav-GAL4...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

פרוטוקול שמפורטות כאן יכול לשמש robustly, reproducibly quantitate תא תהליכים ביולוגיים דמיינו ידי דימות מבוסס על קרינה פלואורסצנטית. ההקשר הביולוגי ומגבלות טכניות צריך להישקל בזהירות כדי להנחות הנבחנים. פלורסנט סמנים של מבנים subcellular של עניין, אם immunohistochemical, מבוסס-צבען, או ביטוי מבחינה גנטית, צריך להיות ניתן להבחנה מעל רקע על ידי מורפולוגיה ועוצמה. מערכת UAS/GAL4 משמש לנסיעה ביטוי גנים יישוב דרוזופילה. הדוגמאות המובאות משמש הטרנסגניים שורות נושא GAL4 מנהלי התקנים כדי להפעיל שעתוק של חלבונים...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכת על ידי שילה דוד פואנטה נוירופתי כאב מחקר התוכנית לתואר שני לאגודה (ל J.M.B.), הבחורים החיים של האפיפיור לויס תוכנה (כדי מודיע Y.Z., J.M.B.), קרן שניידר-רובינסון לאחווה Predoctoral (כדי מודיע), ה-ד ר ג'ון T . קרן מקדונלד (כדי מודיע), חוזים, מענקים של המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) HHSN268201300038C, R21GM119018 ו- R56NS095893 (R.G.Z.), ועל -ידי טאישאן מלומד לפרוייקט (מחוז שאנדונג, הרפובליקה העממית של סין) (R.G.Z.).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
SYLGARD(R) 184 ערכת אלסטומר סיליקוןDow Corning Corporationצלחתדיסקציה
PF184250 פלקון 35 מ"מ לא מטופל TC בסגנון אחיזה קלה צלחת פטרי צלחתקרנינג351008
דיסקציה Dumont #5 מלקחייםכלי מדע עדינים11251-20כלי דיסקציה
נתרן כלוריסיגמאS3014תמיסת
PBSנתרן פוספט דו-בסיסי תמיסת סיגמאS5136PBS
אשלגן פוספט מונו-בסיסיסיגמאP5655תמיסת PBS
טריטון  X-100SigmaT9284תמיסת ניקובטון לשטיפה ונוגדנים. 
37% פורמלדהידVWR10790-710קיבוע
צינורות מיקרוצנטריפוגה חד פעמיים (0.5 מ"ל, כחול)VWR89000-022קיבוע, כביסה ונוגדנים אינקובציה. 
שקופיות מיקרו רגילות וחלביות (25&; 75 מ"מ)VWR48312-004שקופיות להדמיה קונפוקלית
משקפי כיסוי מיקרו, מלבניים (22 ופעמים; 40 מ"מ)VWR48393-172שקופיות להדמיה קונפוקלית
גומי צמנטסליים1051-Aהרכבה
VECTASHIELD Antifade הרכבה MediumVector Laboratories, Inc.H-1000הרכבה
סקוטש קסם 810 סרט בלתי נראה (19 מ"מ ופעמים; 25.4 מ')3M חברה810הרכבה
סרום עיזים רגילתרמו פישר מדעיPCN5000 נוגדן incubaton
DAPI (4',6-דיאמידינו-2-פנילינדול, דיהידרוכלוריד) Thermo Fisher ScientificD1306צביעת חומצות גרעין. יש להמיס במים נטולי יונים ליצירת תמיסת מלאי של 5 מ"ג/מ"ל ולאחסן בטמפרטורה של -80&80 מעלות צלזיוס. g/mL ב-PBTx.
3.5X-90X בדיקת זום סטריאו מיקרוסקופ תעשייתיAmScopeSM-1BNZהיקף דיסקציה. מצויד ב-6W LED Dual Gooseneck
Illuminator ImageJ/FijiNIHv1.51uעם SCF_MPI_CBG תוספים (גרסה 1.1.2)
FV1000-IX81 מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקליאולימפוס
רקומביננטי קונסטרוקציהבלומינגטון דרוזופילה סטוקסנטר BL37749

מקורות

  1. Erkkinen, M. G., Kim, M. -O., Geschwind, M. D. Clinical Neurology and Epidemiology of the Major Neurodegenerative Diseases. Cold Spring Harbor perspectives in biology. , a033118(2017).
  2. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  3. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature methods. 9 (7), 671(2012).
  4. Mauvezin, C., Ayala, C., Braden, C. R., Kim, J., Neufeld, T. P. Assays to monitor autophagy in Drosophila. Methods. 68 (1), 134-139 (2014).
  5. Weiss, K. R., Kimura, Y., Lee, W. -C. M., Littleton, J. T. Huntingtin aggregation kinetics and their pathological role in a Drosophila Huntington's disease model. Genetics. 190 (2), 581-600 (2012).
  6. Babcock, D. T., Ganetzky, B. Transcellular spreading of huntingtin aggregates in the Drosophila brain. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (39), E5427-E5433 (2015).
  7. DeVorkin, L., Gorski, S. M. Monitoring autophagy in Drosophila using fluorescent reporters in the UAS-GAL4 system. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (9), (2014).
  8. Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of developing and adult Drosophila brains and retinae for live imaging. Journal of visualized experiments: JoVE. (37), (2010).
  9. Sweeney, S. T., Hidalgo, A., de Belle, J. S., Keshishian, H. Dissection of adult Drosophila brains. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2011).
  10. Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, P. P. Formaldehyde fixation. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 33 (8), 845-853 (1985).
  11. Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development. Trends in neurosciences. 24 (5), 251-254 (2001).
  12. Fischbach, K. -F., Dittrich, A. The optic lobe of Drosophila melanogaster. I. A Golgi analysis of wild-type structure. Cell and tissue research. 258 (3), 441-475 (1989).
  13. Ruan, K., Zhu, Y., Li, C., Brazill, J. M., Zhai, R. G. Alternative splicing of Drosophila Nmnat functions as a switch to enhance neuroprotection under stress. Nature Communications. 6, 10057(2015).
  14. Zhai, R. G., et al. NAD synthase NMNAT acts as a chaperone to protect against neurodegeneration. Nature. 452 (7189), 887(2008).
  15. Li, C., et al. Spermine synthase deficiency causes lysosomal dysfunction and oxidative stress in models of Snyder-Robinson syndrome. Nat Commun. 8 (1), 1257(2017).
  16. Prokop, A., Meinertzhagen, I. A. Development and structure of synaptic contacts in Drosophila. Semin Cell Dev Biol. 17 (1), 20-30 (2006).
  17. Maday, S., Holzbaur, E. L. Autophagosome biogenesis in primary neurons follows an ordered and spatially regulated pathway. Dev Cell. 30 (1), 71-85 (2014).
  18. Mizushima, N., Yamamoto, A., Matsui, M., Yoshimori, T., Ohsumi, Y. In vivo analysis of autophagy in response to nutrient starvation using transgenic mice expressing a fluorescent autophagosome marker. Molecular biology of the cell. 15 (3), 1101-1111 (2004).
  19. Lee, S., Sato, Y., Nixon, R. A. Primary lysosomal dysfunction causes cargo-specific deficits of axonal transport leading to Alzheimer-like neuritic dystrophy. Autophagy. 7 (12), 1562-1563 (2011).
  20. Vincent, L., Soille, P. Watersheds in digital spaces: an efficient algorithm based on immersion simulations. IEEE Transactions on Pattern Analysis & Machine Intelligence. (6), 583-598 (1991).
  21. Najman, L., Schmitt, M. Geodesic saliency of watershed contours and hierarchical segmentation. IEEE Transactions on pattern analysis and machine intelligence. 18 (12), 1163-1173 (1996).
  22. Shiber, A., Breuer, W., Ravid, T. Flow cytometric quantification and characterization of intracellular protein aggregates in yeast. Prion. 8 (3), 276-284 (2014).
  23. Mizushima, N., Yoshimori, T., Levine, B. Methods in mammalian autophagy research. Cell. 140 (3), 313-326 (2010).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

ניו روندגנרציה (ניוון עצבי) ב-Drosophilaדימות פלואורסצנטיניתוח ב-ImageJצברי חלבוניםשטף אוטופגיהסגמנטציה חצי-אוטומטיתאוואן אופטי (Optic Lobe)חלבון Huntingtinרפורטר Atg8תיוג פלואורסצנטי
ביולוגיה של התא כמותית של הקשורים ניוון מוחיים ב דרוזופילה דרך ניתוח לא משוחדת של חלבונים מתויגות Fluorescently באמצעות ImageJ
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.