וזמינותו אופטי למיחזור שלפוחית סינפטית בנוירונים בתרבית Overexpressing חלבונים Presynaptic

לומד שלפוחית סינפטית מיחזור חשוב בקביעת כיצד לשנות מאפיינים presynaptic, במהלך הפלסטיות הסינפטית או בתגובה ההפרעות בתפקוד סינפטית. נוגדן ספיגת לומד Synaptotagmin-1 (Syt1) מספק שיטה אחת של מד-SV מיחזור. Syt1 הוא חלבון SV-הקשורים משמש חיישן^{2 +} Ca, הוא הכרחי עבור שחרור exocytotic של הנוירוטרנסמיטר^1,2. . זה חלבון טראנסממברנלי עם תחום cytoplasmic C-מסוף מחוץ ה-SV, תחום luminal של N-מסוף בתוך SV³... במהלך אקסוציטוזה, תחום luminal של Syt1 הופך להיות חשוף למדיום החיצוני. למדיום החיצוני זה, אנו מוסיפים נוגדנים נגד קבוצת המחשבים cytoplasmic, אשר הופך הפנימו במהלך אנדוציטוזה. נוגדנים אלו יכולים להיות שגם מראש מצומדת עם fluorophores או immunostained עם נוגדנים משניים^4,5,6,7. עוצמת קרינה פלואורסצנטית immunosignal שנוצר הוא יחסי לסכום של SV מיחזור. גישה זו יכול לשמש כדי לקבוע SV מכוננת והן דפולריזציה-induced מיחזור^6,8.

מבחני ספיגת Syt1 יכול להתבצע לאחר העברה גנטית וירוס בתיווך על כמעט כל התאים בצלחת או לאחר תרביות תאים דליל של מספר קטן של תאים. השיטה שלנו משלב וזמינותו עם תרביות תאים זוגיים דלילה של נוירונים בהיפוקמפוס העיקרי באמצעות סידן פוספט⁹. אנו משתמשים חלבון רקומביננטי סמן ידוע לצבור ב presynapses, Synaptophysin fluorescently מתויגות, לאיתור מסופי presynaptic של overexpress שלנו חלבון של עניין, Rogdi. זה מאפשר לנו לבדוק אם לאו Rogdi מטרות פונקציונלי synapses ומשפיע SV מיחזור. הגן קידוד Rogdi זוהה במקור ב מסך למוטאנטים דרוזופילה מאופיין זיכרון לקוי¹⁰. בבני אדם, מוטציות בגן Rogdi לגרום מחלה נדירה ולא הרסניות הנקראת תסמונת Kohlschütter-Tönz. חולים הסובלים אמייל השיניים מומים pharmacoresistant אפילפסיה, העיכובים psychomotor; עם זאת, ההתאמה subcellular של המוצר הגן נשאר חמקמק¹¹. לפיכך, וזמינותו ספיגת Syt1 סיפק ראיות מפתח עבור ההתאמה של GFP מתויג Rogdi הסינפסות פונקציונלי⁹.

טכניקה זו ספיגת יש מספר יתרונות. ראשית, SV מיחזור יכול להיות שנצפו הן בזמן אמת על ידי ביצוע חי^7,הדמיה¹², ואחרי קיבוע^6,9 על ידי מדידת עוצמת קרינה פלואורסצנטית של התווית זריחה Syt1. בנוסף, פותחו גרסאות שונות של נוגדן Syt1. ישנם גרסאות לא מתויגות ניתן שכותרתו עם נוגדנים משניים בעקבות פרוטוקול סטנדרטי immunostaining לאחר קיבוע, וכל הווריאנטים מצומדת מראש עם תווית פלורסצנטיות כבר מצורף. לבסוף, זריחה נוגדן מבוססי היא יתרון בשל מבחר עשיר של צבעים משניים או מצומדת זמינים מסחרית שניתן להשתמש בהם.

כאשר תיקון ו immunostaining הנוירונים, זה גם אפשרי כתם חלבונים נוספים ולבצע ניתוח colocalization. זה יכול לעזור לקבוע היכן הם ממוקמים ביחס SVs מיחזור. האינטנסיביות של התווית פלורסצנטיות היא מדד ישיר של כמות SV מיחזור. בנוסף, הנוגדנים באופן סלקטיבי תווית מבנים המכילים Syt1, וכתוצאה מכך ירידה לפרטים גבוה מעט רקע זריחה⁴. פרוטוקולים גירוי שונות יכולות לשמש, כגון מאגרי דפולריזציה או גירוי חשמלי פרוטוקולים^9,12,13,14. עם זאת, מיחזור SV הבזליים ניתן למדוד ללא גירוי של תרבויות עצביים¹⁵.

השיטה שלנו מטפל באופן ספציפי Syt1 ספיגת נוגדן בנוירונים transfected כפול עם נוגדן משני immunolabeling לאחר קיבוע. עם זאת, אנו מתייחסים כל הווריאציות בשימוש שגרתי של וזמינותו בדיון שלנו לתת לצופים הזדמנות להתאים הפרוטוקול לצרכים הספציפיים.

אין מחקרים עם בעלי חיים נערכו. ניסויים המערבות בעלי חיים לאללה לקבל תא תרבויות אושרו על ידי רשויות מקומיות להגנת בעלי חיים (Tierschutzkommission der Universitätsmedizin גטינגן) תחת האישור למספר T10/30. הניסויים נערכו עם הפרוטוקולים המאושרים.

1. תרבית תאים בהיפוקמפוס ראשי

1. להכין את התרבות התא הפומבית של ההיפוקמפוס חולדה על^16,19¹⁷יום עובריים. צלחת התאים על coverslips 12 מ"מ מצופה polyethyleneimine (פיי) במנות 24-ובכן-צפיפות של 50,000-60,000 תאים/טוב. בדוק את צפיפות באמצעות תא ספירת לשכת ושלב אופטיקה חדות.
2. תרבות הנוירונים במשך 3 ימים (יום במבחנה (DIV) 3) של צלחת 24-ובכן בחממה ב 37 ° C עם 5% CO₂.
3. להעריך את coverslips עבור אינדיקטורים של תקינות התא באמצעות מיקרוסקופ אור המשודרת (למשל, שלב ניגודיות אופטיקה בהגדלה גדולה של 10-20 X). בדוק אם האינדיקטורים הבאים של בריאות טובה: הילה ניגודיות שלב ברור, neurites בלי חרוזים מבנים, ו אין סומא קיבוץ באשכולות או neurite bundling.

2. תקנים

הערה: הפרוטוקול הבא מתייחס כפול-תרביות תאים עבור 3 בארות. עם זאת, הפרוטוקול פועלת בצורה הטובה ביותר כאשר כמויות מספיקות עבור 4 בארות מוכנים.

1. הכנת 500 מ"ל של תרביות תאים מאגר (274 מ"מ NaCl, 10 מ מ. אשלגן כלורי, 1.4 מ מ נה₂HPO₄, 15 מ מ גלוקוז, 42 מ"מ HEPES) בתוך הבקבוק Erlenmeyer.
   1. להמיס 8.0 גר' NaCl, 0.37 גרם אשלגן כלורי, g 0.095 של נה₂HPO₄, 1.35 גר' גלוקוז ו- g 5.0 של HEPES ב- 400 מ ל מים מזוקקים flask Erlenmeyer.
   2. להתאים את ה-pH עולה 6.95 עם NaOH M 1 באמצעות מד pH.
   3. לכוון את עוצמת הקול עם מים מזוקקים עד 500 מ"ל, לבדוק את ה-pH באמצעות מד pH.
   4. להפוך aliquots 20-30 מ של תרביות תאים מאגר עם ערכי pH הבאים על-ידי pipetting 1 NaOH M למאגר תרביות תאים: 6.96 6.97, 6.98, 6.99, 7.00, 7.01, 7.02, 7.03, הגנה 7.04, 7.05, 7.06, 7.07, 7.08, 7.09, 7.11.
      הערה: ה-pH של המאגר תרביות תאים חיונית היעילות תרביות תאים.
   5. כדי לבדוק אילו תקנים מאגר מוביל המספר הגבוה ביותר של תאים transfected, לבדוק כל ערך ה-pH של 6.96 7.11. השתמש בשיטת תרביות תאים שמתואר 2.2-2.11, על פלסמיד המאומת לבטא GFP. לקבוע את מספר התאים transfected לכל coverslip עבור כל ערך ה-pH של מאגר תרביות תאים להעריך אילו מאגר עובד הכי טוב.
   6. Aliquot המאגר עם יעילות תרביות תאים הגבוהה לתוך צינורות microcentrifuge 2 מ"ל להקפיא ולאחסן הצינורות ב-20 ° C.
2. לחמם את מופחת סרום בינוני בינוני התרבות תאים, מים מזוקקים עד 37 ° C באמבט מים.
3. הכינו את התמהיל תרביות תאים צינור microcentrifuge 1.5 mL. לעבוד תחת למינארי על מנת להבטיח תנאי עבודה סטרילית.
   1. מיקס 7.5 µL של 2 מ' סידן כלורי עם 4 µg של כל DNA ללא אנדוטוקסין (Synaptophysin-מורנג ו- mGFP/GFP-Rogdi). מוסיפים מים כדי להגיע הנפח הכולל של 60 מ ל צינור microcentrifuge 1.5 mL.
   2. להוסיף 60 מ של תרביות תאים מאגר לתערובת. כדי להשיג את התוצאות הטובות ביותר, להוסיף למאגר תרביות תאים dropwise תוך כדי טלטול DNA-לערבב בעדינות על המערבולת.
   3. דגירה בטמפרטורת החדר (RT) במשך 20 דקות. נמנעים מללחוץ את הצינור הדגירה במהלך זמן הדגירה על ידי הנחת הצינור ליד למינארי.
4. מתחת למכסה המנוע זרימה שכבתית, להסיר את המדיום תרבות תא ("בינוני ממוזגים") מן הבארות באמצעות pipet 1000 מ"ל ואחסן אותו במיכל נפרד בחממה.
5. להוסיף 500 מ"ל של מדיום מופחת סרום מכל קידוח. דגירה התאים-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂ עד תקופת הדגירה 20 דקות (שלב 2.3.3).
6. להוסיף 30 מ של תרביות תאים לערבב כל טוב על-ידי pipetting מספר טיפות. למחוק את השאריות בתחתית הצינורית.
7. לאחר כל הבארות אלו שסופקו עם תערובת תרביות תאים, לנער בעדינות את הצלחת 24-טוב על מנת להבטיח הפצה של המיקס תרביות תאים בטווח הבינוני.
8. תקופת דגירה הבארות של 60 דקות-CO 37 ° C ו-5%₂.
9. להסיר למחוק את התמהיל תרביות תאים, לשטוף אותו שלוש פעמים עם תא תרבות בינוני. להוסיף 1 מ"ל של התא תרבות בינוני מכל קידוח, דגירה אותם למשך 30 שניות ב RT. להסיר 750 מ"ל של מדיום ולהוסיף את אותה כמות בינונית טרייה. חזור על זה שלוש פעמים.
   הערה: השלב כביסה הוא קריטי. לשמור על הפעם בה כל טוב יש לא בינוני לכל הפחות (כלומר., להסיר ולהחליף טוב-מאת-טוב) ולהוסיף המדיום כביסה בעדינות.
10. להסיר, למחוק את המדיום תרבות תא ולהוסיף 450 מ של ממוזגים בינוני טוב-מאת-טוב.
11. תן את הנוירונים בוגרים בחממה-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂ עד DIV 10.

3. Syt1 ספיגה ולניתוח

הערה: הפרוטוקול הבא חל על תפיסה 3 בארות. דפולריזציה של כל מספר אחר של בארות, להתאים את הכמויות בהתאם.

1. להכין 50 מ של 10 x דפולריזציה (640 מ"מ NaCl, 700 מ"מ. אשלגן כלורי, 10 מ מ MgCl₂, 20 מ מ CaCl₂, 300 מ"מ גלוקוז, 200 מ"מ HEPES, pH 7.4) של מאגר הבקבוק Erlenmeyer.
   הערה: מאגר דפולריזציה ניתן לשמור ב 4 מעלות צלזיוס למשך מספר שבועות. אם פתרון שאינו depolarizing משמש גם, להכין 10 הפתרון של x Tyrode המורכב מ מ 1290 NaCl, 50 מ מ אשלגן כלורי, 10 מ מ MgCl₂, 20 מ מ CaCl₂, 300 מ"מ גלוקוז, 200 מ"מ HEPES pH 7.4 על מנת להשוות גירוי הנוצרות על-ידי מיחזור עם ספונטנית מיחזור. לאחר דילול ל- 1 x, להוסיף 1 מיקרומטר של טטרודוקסין לפני השימוש כדי לחסום את פוטנציאל הפעולה הדור.
   1. להמיס 1.87 g של NaCl, g 2.61 של אשלגן כלורי, 0.1 גר' MgCl₂-6 H₂0, 0.15 גרם CaCl₂-2 H₂O ואת 3.0 גר' גלוקוז-1 H₂O g 2.38 של HEPES ב 50 מ ל מים מזוקקים flask Erlenmeyer. להתאים את ה-pH עם NaOH וסינון סטרילי-הפתרון. לדלל 1:10 מאגר במים מזוקקים להשגת ריכוז 1 x.
2. להכין 4% paraformaldehyde (PFA) ב 1 x PBS (pH 7.4) קיבוע לאחר גירוי.
   1. עבור 500 מ של 4% מחברים ב- PBS 1 x, לפזר 20 גר' paraformaldehyde ב 450 מ של מזוקקים H₂O.
      הערה: חימום הפתרון עשוי להאיץ את המסת, אך שלא לחמם את הפתרון מעל 70 מעלות צלזיוס, כאשר מחברים עלולה להתפרק.
      זהירות: PFA היא רעילה, קרצינוגני ו- teratogenic. יש ללבוש כפפות בעת עבודה עם כדורגלן, לעבוד תחת מכסה המנוע fume ולהימנע בליעה.
   2. ומצננים את פתרון כדי RT ולהוסיף 50 מ של פתרון מניות PBS x 10. להתאים את ה-pH ל 7.4 עם NaOH/HCl באמצעות מד pH.
3. לחמם 600 מ ל 1 x מאגר דפולריזציה של 10 מ"ל של התא תרבות בינוני עד 37 ° C באמבט מים.
4. להוסיף 1 מ"ל של נוגדן anti-Syt1 העכבר (שיבוט 604.2) 1-מאגר דפולריזציה ו מערבולת למשך 10 שניות.
5. להסיר ולמחוק את המדיום התרבות התא מהתאים. להוסיף 200 מ של המיקס דפולריזציה-נוגדן אחד טוב, תקופת דגירה של 5 דקות-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂ בחממה.
6. להסיר למחוק את התמהיל דפולריזציה-נוגדן, לשטוף אותו שלוש פעמים עם תא תרבות בינוני. להוסיף 1 מ"ל של התא תרבות בינוני מכל קידוח, תקופת דגירה של 30 שניות ב RT. להסיר 750 מ"ל של מדיום ולהוסיף את אותה כמות בינונית טרייה. אני חוזר שלוש פעמים.
7. להסיר, למחוק את המדיום תרבות תא ולהוסיף 300 מ של 4% מחברים ב- 1 x PBS. תקופת דגירה של 20 דקות ב- 4 מעלות צלזיוס.
8. רחץ שלוש פעמים במשך 5 דקות כל אחד עם 1 x PBS.
   הערה: הפרוטוקול אפשר לעצור כאן.

4. Immunocytochemistry

1. להכין 50 מ של מאגר חסימה.
   הערה: חסימת מאגר ניתן לשמור ב-20 מעלות צלזיוס למשך מספר חודשים.
   1. להמיס 2.5 g של סוכרוז ו- 1g של אלבומין שור (BSA) ב 5 מ של פתרון מניות PBS x 10. להוסיף 1.5 מיליליטר 10% הפתרון מניות דטרגנט. מערבבים את הפתרון עד שכל הרכיבים יש מומס כראוי ולהוסיף מזוקקים H₂O עד שהגיע נפח סופי של 50 מ. Aliquot הפתרון ומקפיאים את aliquots עבור אחסון.
2. לדלל המשני, מצמידים fluorophore הנוגדן (מכוונת נגד המין Syt1-נוגדן ראשוני) ב- 200 מ של מאגר חסימה של כל טוב-לדילול 1:1000.
3. להסיר ולמחוק מגניב 1 x מ המכילים כל אחד טוב של coverslip.
4. להוסיף 200 מ של חסימת שילוב מאגר-נוגדן מכל קידוח ולאחר תקופת דגירה של 60 דקות ב- RT.
   התראה: מאחר נוגדנים משניים הם רגישים לאור, כל הצעדים להתקדם חייב להתבצע בחושך.
5. לאחר דגירה, לשטוף את התאים שלוש פעמים במשך 5 דקות עם 1 מ"ל של PBS 1 x.
6. להטביע את coverslips על שקופיות מיקרוסקופ עם המדיום ההטבעה.
   1. להוסיף טיפה 7 mL הטבעה בינוני על גבי השקופית מיקרוסקופ. הסר את coverslip הצלחת 24-ובכן באמצעות הרמת אותו עם מזרק תופס אותו עם מלקחיים.
      התראה: תאים על משטח coverslip בקלות פגומים, אז מלקחיים יש לטפל בזהירות.
   2. טובלים את coverslip לתוך מים מזוקקים כדי להסיר את PBS לייבש אותו בקפידה על-ידי נגיעה צד אחד כדי רקמה רכה.
   3. להעיף את coverslip על גבי ה-droplet בינוני ההטבעה, כך השטח נושאת את התאים פונה השקופית מיקרוסקופ, ובכך הטבעה התאים אל המדיום ההטבעה.
7. להשאיר את השקופיות יבש מתחת למכסה המנוע עבור h 1-2 (לכסות אותם כדי למנוע חשיפה קלה) ולאחסן אותם בקופסה שקופיות מיקרוסקופ ב 4 º C.
   הערה: הפרוטוקול אפשר לעצור כאן.

5. ניתוח מיקרוסקופי

1. לאחר coverslips יבשה, למקם אותם תחת המיקרוסקופ עם המטרה ואת המצלמה.
2. להתאים את זמן החשיפה לערוץ כל כך כמה פיקסלים הם חשיפת כדי להבטיח הפצה המרבי של ערכי אפור.
   הערה: בזמן חשיפה הזמן עשוי להשתנות בין הערוצים, זה צריך להיות קבועה עבור ערוץ אחד להבטיח comparability בין coverslips.
3. לרכוש תמונות מרובה ערוצים עבור 10 אזורים מעניינים (ROIs) לכל coverslip. בדוק כי רועי מכיל תהליכים עצב נוירון transfected בבדיקת ה-GFP-זריחה, אשר אמור להיות punctate.

6. ניתוח סטטיסטי

1. לייצא את התמונות כקבצים. tif. לטעון את התמונות לתוך OpenView¹⁸ על-ידי לחיצה על קובץ | טעינת קובץ תמונה.
2. בחר את התמונה Synaptophysin-מורנג כערוץ 1 בתמונה Rogdi-GFP/mGFP כמו ערוץ 2, בתמונה זריחה Alexa647 כמו ערוץ 3.
3. סף ROIs.
   1. לחץ על ניתוח | אזור מקום מעל puncta. לבחור ערכי הסף ו דלתא בעוצמה כך על בדיקה ויזואלית, זריחה ' מאטום לשקוף ' הוא נשלל, עוזב רק punctate אותות בדמותו של ערוץ 1 (זריחה Synaptophysin-מורנג ייצוג). שמור את הסף זהה עבור כל התמונות.
4. העברת אלה ROIs לערוץ המתאים 2 (זריחה GFP-Rogdi/mGFP) ו- 3 (Syt1-זריחה) של כל אזור coverslip על ידי לחיצה על ביצוע עכשיו.
   הערה: ROIs צריך להיחשב רק אם התא אינו transfected כפול. בשיטה זו, זריחה מורנג GFP צריך להיות ברור לעין.
5. לשמור את הנתונים לתוך עורך יומן ניתוח על ידי לחיצה על נתוני יומן רישום.
6. לפתוח את עורך יומן ניתוח תחת הלשונית Windows ולהעתיק את הערכים עבור כל ערוץ. להדביק את הערכים עבור ערוצים נפרדים גיליון אלקטרוני.
7. קבע את עוצמת קרינה פלואורסצנטית הממוצע של Syt1-הערוץ ב ROIs בתנאים שתי תרביות תאים (GFP-Rogdi ו- mGFP).
8. החל המתאים בדיקות סטטיסטיות כגון של התלמיד במבחן t כדי לקבוע הבדלים משמעותיים.

תוצאה צפויה של גישה זו היא איתור כ 50 transfected כפול נוירונים לכל coverslip ב צפיפות של נוירונים 50,000 לכל טוב. הפעולה באקסון של הנוירון כל צפוי להראות נקודות חמות מרובות של מתויג fluorescently הצטברות Synaptophysin, ומציין אשכולות ofSVs. באתרים presynaptic תפקודית, האות Synaptophysin רקומביננטי colocalizes עם זריחה Syt1 punctate. GFP-Rogdi כמו החלבון עניין (איור 1) או mGFP של הפקד באמצעות תרביות תאים זוגיים, היא ביטוי במשותף עם רקומביננטי Synaptophysin.

בניסוי זה, אנחנו מנתחים SV מיחזור באתרים presynaptic בנוירונים לבטא GFP-Rogdi או mGFP. אם החלבון שליטה, mGFP, homogeneously והכהים את כל התא, אך השפעתה באתרים סינפטית עדיין צריכה להילמד, ואז יש צורך בשיתוף transfect חלבון השני הוא מועשר presynaptically, fluorescently מתויג Synaptophysin.

כפי שהוסבר קודם, התאים עוברים דפולריזציה-induced משדר השחרור. כתוצאה מכך, הסינפסות פונקציונלי תופסים נוגדנים Syt1 הוסיף למדיום. לאחר נוגדן immunolabeling Syt1 עם נוגדנים משניים fluorescently שכותרתו, מידת ספיגת Syt1 הוא סוף סוף לכמת באמצעות את immunosignal (איור 2).

איור 1. תא כפול-transfected. שדה הראייה מראה תא transfected כפול לבטא GFP-Rogdi (א) ו- Synaptophysin-mCherry (B). Synaptophysin הוא חלבון שלפוחית סינפטית בשפע. Variant רקומביננטי שלה יכול לשמש עבור תיוג עם העיתון ons סינפטית. הדפוס לוקליזציה של GFP-Rogdi דומה לזה של Synaptophysin-mCherry (C). גודל ברים = 10 μm. בתיבות הצג 2.5 X הגדלה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

באיור 2. GFP-Rogdi-פונקציונלי הסינפסות. ספיגת Syt1 בשידור חי בוצעה בתאים transfected כפול לבטא mGFP (ירוק) או Synaptophysin-מורנג (אדום; A-D) או GFP-Rogdi (ירוק), Synaptophysin-מורנג (אדום; E-H). ספיגת נוגדן Syt1 בוצעה באמצעות נוגדן חד שבטי העכבר נגד תחום luminal של Syt1. לאחר קיבוע מחברים, התאים היו מוכתמים נוגדן anti-GFP ארנב. נוגדנים משניים (אנטי-ארנב 488 אלקסה ועכבר נגד אלקסה 647) נוספו לאתר GFP או GFP-Rogdi ו- Syt1, בהתאמה. Autofluorescence של Synaptophysin-מורנג שימש כדי לזהות מסופי presynaptic (B ו F). Punctate Syt1 immunofluorescence מצביע על אתרים של שלפוחית מיחזור (כחול; C ו- G). שימו לב כי הרוב המכריע של התווית על-ידי Syt1 הסינפסות המותאמות לשפה שאינה transfected נוירונים. GFP-Rogdi היה ממוקד הסינפסות פעיל, לא שינתה את שלפוחית סינפטית מיחזור (I). 3 תרבות עצמאית הניסויים בוצעו (N = 3). לפחות 3 coverslips מתרבות כל אחד (סה כ 10) שימשו לצורך ניתוח. לבסוף, נותחו 3 אזורי לכל coverslip (n = 30). Student´s -t-test הראו הבדל משמעותי. גודל ברים = 10 μm. קווי שגיאה מייצגים שגיאת התקן של הממוצע (S.E.M.). "נ. ס" מציין אין משמעות. דמות זו שונתה מ רימן. et al. 9 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

המחברים אין לחשוף.