מאמר שיטה

הדמיה עם מודאלים מרובים זוהרים, פליטת פוזיטרונים טומוגרפיה/חישובית טומוגרפיה של מיאלומה נפוצה מח עצם Xenografts בעכברים ליקר ביצים

DOI:

10.3791/58056

⸱

7 בינואר 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Greater Los Angeles Veteran Administration Healthcare System, 2San Diego Veterans Administration Healthcare System, 3University of California, Los Angeles, 4Perkin Elmer

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן נשתמש זוהרים, רנטגן, והדמיה פליטת פוזיטרונים טומוגרפיה/שחושב טומוגרפיה ללמוד איך מעכבים פעילות mTOR משפיעה על engrafted-מח עצם מיאלומה גידולים במודל xenograft. דבר זה מאפשר ניתוחים פיזיולוגית הרלוונטיים, לא פולשנית, והן עם מודאלים מרובים של מיאלומה נגד ההשפעה של טיפולים מיקוד engrafted מח עצם מיאלומה גידולים ויוו.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיאלומה נפוצה (מ מ) גידולים engraft במח העצם (מוניטור), הישרדות והתקדמות שלהם תלויות לאינטרקציות מורכבות מולקולרית, תאית קיימים בתוך microenvironment הזה. עדיין microenvironment מוניטור לא יכול להיות בקלות משוכפל במבחנה, אשר פוטנציאל מגביל את הרלוונטיות הפיזיולוגיות של רבים במבחנה , שמחוץ ניסיוניות. נושאים אלה ניתן להתגבר על ידי ניצול מודל xenograft ב אילו לוציפראז (לוק)-תאים מ"מ 8226 transfected engraft במיוחד שלד העכבר. כאשר אלו עכברים מקבלים את המצע המתאים, D-luciferin, את ההשפעות של טיפול על הגידול והישרדות ניתן לנתח אותם על ידי מדידת שינויים של תמונות זוהרים (בלי) המיוצר על ידי גידולים בתוך vivo. נתונים אלה רבנות בלי בשילוב עם ניתוח פוזיטרונים (PET/CT) פליטת פוזיטרונים טומוגרפיה/חישובית באמצעות הסמן מטבולית 2-deoxy - 2 - (18F) פטור-D-גלוקוז (18F-FDG) משמש כדי לעקוב אחר השינויים בחילוף החומרים גידול לאורך זמן. פלטפורמות הדמיה אלה מאפשרים למדידות לא פולשנית מרובות בתוך microenvironment הגידול/מוניטור.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מ מ היא מחלה חשוכת מרפא של פלזמה ממאיר תאי-B לחדור ויטביע וגורמים להרס העצם, אנמיה, פגיעה כלייתית, זיהום. מ מ עד 10% - 15% של גידולים ממאירים hematological כל1 הנסיעה הוא הסרטן השכיח ביותר לערב את שלד2. הפיתוח של מ מ נובע השינוי oncogenic של תאים פלזמה מאריכים הנקבעים במרכזים נבטי של רקמות הלימפה לפני בסופו של דבר ביות מוניטור3. ויטביע מאופיין על-ידי נישות הטרוגנית מאוד; כולל רכיבים הסלולר מגוונות וקריטיים, אזורים של פו נמוך2 (היפוקסיה), vascularization נרחב, מורכבים מטריצות חוץ-תאית ציטוקין ורשתות פקטורי גדילה, אשר כולם לתרום tumorgenesis מ מ4. לפיכך, הפיתוח של מודל xenograft מ"מ המופץ מאופיין על ידי גידולים הם אך ורק engrafted ב ויטביע יהיה כלי רב עוצמה, הרלוונטית קלינית ללמוד מ מ פתולוגיה ויוו5,6. עם זאת, מכשולים טכניים רבים ניתן להגביל את האפקטיביות של רוב הדגמים xenograft, שהופך אותם יקר וקשה ליישם. זה כולל בעיות הקשורות engraftment גידול עקבי, לשחזור בתוך הגומחה מוניטור, זמן ממושך הגידול ופיתוח מגבלות ביכולת להתבונן ולמדוד ישירות שינויים של הגידול צמיחה/הישרדות ללא צורך להקריב עכברים במהלך ניסוי7,8.

פרוטוקול זה משתמש במודל xenograft ששונה בתחילה שפותח על-ידי. Miyakawa et al. 9, שבו התוצאה מהווה אתגר (IV) תוך ורידי עם תאים מיאלומה "המופץ" גידולים בעקביות ובאופן reproducibly engraft עכברים מוניטור של NOD/SCID/IL-2γ(null) (ליקר)10. הפריט החזותי בחיי עיר של גידולים אלה מושגת על ידי תרביות תאים יציב של הקו תא מ מ 8226 האנושי עם לוק אלל, באופן סדרתי מדידת השינויים רבנות בלי המיוצר על ידי אלו תאים סרטניים engrafted6. חשוב, מודל זה ניתן להרחיב לנצל שונים המבטאים לוק אנושי מ מ תא קווים אחרים (למשל, U266 ו- OPM2) עם נטייה דומה במיוחד engraft בשלד של עכברים NOG. הזיהוי של הגידולים על ידי הדמיה ביולומנאסן של העכברים לאחר מדידת ספיגת של הגששים radiopharmaceutical (כגון 18F-FDG) על ידי כן ביחד, דבר זה מאפשר אפיון נוסף של קריטי הביוכימי מסלולים (קרי, שינויים בחילוף חומרים, שינויים היפוקסיה ו של אינדוקציה של אפופטוזיס) בתוך microenvironment הגידול/מוניטור. נקודות החוזק העיקרי של מודל זה יכול להיות מודגשים בשל הזמינות של מגוון רחב של radiolabeled, זוהרים פלורסנט הגששים וסמנים שניתן ללמוד מ מ התקדמות, פתולוגיה בתוך vivo.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל ההליכים בבעלי חיים המתוארים להלן אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) של מערכת הבריאות VA לוס אנג'לס רבתי, בוצעו בתנאים סטריליים ונטולת הפתוגן.

1. הכנת לבטא לוציפראז 8226 תאים (8226-לוק)

  1. לשמור על הקו האנושי תא מ מ, 8226, בינוני RPMI-1640 בתוספת 10% סרום שור עוברית (FBS) ו- 1% פניצילין-סטרפטומיצין ב 37 מעלות צלזיוס באווירה humidified המכיל 95% אוויר ו-5% פחמן דו-חמצני (CO2).
  2. ליצור תאים כתב 8226 לבטא לוק יציב על-ידי transfecting עונה 1 פרק 106 8226 תאים עם וקטור כתב לוציפראז ואחריו מבחר עם hygromycin (100-350 mg/mL) כאמור תיאר6.
  3. לשמור את התאים בתנאים סטנדרטיים סטרילי culturing במשך 2-3 שבועות, שינוי המדיום בכל יום, עד הקמת קו 8226 תא stably transfected נוצרה.
  4. לאשר את הפעילות לוציפראז במבחנה בעונה 1 פרק 106 transfected µL תאים/100 של פוספט buffered תמיסת מלח (PBS) על-ידי הוספת המצע לוציפראז, D-luciferin (150-µg/mL הפתרון עובד במדיום תרבות prewarmed), ומדידת ביולומינסנציה התאים מבחנה או צלחת 96-ובכן באמצעות luminometer6.

2. מודל Orthotopic Xenograft

  1. לשמור על עכברים ליקר (4-6 שבועות ישנים, זכר או נקבה) בתנאים סטריליים/פתוגן ללא במתקן המתאים טיפול בבעלי חיים.
  2. להכין את התאים transfected לוק 8226 הרביעי הזרקה לתוך העכברים ליקר (~ 5 x 106 תאים/עכבר) ביום של הניסוי. לשטוף את התאים 3 x ב- PBS קר כקרח, לספור אותם, resuspend אותם ב- PBS קר כקרח (מינוס אנטיביוטיקה FBS)-ריכוז הסופי של 5 x 106 תאים/200 µL ל- PBS) במבחנה סטרילית. להשאיר את התאים על הקרח ואתגר העכברים בהקדם האפשרי (תוך 30-120 דקות).
  3. עזים ומתנגד העכבר (עם איזופלוריין, 1% - 3% באוויר ב 0.5 - 1 ליטר/דקה) ומניחים את החיה במצב פרקדן על משטח חימום עם הראש הפונה לכיוון ההפוך. בדוק את רמת ההרדמה על ידי צובט את הבוהן. משחה אופטלמולוגיות חלות על העיניים.
  4. להזריק את התאים 8226-לוק העכברים דרך הווריד של זנב (µL 200 הזרקה) באמצעות מזרק אינסולין 1 מ"ל ו מחט 26-G.
    הערה: מנורת חימום יכול לשמש כדי לחמם את הזנב, ובכך את הווריד להרחבת והגברת היעילות של זריקות.
  5. להחזיר את החיה לכלוב שלהם הביתה ונטר את החיות עד הם התאוששו לגמרי.
  6. לאשר את engraftment של תאים 8226-לוק שלד העכבר על ידי מדידה של רבנות בלי מרדימים עכברים (המתוארים להלן, המוצגת באיור 1A).
    הערה: מוניטור exudates יכול גם להיות מוכתם על הביטוי CD45 האנושי באמצעות cytometry זרימה (איור 1B) או על-ידי את אימונוהיסטוכימיה שנקטפו עצם (איור 1C).

3. מדידה של רבנות בלי In Vivo

הערה: בדרך כלל, בלי מדיד של גידולים engrafted בעכברים יכול להיות שנצפו הראשון בין 10-20 ימים postchallenge, אבל זה אולי צריך להיקבע השפעול.

  1. עזים ומתנגד העכבר (עם איזופלוריין, 1% - 3% באוויר ב 0.5 - 1 ליטר/דקה), בדוק את רמת ההרדמה על-ידי צובט את הבוהן. משחה אופטלמולוגיות חלות על העיניים שלה.
  2. להזריק החיה IP (µL 200 הזרקה) של "אין ויוו-כיתה" D-luciferin המצע (30 מ"ג/מ"ל מעורבבת עם מלח סטרילית).
  3. למדוד את רבנות בלי בתוך 5-10 דקות, לאחר ההזרקה של המצע luciferin (למרות הפעילות רבנות בלי יכול להיות נצפות בעכברים עבור עד 45-60 דקות), על ידי הצבת החיה anesthetized במצב פרקדן במערכת ההדמיה קטנות-חיה (איור 2 ). בחרו זורח וניתוח רנטגן, לרכוש תמונות (איור 3).
    1. למדוד את קרינתו הממוצע (פוטונים/s/ס מ2/steradian) באזורים נבחרים עניין (ROIs) באמצעות תוכנת הדמיה (איור 4).
    2. להחזיר את החיה לכלוב שלו הביתה ולנטר אותה עד זה יש החלים לחלוטין (כ 15-20 דקות).

4. טיפול של העכברים עם טיפול ממוקד

  1. הבסיס רבנות בלי וכולן אקראי החיות לקבוצות טיפול (עכברים/קבוצה 4-8).
  2. פנקו העכברים עם זריקה IP (µL 200 הזרקה) של temsirolimus (0.2 - 40 מ"ג/ק"ג עכבר) באמצעות משטר של חמש זריקות יומיות IP ואחריו 2 ימים של מנוחה נוספים חמישה יומי זריקות11.
  3. למדוד את הפעילות לוציפראז (פוטונים/s/ס מ2/steradian) 2 x בשבוע כמתואר בסעיף 3 עלילה השינוי של רבנות בלי לאורך זמן. שינויים סרטניים רבנות בלי ניתן להציג כתמונות טורי של העכברים (איור 5B).
    הערה: מומלץ כי מדי יום ניטור של החיות להתבצע עד שהן מציגות מהתופעות הבאות (בדרך כלל תוך 45-60 ימי האתגר הראשונית): משקל הפסד (הפסד של יותר מ-10% ביחס המשקל לפני ההשתלה) ו/או הינד שיתוק גפיים, ובו בזמן הם צריך להיות מורדמים באמצעות תא2 CO ואחריו נקע בצוואר הרחם.

5. PET/CT ניתוח באמצעות 18F-FDG מודדים משתנה בחילוף החומרים הגידול

  1. מהר את בעלי החיים בכלוב בבית שלהם על-ידי הסרת את האוכל שלהם במשך 24 שעות לפני הניסוי כדי למנוע עודף ספיגת שאינם ספציפיים של 18F-FDG.
  2. להכין 18F-radiolabeled חיית המחמד של FDG רגשים (50-100 µCi הזרקה בתוך תמיסת מלח סטרילית) ביום של הניסוי. להקליט את הזמן ואת הפעילות של המכשיר 18F-FDG עם מיגון.
    הערה: בגלל 18F יש תוחלת חיים קצרה יחסית (~ 2 h), הכנה זהירה ותכנון לשימוש של רגשים אלו חייבים להקים.
  3. עזים ומתנגד החיה (עם איזופלוריין, 1% - 3% באוויר ב 0.5 - 1 ליטר/דקה) ולמקם אותו במצב פרקדן על משטח חימום עם הראש הפונה לכיוון ההפוך. בדוק את רמת ההרדמה על ידי צובט את הבוהן. משחה אופטלמולוגיות חלות על העיניים שלה.
  4. להזריק את החללית דרך וריד הזנב (µL 100 הזרקה) באמצעות מזרק אינסולין מסוככים 1 מ"ל ו מחט 26-G.
    הערה: מנורת חימום יכול לשמש כדי לחמם את הזנב, ובכך את הווריד להרחבת והגברת היעילות של זריקות.
  5. למדוד רדיואקטיביות שיורית במזרק/המחט במיגון ורשום את הפעילות ואת הזמן.
    הערה: התקינה של העכבר דגירה, המינון תזמון חיוני כדי להבטיח הפארמצבטית נתונים comparability.
  6. לשמור על העכברים תחת הרדמה, ב 37 ° C באמצעות כרית החימום במהלך כל תקופת בדיקה ספיגת (~ 45-90 דקות).
    הערה: חשוב כי העכברים יישארו השבתה הדרגתית, ב 37 ° C כדי למנוע ספיגת שאינם ספציפיים של המכשיר.
  7. . תארגן את הזריקות של המכשיר 18F-FDG להתרחש במרווחים של 20 - 30 דקות כדי להבטיח פעמים תיוג דומה בעכברים.
    הערה: זרימת עבודה נכונה ותזמון מהמזרקים בדיקה תגרום אופטימלית ותנאי הדמיה לשחזור.
  8. מודדים את הפעילות 18F-FDG PET/CT קטן-חיה הדמיה למערכת באזורים נבחרים עניין התואמים הגידולים engrafted (איור 6).
    הערה: בתחילה, חשיפה לחיות מחמד סטטי של 10 דקות וחשיפה CT 2-מין מומלצים, אבל הזמנים המדויקים חשיפה ייתכן שתצטרך להיקבע השפעול.
  9. להחזיר את החיות לכלובים הביתה, לפקח עליהם עד החלים לחלוטין. בית העכברים בחדר החזרה ייעודי עבור 24 שעות ביממה תוך נרקב בדיקה רמות הרקע.
    הערה: בגלל מחצית החיים הקצר של 18F, מדידות מרובות באמצעות בדיקה טרי יכול להתבצע בתדירות גבוהה כמו x 2 בשבוע.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במחקרים טייס הראשונית, זריקות הרביעי של תאים 8226-לוק לתוך הנד/SCID עכברים לא לפתח גידולים BM-engrafted מ מ, למרות קשקשיים ממ גידולים היו בקלות נוצר (100% אחוזי הצלחה). לעומת זאת, אתגרים הרביעי עם תאים 8226 לתוך המשקה עכברים המופקים (במרחק של-15-25 ימים) גידולים השלד (ולא רק לעתים נדירות בנוי גידולים בתוך הרקמה הלא-השלד, כגון הכבד או הטחול). מאז גידולים שלד יכול לא להיות ויזואלית מאושרות על ידי פיזית בחינת החיות, שיטות אחרות היה להיחשב לאמת הגידול מצליח engraftment ואת המיקום של הגידולים ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למרות מגוון דגמים xenograft פרה של מ מ6,9,11,12,13, היכולת ללמוד את האינטראקציות הגידול/מוניטור בתוך microenvironment מוניטור נשאר קשה 14. מהטכניקות שתוארו כאן מאפשרים engraftment מהיר ולא לשחזור 8226-לוק גידולים של תאים בשלד של עכברים NOG.

השלבים הקריטיים של פרוטוקול זה מעורב הקמת שורות תאים מ מ לוציפראז לבט...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הסופר פרנסיס קווין הוא מועסק ע י מין הולל-אלמר.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי grant1I01BX001532 VA ההצטיינות מן ארצות הברית מחלקת ותיקי לענייני ביו מעבדות מחקר ומקבל שירות פיתוח (קריינות) P.F., ולאחר E.C. תמיכה (VA המדע קליני R & D שירות . ראויות I01CX001388 פרס), שיקום VA R & D שירות (I01RX002604 פרס הצטיינות). תמיכה נוספת הגיעה מענק זרע סגל אוניברסיטת קליפורניה בלוס אנג'לס כדי J.K. תכנים אלה ואינן מייצגות בהכרח את נופי את בנו המחלקה לענייני חיילים משוחררים או הממשלה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
8226 קו תאי מיאלומה אנושיתATCCCCL-155
NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ עכברים (NOG)Jackson Labs5557
VivoGlo Luciferin SubstratePromegaP1041
Hypoxyprobe-1KitHPLHP1-100
PE-CD45 (clone H130)BD Biosciences555483משמש לזרימה ציטומטרית לזיהוי תאי גידול CD45+ אנושיים בהפרשות BM
ארנב CD45 אנטי-אנושי (שיבוט D3F8Q)איתות תאים טכנולוגיה70527נוגדן ראשוני המשמש לאימונוהיסטוכימיה של עצם כריתה
עז אנטי-ארנב IgG (מצומד HRP)ABCAMab205718נוגדן Seconday המשמש לאימונוהיסטוכימיה של עצם כרותה
Dual-Luciferase Reporter Assay SystemPromegaE1910
pGL4.5 Luciferase Reporter וקטורPromegaE1310
IVIS Lumina XRMS In מערכת הדמיה VivoPerkin Elmer
Sofie G8 מערכת הדמיה PET/CTפרקין אלמר

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Raab, M. S., Podar, K., Breitkreutz, I., Richardson, P. G., Anderson, K. C. Multiple Myeloma. The Lancet. 374 (9686), 324-339 (2009).
  2. Galson, D. L., Silbermann, R., Roodman, G. D. Mechanisms of Multiple Myeloma Bone Disease. BoneKEy Reports. 1, 135(2012).
  3. Anderson, K. C., Carrasco, R. D. Pathogenesis of Myeloma. Annual Review of Pathology. 6, 249-274 (2011).
  4. Reagan, M. R., Rosen, C. J. Navigating the Bone Marrow Niche: Translational Insights and Cancer-Driven Dysfunction. Nature Reviews Rheumatology. 12 (3), 154-168 (2016).
  5. Frost, P., et al. Mammalian Target of Rapamycin Inhibitors Induce Tumor Cell Apoptosis in Vivo Primarily by Inhibiting Vegf Expression and Angiogenesis. Journal of Oncology. 2013, 897025(2013).
  6. Mysore, V. S., Szablowski, J., Dervan, P. B., Frost, P. J. A DNA-Binding Molecule Targeting the Adaptive Hypoxic Response in Multiple Myeloma Has Potent Antitumor Activity. Molecular Cancer Research. 14 (3), 253-266 (2016).
  7. Podar, K., Chauhan, D., Anderson, K. C. Bone Marrow Microenvironment and the Identification of New Targets for Myeloma Therapy. Leukemia. 23 (1), 10-24 (2009).
  8. Campbell, R. A., et al. Laglambda-1: A Clinically Relevant Drug Resistant Human Multiple Myeloma Tumor Murine Model That Enables Rapid Evaluation of Treatments for Multiple Myeloma. International Journal of Oncology. 28 (6), 1409-1417 (2006).
  9. Miyakawa, Y., et al. Establishment of a New Model of Human Multiple Myeloma Using Nod/Scid/Gammac(Null) (Nog) Mice. Biochemical and Biophysical Research Communications. 313 (2), 258-262 (2004).
  10. Ito, M., et al. Nod/Scid/Gamma(C)(Null) Mouse: An Excellent Recipient Mouse Model for Engraftment of Human Cells. Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).
  11. Frost, P., et al. In Vivo Antitumor Effects of the Mtor Inhibitor Cci-779 against Human Multiple Myeloma Cells in a Xenograft Model. Blood. 104 (13), 4181-4187 (2004).
  12. Asosingh, K., et al. Role of the Hypoxic Bone Marrow Microenvironment in 5t2mm Murine Myeloma Tumor Progression. Haematologica. 90 (6), 810-817 (2005).
  13. Storti, P., et al. Hypoxia-Inducible Factor (Hif)-1alpha Suppression in Myeloma Cells Blocks Tumoral Growth in Vivo Inhibiting Angiogenesis and Bone Destruction. Leukemia. 27 (8), 1697-1706 (2013).
  14. Fryer, R. A., et al. Characterization of a Novel Mouse Model of Multiple Myeloma and Its Use in Preclinical Therapeutic Assessment. PLoS One. 8 (2), e57641(2013).
  15. Gould, S. J., Subramani, S. Firefly Luciferase as a Tool in Molecular and Cell Biology. Analytical Biochemistry. 175 (1), 5-13 (1988).
  16. Czernin, J., Phelps, M. E. Positron Emission Tomography Scanning: Current and Future Applications. Annual Review Medicine. 53, 89-112 (2002).
  17. Pandey, M. K., Bhattacharyya, F., Belanger, A. P., Wang, S. Y., DeGrado, T. R. Pet Imaging of Fatty Acid Oxidation and Glucose Uptake in Heart and Skeletal Muscle of Rats: Effects of Cpt-1 Inhibition. Circulation. 122 (21), (2010).
  18. Wang, M. W., et al. An in Vivo Molecular Imaging Probe (18)F-Annexin B1 for Apoptosis Detection by Pet/Ct: Preparation and Preliminary Evaluation. Apoptosis. 18 (2), 238-247 (2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

PET CTTemsirolimusD Luciferin18F FDG

מאמרים קשורים