מאמר שיטה

הזיהוי של פרומונים ים עגולי הפה באמצעות מונחה Bioassay Fractionation

8.5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/58059

⸱

17 ביולי 2018

 ,  , 
1Department of Fisheries and Wildlife, Michigan State University

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לבודד ולאפיין את המבנה, חוש הריח, והכוחות תגובה התנהגותית של תרכובות פרומון בשם של הים lampreys.

תקציר

Fractionation מונחה bioassay היא גישת איטרטיבי העושה את התוצאות של bioassays פיזיולוגיים והתנהגותיים להנחות את בידוד וזיהוי של תרכובת פרומון פעיל. שיטה זו הובילה אפיון אותות כימיים מוצלחת שהפונקציה כמו פרומונים במגוון רחב של מיני בעלי חיים. Lampreys ים מסתמכים על חוש הריח לזיהוי פרומונים המתווכות תגובות התנהגותיות או פיזיולוגיים. אנו משתמשים בידע הזה לביולוגיה דגים להניח פונקציות של פרומונים בשם להנחות את בידוד וזיהוי מרכיבים פעילים פרומון. כרומטוגרפיה משמש כדי לחלץ, לרכז, ולהפריד בין תרכובות מהמים ממוזגים. הקלטות אלקטרו-olfactogram (EOG) נערכים כדי לקבוע אילו שברים להפיק תגובות חוש הריח. מבחני התנהגות שני-בחירה מבוך משמשות לאחר מכן לקבוע אם כל אחד השברים מדיף גם פעילים בהתנהגותו, זירוז העדפה. שיטות ספקטרוסקופיות spectrometric לספק את משקל מולקולרי ואת המידע המבני כדי לסייע עם מבנה הבהרה. Bioactivity של תרכובות טהור הוא אישר עם EOG, מבחני התנהגות. התגובות ההתנהגות שנצפתה במבוך בסופו של דבר לאמת באווירה שדה כדי לאשר את תפקידם בסביבה טבעית זרם. אלה bioassays לשחק תפקיד כפול 1) להנחות את התהליך fractionation, 2) לאשר ולהגדיר עוד יותר את bioactivity של רכיבים מבודדים. כאן, אנחנו מדווחים התוצאות נציג של מזהה פרומון ים עגולי הפה המדגימים את התועלת של הגישה מונחה bioassay fractionation. הזיהוי של פרומונים עגולי הפה ים חשוב במיוחד כי אפנון של מערכת התקשורת שלו פרומון הוא בין האפשרויות נחשב לשלוט הצלופח ים פולשנית של האגמים הגדולים רודכב. בשיטה זו ניתן להתאים בקלות לאפיין את התקשורת הכימית במגוון רחב של taxa, לשפוך אור על waterborne. אקולוגיה כימית.

מבוא

פרומונים הם אותות כימיים מסוימים שפורסמו על ידי יחידים שמסייע להם באיתור מקורות המזון, זיהוי טורפים, מתווכים אינטראקציות חברתיות של בני מינו1. פרומון בתקשורת חרקים כבר למד היטב2; עם זאת, זיהוי כימי והתפקוד הביולוגי של פרומונים חוליות ימיים לא נחקרו בהרחבה. ניתן להחיל זהות וידע תפקוד הפרומונים שוחרר כדי להקל על ההתאוששות של מינים מאוימים3,4 או בקרת מזיקים מינים5,6. היישום של טכניקות אלה מחייבת את בידוד ואפיון של רכיבי ביואקטיביות פרומון.

זיהוי פרומון הוא ענף הכימיה מוצר טבעי. התקדמות במחקר פרומון הוגבלה חלקית בשל אופיו של מולקולות פרומון עצמם. פרומונים הן לעיתים קרובות לא יציב, המשוחררים בכמויות קטנות, רק כמה טכניקות דגימה קיימת כדי לזהות כמויות זעירות של נדיפות7,8 או תרכובות מסיסים במים9. גישות לזיהוי פרומונים כוללים 1) הקרנה יישוב של תרכובות ידועות, גליקומיקס 2) ו- fractionation 3) bioassay מונחה. הקרנה יישוב תרכובות ידועות בדיקות תוצרי חילוף החומרים זמינים מסחרית של תהליכים פיזיולוגיים המשוערות לתפקד כמו פרומונים. גישה זו היא הגבלת כי החוקרים בודק רק תרכובות ידוע וזמין. עם זאת, זה הביא זיהוי מוצלח של הורמוני מין אצל דגי זהב שהפונקציה כמו פרומונים10,11,12. גליקומיקס היא גישה זיהוי פרומון השני המבדיל מוצרים מטבולית פוטנציאלי של מולקולה קטנה בתוך המערכת הביולוגית13. השוואה של פרופילים מטבולית של שתי קבוצות (כלומר, פעיל נגד תמצית לא פעילים) מאפשר זיהוי פרופיל מטבולי הפוטנציאלי מ אשר מטבוליט מטוהרים, הובהר המבנה, ואת bioactivity הוא אישר14. אפקטים מוספים או סינרגטי של ניסוחים מורכבים של תערובות מסוים נוטים יותר להיות מזוהה עם גליקומיקס מכיוון מטבוליטים נחשבים ביחד ולא כסדרה של שברים13. ובכל זאת, המימוש של מטבולומיקס מסתמך על הזמינות של הפניות סינתטי כי הנתונים המתקבלים לא להקל על הבהרה של מבנים חדשניים.

Fractionation מונחה bioassay היא גישה משולבת, איטרטיבי המתפרס על שני שדות: כימיה וביולוגיה. גישה זו משתמשת בתוצאות של bioassays פיזיולוגיים והתנהגותיים להנחות את בידוד וזיהוי של תרכובת פרומון פעיל. תמצית גולמי fractionated באמצעות מאפיין כימי (כלומר, גודל מולקולרי, קוטביות, וכו '), נבדק עם הקלטות אלקטרו-olfactogram (EOG) ו/או של bioassay. Bioactive הרכיבים מוקרנים מאת לחזור על השלבים של fractionation ו- EOGs ו/או bioassays. המבנים של חומרים פעילים טהורים הם הובהר על ידי שיטות ספקטרוסקופיות ו spectrometric, אשר מספקים את משקל מולקולרי ומידע המבנית לייצר תבנית של המתחם להיות מסונתז. Fractionation מונחה bioassay יכולות להניב מטבוליטים מגוונים, פרומונים שעשויות להיות הרומן עם שלדים כימי ייחודי כי צפויים להיות החזוי של המסלולים biosynthetic הוחלף נגזר.

כאן, אנו מתארים את פרוטוקול fractionation מונחה bioassay נהגו לבודד לאפיין את bioactivity של תרכובות פרומון מין זכר עגולי הפה לים. הצלופח ים (Petromyzon מרינוס) הוא מודל חוליות אידיאלי ללמוד תקשורת פרומון כי דגים אלו יסתמכו על חוש הריח זיהוי סימנים כימיים לתווך ההיסטוריה החיים anadromous שלהם מורכבת משלושה שלבים ברורים: הזחלים, לנוער, למבוגרים. עגולי הפה ים הזחלים מתחפרים סחף בגדות נחלים, לעבור שינוי דרסטי של, להפוך קטינים זה להגר לאגם או אוקיינוס שבו הם הדורות דגים גדולים המארח. לאחר ניתוק מן הדגים המארח, המבוגרים נודדים בחזרה אל נחלים ההשרצה, בהדרכת את הפרומונים נודדות שפורסמו על ידי זרם תושב הזחלים15,16,17,18,19 . זכרים בוגרים ascend לשטח ההשרצה, שחרור של פרומון המין רב רכיבים כדי למשוך חברים, להשריץ לסירוגין במשך כשבוע, זיווה,15,20. הזיהוי של פרומונים עגולי הפה ים חשוב כי אפנון של מערכת תקשורת פרומון הוא בין האפשרויות נחשב כדי לשלוט על lampreys ים פולשנית האגמים הגדולים רודכב21.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה של אוניברסיטת מישיגן (AUF # 03/14-054-00 ו 02/17-031-00).

1. אוסף והפקת ים עגולי הפה ממוזגים מים

  1. מקום בוגר מינית lampreys ים הגברי (בעלי חיים של 15-30) במיכל שסופק עם 250 לליטר מים ימת יורון קצף ומתוחזק על 16-18 מעלות צלזיוס.
  2. איסוף המים ממוזגים זכר לאורך כל לילה מיוני עד יולי.
    הערה: lampreys ים מתים באופן טבעי לאחר ההשרצה. אם דג מתקרבת נקודה זו בחייו, להחליף אותו זכר בוגר טרי.
  3. לחלץ את המים ממוזגים על-ידי מיצוי מעבדתי.
    1. להשרות את השרף מתנול במשך 4 שעות לפני טעינתו לעמודה. לטעון השרף לתוך העמודה ולאחר מכן לשאוב אני 10 ליטר מים באמצעות המדור לחסל את הממס האורגני.
    2. עוברים המים ממוזגים ממיכל מחזיק את הדגים באמצעות מערכת שאיבה לחלק העליון של העמודה. המים עובר דרך מצע 2 ק ג של שרף בינוני קוטבי פולימריים-יונים (למשל., Amberlite XAD-7 HP שרף), הכלולים בסדרה של ארבעה 2.5 L בקיבולת זכוכית עמודות. לשמור על עומס במהירויות בין 400 ל 600 מ ל/6 מינימלית Elute המטבוליטים עם L 10 של מתנול כשמיד 5 L של אצטון.
      התראה: שלב זה משתמש מתנול, אצטון. שניהם נמצאים דליק ולא רעילים.
      הערה: ניתן לאחסן השארית במאגר ב-80 מעלות צלזיוס עד עיבוד נוסף.
  4. הפעל מחדש את העמודה לאחר שבוע 1 העשרה על ידי שטיפה עם מים (כ- 10 ליטר).
  5. להסיר את הממס האורגני (התערובת של מתנול ומים) ולקצור את התמצית על ידי אידוי על כל ההזמנות עבור 5 שעות תחת לחץ מופחת (300 מתחת mbar) ב- 40 מעלות צלזיוס. לרכז את שאריות המים על ידי הקפאת lyophilization מייבש במשך 48 שעות ב-20 ° C עד יבש.

2. בידוד של שבר בריכות עם כרומטוגרפיה

  1. משרים ג'ל סיליקה (mesh 230-400) בשלב הראשוני ניידים עבור 30 דקות העברת את הג'ל עם הממס (השעיה) בעמודה זכוכית. . פתח את הברז של העמודה כדי לאפשר את שלב ניידים לעבור לאפשר את לזרז ויוצרים מיטה סיליקה ג'ל סיליקה ג'ל.
  2. מערבבים את תמציות עם סיליקה ג'ל (70-230 mesh) ביסודיות ולטעון אותן לתוך העמודה כרומטוגרפיה נוזלית מעל המיטה סיליקה ג'ל. Elute אותם במילוי הדרגתי מ 95% CHCl3 (כלורופורם) / MeOH (מתנול) ל- 100% MeOH, 2.5 L בהנפח הכולל. לאסוף את eluent ב בודדים בקבוקונים (כל 10 מ"ל).
    זהירות: ההרדמה בשימוש בשלב זה היא ארסיים ריאגנט.
  3. מדריך איגום של eluents לתוך שברים 20 על ידי ניתוח כרומטוגרפיה (TLC) שכבה דקה.
    1. לבצע את הניסוי TLC על צלחות מראש מצופה סיליקה ג'ל על-ידי החלת המדגם על קו הזינוק הטבעית לקו הזינוק של הצלחת בממיסים המתפתח (לבחור את הקוטביות על ידי היחס של CHCl3 מתנול מ 100-0%) בכוס אטום טנק.
    2. בחר את היחס של פיתוח הממס כדי להפוך כל TLC נקודות עם גורם השמירה (Rf) החל 0.3 - 0.8.
    3. לאחר הממס המתפתח מגיע לקו סיום, לוקח את הצלחת לצאת מהבריכה, לחכות 10 דקות לחומר עד להתאדות.
    4. לדמיין את הנקודות קודם תחת אולטרא סגול 254 ננומטר, כתם אז להם על ידי התזת להם פתרון מתנול חומצי של 5% anisaldehyde (20 μL) על ידי ריסוס כרומטוגרפיה וחימום אותם ב 85 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות.
      הערה: כתמים צבעוניים על הצלחת TLC מציינים המרכיב העיקרי של השבר.
    5. לשלב את eluent כדי 20 שברים מבוסס על צבע הספוט את הדמיוןf R של המרכיב העיקרי.
  4. לרכז את השבר כדי משקע אידוי על כל ההזמנות תחת לחץ מופחת (300 mbar לפי המאפיין של ממיסים) ב 40 מעלות צלזיוס במשך כ 30 דקות.

3. אלקטרו-olfactogram (EOG) הקלטות כדי לזהות שברים מדיף/תרכובות

  1. משוך נימים זכוכית בורוסיליקט (הקוטר החיצוני: 1.5 mm; הקוטר הפנימי: 0.86 מ מ; אורך: 100 מ"מ) עם micropipette פולר עם רמת החימום מוגדר כ- 65.
  2. ציון ואז הפתח בקצה נים כלי לחיתוך זכוכית שקצהו יהלום ואז למלא אותו אגר מותכת 0.4% ב- saline 0.9%. הפתח בקצה נימי צריך להיות כ-10 מיקרומטר בקוטר.
  3. מילוי האלקטרודות נימי משך מן השלבים 3.1 3.2 ומחזיקים אלקטרודות solid-state ואלמנטים טרומיים עם כדורי Ag/AgCl (ראה טבלה של חומרים) עם 3 מ' באמצעות micropipette של אשלגן כלורי.
    הערה: לסלק כל בועות האוויר את נימי או מחזיק האלקטרודה.
  4. הכנס האלקטרודות משך מחזיקי אלקטרודה.
  5. להכין 100 מ של 10-5 M L-ארגנין במים מסוננים פחם 10-2 M L-ארגנין מניות פתרון במים יונים (מאוחסן ב 4 ° C) בבקבוקון הנפחי. העברה 20 מיליליטר 10-5 M L-ארגנין כדי בקבוקון זכוכית.
  6. על עקומת ריכוז-תגובה, להכין 10 מ"ל של דילולים 10-fold הבריכות שבר מהשלב 2.3 בצלוחיות זכוכית. להכין דילולים טריים מדי יום לפני הניסויים ולהשתמש בהם תוך יום. לשים הבקבוקונים זכוכית של פתרונות עבודה של L-ארגנין ו דילולים בריכה של שבר בתוך אמבט מים recirculating כדי לאפשר לטמפרטורה equilibrate ל 8 מעלות צלזיוס.
  7. עזים ומתנגד הצלופח עם אסתר אתיל חומצה 3-aminobenzoic (MS222; 100 מ ג/ליטר), לשתק אותו עם זריקה תוך שרירית של gallamine triethiodide (3 מ"ג/ק"ג משקל גוף, ב- saline 0.9%) בעזרת מזרק סטרילי.
    הערה: מספיק לעומק של ההרדמה נקבע על ידי התבוננות אין תנועה גיל, חוסר היכולת לשמור על תנוחה זקופה ולאחר חותינ לצדדים של הטנק באמצעות דיסק דרך הפה שלה. כדי למזער כל זיהום מיקרוביאלי לפני ובמהלך הניתוח, ללבוש כפפות סטריליות ומשרים בכלי ניתוח ב-70% אתנול (v: v) במים יונים לפחות 10 דקות לפני השימוש.
  8. אוריינט הצלופח anesthetized ב עמדה בצורת V, לעטוף את זה עם מגבת נייר רטובה כדי למנוע לייבוש.
    הערה: אינם מפריעים הפתחים גיל.
  9. הכנס שפופרת של צואה קצף מים המכילים 50 מ"ג/ליטר של MS222 לתוך חלל הפה, להתאים את קצב הזרימה ולהבטיח כי המים הוא יציאה דרך הפתחים גיל ברציפות להשקיית הזימים.
  10. שימוש בסיסמה האזמל סטרילי מלקחיים [תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי בהגדלה גדולה-X 1.25 (ראה טבלה של חומרים)] כדי להסיר מקטע2 5 מ מ של העור על פני השטח של הקפסולה חוש הריח לחשוף האפיתל חוש הריח.
  11. לשטוף את הצנרור משלוח odorant עם מים מסוננים וחבר אותו לשסתום רכוב על micromanipulator. למקם את צינור קפילרי משלוח odorant לתוך חלל אפיתל חוש הריח באמצעות micromanipulator להעביר מים מסוננים האפיתל חוש הריח כדי למנוע לייבוש כאשר לא ניהול odorants.
  12. הר האלקטרודות הקלטה של התייחסות-micromanipulators. להוריד את האלקטרודה הפניה על העור החיצוני ליד naris. באמצעות מיקרוסקופ סטריאוסקופי (1.25 X), נמוך האלקטרודה הקלטה בקושי לגעת השטח של האפיתל חוש הריח.
  13. העבר את ספיגת של הצינור משלוח odorant מן המים רקע מסונן הפתרון L-ארגנין 10-5 מ'.
  14. הפעל את המחשב, מגבר (מוגדר למצב DC), מסנן ולאחר מכן digitizer. באמצעות תוכנת מנהל ההתקן שסתום, לתכנת את ההליך כדי לנהל דופק 4 של יחידה s של odorant על-ידי סימון התיבה של T1, קביעת T 4 s ובדיקת התיבה של T2.
  15. בתוכנה רכישת נתונים (ראה טבלה של חומרים), להגדיר את מצב רכישה כ אוסצילוסקופ במהירות גבוהה, לחץ על הסמל ' הפעל ' ולאחר מכן לחץ על התחל במנהל ההתקן שסתום להזניק את הדופק odorant.
    הערה: התוכנה רכישת נתונים באופן אוטומטי רשומות של משרעת התגובה EOG דיפרנציאלי עבור 20 s (3 s בעבר, 4 s במהלך הדופק odorant 13 s לאחר מכן). להשתמש את micromanipulator כדי לתמרן את העמדות של הקלטה אלקטרודה, אלקטרודה הפניה או odorant משלוח צינור כדי להגדיל את יחס אות לרעש עם מענה מרבי תקן L-ארגנין, תגובה מינימלית (בקרה הריק מים מסוננים). פרוק המגבר על ידי מיתוג את המתג מגבר AC-DC ל- GND בעת הזזת האלקטרודות.
  16. להקליט את הפקד ריק, L-ארגנין, וריחנים אז את מוכנה בשלב 3.6 מ נמוך כדי ריכוזים גבוהים עם סומק 2 דקות מים מסוננים בין יישומים.
  17. לאחר הקלטת התגובות כל odorants להיבדק, קרקע המגבר ומשכו בקפידה את אלקטרודות ו- odorant משלוח צינור קפילרי. הבאים שאושרו אכפת לי חיה מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) השיטות, על הסיום של הניסוי EOG, המתת חסד הצלופח anesthetized עם מנת יתר של MS222 (1 g/L).
    הערה: ודא המתת חסד מוצלחת מאת וציין את חוסר תנועה גיל הדופק לפחות 5 דקות ואחריו pithing המוח.
  18. לנתח, להתוות נתונים באמצעות ניתוח תוכנה. לקבוע סף גילוי של odorants22 לזהות בשברים מדיף להפיק תגובות יותר הפקד ריק מים. הבריכות שבר זה להפיק תגובות חוש הריח תלויי-ריכוז שונים מאשר הפקד ריק מים ואז נבדקים וזמינותו התנהגותית (שלב 4).

4. הבחירה השנייה מבוך Bioassay התנהגותית כדי לזהות שברים/חומרים פעילים בהתנהגותו

  1. חבל הצלופח ים נקבה בוגרת מינית בכלוב שחרור במבוך (ראה איור משלים 1) עבור 5 דק לשמור על קצב הזרימה של המים בנהר בתוך המבוך
    הערה: המבוך בנוי מידות 6.5 מ' אורך ו- 1.2 מ' רוחב, כיתה ימיים עם הציפוי עץ עם מחיצה 2.7 מ' אורך כדי להפריד את המבוך לתוך שני ערוצים בסוף במעלה הזרם. מים היא זמנית מופנת במבוך. עומק המים צריך להישמר 0.19 m ואת המהירות צריכה להישמר m/s 0.07 ± 0.01.
  2. לשחרר את הצלופח ים ולהקליט את כמות מצטברת בזמן הצלופח נמצא ניסיוני וערוץ שליטה כל נהר המכיל מים למשך 10 דקות.
    הערה: אם הצלופח ים נכשל להזין את ניסיוני ולשלוט ערוץ במשך לפחות 10 s בתקופה זו 10 דקות ', בסוף המשפט, זה מעיד על חוסר פעילות או הצדדי החזק הטיה.
  3. להחיל את הגירוי מבחן (קרי, פרומון בשם-10-12 מ' מומס במים מתנול/יונים 50%) בערוץ ניסיוני מוקצות באופן אקראי, את כלי הרכב (50% מים מתנול/יונים) ערוץ הבקרה באמצעות ממברנות משאבות במחירים קבועים של 200 mL/min במשך 5 דקות.
    הערה: זיהוי סף הריכוז של הגירוי הבדיקה כפי שנקבע עם ההקלטות אלקטרו-olfactogram צריכה לשמש את הריכוז ההתחלתי עבור הבדיקה התנהגותית.
  4. להחיל את הגירוי הבדיקה ועל הרכב 10 דקות נוספות ולהקליט את כמות הזמן מבלה את הצלופח המצטבר ב- ניסיוני ערוץ הבקרה.
  5. לרוקן את המבוך עם מים למשך 10 דקות לפני תחילת המשפט הבא. חזור על שלבים 4.1-4.4 עם lampreys לפחות 7 אם מספיק גירוי הבדיקה זמין.
  6. לחשב אינדקס של העדפה22 בכל ניסוי והערכת החשיבות באמצעות מבחן דרגה חתם Wilcoxon.
    הערה: המדד התוצאה מספר בודד יכול להיות חיובי או שלילי. ערך חיובי של המדד של העדפה מציין משיכה, ואילו ערך שלילי של מדד שבמרבית אינדיקציות העדפה. אם האינדקס של העדפה משמעותית שונה מאפס, נחשבת השבר הפעילים.
    figure-protocol-1
    כאן,
    Bc = הזמן המושקע על ידי הצלופח מבחן בערוץ הבקרה לפני יישום ה-odorant,
    Be = הזמן המושקע של הערוץ ניסיוני לפני יישום ה-odorant,
    C = הזמן המושקע של ערוץ הבקרה לאחר יישום ה-odorant, ו
    E = הזמן המושקע של הערוץ ניסיוני לאחר היישום odorant.

5. כרומטוגרפי בידוד של תרכובות טהור מפני שברים פעילים

  1. חזור על שלבים 2.1 2.4 עם הבריכות שבר זה זירוז תגובות חוש הריח (שלב 3) וירתקו את תגובות התנהגותיות (שלב 4).
  2. בהמשך לטהר השברים הפעילים למתחמים עם גודל הוצאת גזים באמצעות עמודה ספדקס LH-20.
    1. הכנת המדגם ב- 0.5 מ"ל בשלב הראשוני נייד [CHCl3- MeOH (1:1) או MeOH 100%], לטעון לתוך העמודה התואמת CHCl3- MeOH (1:1) בעמודה ולאחר מכן בעמודה MeOH (100%) ו- elute אותם להניב תרכובות.

6. מבנה הבהרה של תרכובת טהורה עם ספקטרומטר מסה (MS), תהודה מגנטית גרעינית (NMR)

  1. ו לדלל את המתחם מטוהרים בשלב הראשוני ניידים (בדרך כלל, מתנול כדי מים, 1:1, v: v) ביצועים גבוהים כרומטוגרפיה נוזלית (HPLC) כדי ליצור פתרון μL 10 של 1 μg/mL.
    1. להעביר את הפתרון מדגם HPLC בקבוקונים ולהגדיר אותם לתוך תעשיה של HPLC. להזריק את הדגימה (10 μL) לתוך ספקטרומטר מסה יינון (ESIMS) ספקטרומטריית electrospray והקלטה ברזולוציה גבוהה ספקטרומטריית electrospray יינון ספקטרומטר מסה (HRESIMS) ספקטרום באמצעות ספקטרומטר מסה של כרומטוגרפיה23.
  2. לחזות את הנוסחה המולקולרית לפי מסד הנתונים בתוכנה ספקטרומטר מסה (ראה טבלה של חומרים)24.
    1. פתח את chromatogram של המדגם מוזרק, לקבל ספקטרום המונית שלו על-ידי בחירת הפסגה כרומטוגרפי.
    2. קלט המסה נמדד יון (מ/z) לערך (4 ספרות עשרוניות) בהרכב אלמנטלים תחת המודול הכלי . להגדיר את הפרמטר סובלנות לפפ < 5.
    3. כוונן את הפרמטרים סמל להתאמת הרכב אלמנט של המולקולה נמדד. התוכנה יוצרת חיזוי של נוסחה מולקולרית מבוסס על ניתוח המוני יחיד.
  3. בחר את ממיסים deuterated (600 μL, CH-אה -3-d-4 או דימתיל סולפוקסיד -ד6) לפי פרוטוקול25 כדי להמיס את הדגימות.
    1. נמסים לחלוטין על מדגם ממיסים deuterated שנבחר כדי ליצור פתרון עם ריכוז ועד כ 0.1 10 מ"ג/מ"ל. להעביר את הפתרון מדגם לתוך צינור NMR כדי להקליט את D 1 (1H, 13ג) ו- 2D NMR [1H -1H המתאם ספקטרוסקופיה (COSY), heteronuclear יחיד קוהרנטיות קוונטית (HSQC), heteronuclear מרובים המתאם בונד (HMBC)] ספקטרה על 900 מגה-הרץ NMR ספקטרומטר26.
  4. מקום ברכבת התחתית NMR עם הדגימה בתוך הטורבינה ספינר. השתמש מד עומק כדי להבטיח שגובה מדגם הוא באמצע החלון מדידה. לפתוח את התוכנה NMR (ראה טבלה של חומרים), ולחץ על הלחצן ' להרים ' כדי לשנות את הדוגמה של המגנט.
    הערה: החזק יד מעל החלק העליון של המגנט להרגיש את הגז מגיע מהחלק העליון של המגנט. במקביל, צליל whistling צריך להיות נשמעים.
  5. בעדינות מניחים את הדגימה על כרית אוויר על גבי המגנט, לחצו על הכפתור להרים שוב לרדת המדגם לתוך המגנט NMR.
    הערה: הקשיבו רעש "לחץ" לציין שהדגימה היא בתנוחה הנכונה.
  6. ליצור dataset חדש ולטעון הפרמטרים של ברירת המחדל המומלץ על ידי המכשיר NMR (ראה טבלה של חומרים).
    1. הקלד "נעילה" כדי להפעיל את הליך נעילה אוטומטי ולבחור הממס בדף בקשה.
    2. להתאמות, לוח לשנות, להתאים את לחצן הנעילה במודל, להתאים את הסמן על הלוח לשנות, לנעול את המגנט שוב.
    3. על הבקשה Atma דף, להתאים את הפרמטר בחלונית ' לשנות ' להליך כוונון, אשר עשוי להימשך דקות אחדות. המתן עד כוונון השלמת כדי להמשיך.
    4. הפעל את השגרה shimming אוטומטית על-ידי הקלדת "topshim" בשורת. לחכות עד shimming השלמת כדי להמשיך.
    5. סוג "rga" כדי להגדיר אוטומטית קבלת התאמות לרווח, אז סוג "d1" כדי להגדיר ההשהיה בין פולסים, אז סוג "zg" כדי להתחיל את הרכישה, המתן עד להשלמת הרכישה.
    6. הקלד "ef" או "efp" כדי לעבד את הנתונים ולאחר מכן הקלד "apk" עבור אוטומטי בהדרגה. לעבד את הנתונים על תוכנת עיבוד NMR.
  7. להבהיר את מבנה כימי על ידי פרשנות של ניתוח הנתונים NMR.
  8. לספור את האותות פחמן בספקטרום 13C NMR. בחר את הנוסחה המולקולרית תואמים התוצאה החזוי ספקטרומטריית ברזולוציה גבוהה (HR-MS).
  9. לשלב את האותות פרוטון בספקטרום H NMR 1והקצה הקישוריות של פחמן פרוטון מבוססות על האותות בספקטרום HSQC.
  10. להקצות הקישוריות של השלד פחמן בהתבסס על מתאמים 1H -1H נעימים HMBC הספקטרום.
  11. באופן לא סופי להקצות את המבנה הכימי מבוסס על מבנה הרציונל27. חיפוש מבנה סופי במסדי הנתונים המבנה הכימי. להשוות את מבנה סופי עם אנלוגים בהפניות.
  12. הקצה את תצורת יחסי עם הקשת ספקטרוסקופיה אפקט Overhauser הגרעין (NOESY).
    הערה: מאז מאפייני הזהות enantiomers המוצג על מסות ואת שיטות ספקטרוסקופיות זהים, התצורה המוחלטת של תרכובות מסוימות, במיוחד אלה עם 2'-אלכוהול ו 2'-NH2, חייב להיקבע עם תגובה derivatization. לאחר התגובה derivatization, ההבדלים הצביעו על הספקטרום להקל את ההקצאה חד-משמעית של התצורות מוחלטת של תרכובות רוב28.

7. EOG Bioassay לאשר תרכובות טהורה הם מדיף ופעיל בהתנהגותו

  1. חזור על שלבים 3.1-3.5.
  2. על עקומת ריכוז-תגובה, להכין 10 מ"ל של דילולים 10-fold של תרכובות טהור מ 10-6 מ' - 10-13 מ' של 10-3 מ' פרומון פתרון מניות ב- 50% מתנול/מים מאוחסן ב-20 ° C מבוסס על משקל מולקולרי נקבע שלב 6.2. לשים את הבקבוקונים זכוכית עם פתרונות עבודה של L-ארגנין ותרכובות טהור באמבט מים recirculating כדי לאפשר לטמפרטורה equilibrate ל 8 מעלות צלזיוס.
  3. חזור על שלבים 3.7-3.18.
  4. חזור על שלבים 4.1-4.2.
  5. חלות המתחם טהור-EOG זיהוי סף הריכוז בערוץ ניסיוני מוקצות באופן אקראי ועל הרכב (50% מים מתנול/יונים) לערוץ שליטה באמצעות משאבה סחרור במחירים קבועים של 200 mL/min במשך 5 דקות.
  6. חזור על שלבים 4.4-4.6.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

דיאגרמה סיכום השלבים המתוארים הפרוטוקול של fractionation מונחה bioassay מוצג באיור1. הפרוטוקול כרוכה בצעדים כדי לבודד ולאפיין את המבנה, את חוש הריח, והכוחות הפעילות התנהגותית של עגולי הפה ים בשם 5 פרומונים (איור 2). שימוש המוני spectrometric ו- NMR נתונים (איור 3 ו- 4 באיור), מבנה petromyzene A-B petromyzone A-C היו מבואר מן המים ממוזגים עם22...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

דגים חיים בעולם כימי מלא של תרכובות, ובכל זאת להיות מזוהה. Fractionation מונחה bioassay הוכיחו חיוניים כדי לזהות ולאפיין מולקולות ביו המתווכות אינטראקציות כימיות רבות, כגון אלה הנהוגות סלמון masu ב31פילים אסיאתיים32, ים lampreys33, 34,35. Fractionation מונחה bioassay היא גישה יעילה במדויק לאתר ולחלץ לאתר במדויק תרכובות ביו מן ההתחלה אל המתחם פעיל מטוהרים. באמצעות גישה זו, תרכובות ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף.

תודות

אנו מודים U.S. גיאולוגי סקר האמונד מפרץ ביולוגי תחנת עבור שימוש במתקני המחקר שלהם ואת הצוות של ארה ב דגים, שירות חיות הבר והדיג וקנדה האוקיינוסים למתן lampreys ים. מחקר זה נתמך על ידי מענקים של הנציבות דוגה הימות הגדולות Weiming Li ו- Ke Li.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
נימי בורוסיליקט קיר סטנדרטיים פרימיום עם נימה של וורנר אינסטרומנטסG150F-4(OD 1.5 מ"מ, קוטר פנימי 0.86 מ"מ)
מכשיר מושך פיפטהNarishigePC-10מושך אלקטרודות עבור EOGs
חותך זכוכית עם קצה יהלוםחיתוך גנרישל אלקטרודות עבור נימי
זכוכית בורוסיליקטEOG World Precision Instruments1B150-4צינור אספקת ריח עבור EOG
מחזיק אלקטרודה הקלטה גוף ישר מסדרת E עם גלולה Ag / AgCl עבור נימי זכוכית OD 1.5 מ"מWarner InstrumentsESP-M15Nמחזיק אלקטרודה הקלטה
מחזיק אלקטרודה התייחסות סדרת E עם ידית עם  Ag/AgCl גלולה  עבור נימי זכוכית OD 1.5 מ"מוורנר אינסטרומנטסE45P-F15NHמחזיק אלקטרודות ייחוס
1 מ"מ סיכהוורנר אינסטרומנטסWC1-10לגשר מחזיקי אלקטרודות ייחוס והקלטה
2 מ"מפינים וורנר אינסטרומנטסWC2-5לגשר על מחזיקי אלקטרודות ייחוס והקלטה
AgarSigmaA1296למילוי אלקטרודות
אשלגן כלורי (KCl)SigmaP93333M KCl למילוי אלקטרודות ומחזיקי אלקטרודות
מיקרופיל מיקרופיפטהWorld Precision InstrumentsMF28G-5למילוי אלקטרודות ומחזיקי אלקטרודות
L-ArginineSigmaA5006ריח בקרה חיובי עבור EOG
מתנולSigma34860
אמבט מיםבהתאמה אישיתN/Aמחזיק ריחות עבור EOG
3-aminobenzoic acid ethyl ester (MS222)Syndel USATricaine1GEOG חומר הרדמה
גלמין טריאתיודידSigmaG8134-5GEOG
משתק 1 מ"ל מזרקBD Biosciences301025עורית משותקת
26G 5/8BD Biosciences305115למתן
מהדק רולרדיוק עולמי מכשירים14043-20התאמת קצב הזרימה של חומר הרדמה לתוך פיו של הצמד
נתרן כלורי (NaCl)J.T. Baker3624-05להכנת מעמד פלסטיק בצורת V 0.9% מלח
כשלב דגימהבהתאמה אישיתN/Aמחזיק צמדים במהלך
שוקת פלסטיקEOG N/Aבהתאמה אישית מחזיק מעמד פלסטיק בצורת V במהלך
להבי אזמל EOG - #11Fine Science Tools10011-00לדיסקציה EOG
ידית אזמל - #3Fine Science Tools10003-12לדיסקציה EOG
מלקחיים ישרים עדינים במיוחדFine Science Tools11252-00לדיסקציה EOG, Dumont #5SF מלקחיים
מעוקלים עדינים במיוחדFine Science Tools11370-42לדיסקציה EOG, Moria MC40B
מספרייםישריםFine Science Tools15003-08לדיסקציה EOG
סטריאומיקרוסקופZeissDiscovery V8לדיסקציה
EOG אור תאורהZeissCL 1500 ECOלדיסקציה EOG
צינורות פלסטיקגנרילחיבור הגדרת EOG במחזור מחדש ואמבטיות מים
אספקת ריחבהתאמה אישיתN/A
In מסנן קו וסט אטמיםחברת LeeTCFA1201035A
מיקרומניפולטוריםNarishigeMM-3למיקום אלקטרודות וצינור נימי אספקת ריח
התקני אחיזה מגנטייםKanetecMB-K
נהג שסתוםArduinoבהתאמה אישיתלשליטה על פתיחת השסתום לגירוי ריח
שסתום אלקטרומגנטילי שסתוםLFAA1201618Hשל החברה לגירוי ריחות
מגבר NeuroLog AC/DCDigitimer Ltd.NL106להגדלת המשרעת של האות האליקטרי
NeuroLog DC קדם-מגבר עםDigitimer Ltd.NL102Gלהגדלת המשרעת של האות האליקטרי
מסנן 60 הרץ נמוכיםDigitimer Ltd.NL125
DigitizerMolecular Devices LLCAxon Digidata 1440A
מחשב Dell (OptiPlex 745) מריץ תוכנת רכישת נתונים AxoscopeMolecular Devices LLCAxoScope גרסה 10.4
כלוב פאראדייבהתאמה אישיתN/Aמיגון רעש אלקטרומגנטי
מבוך דו-ברירהמותאם אישיתN/Aדיקט ימי עמיד למים מכוסה תוחם פלסטיק
משאבת אשפההונדהWT30XK4Aממלא מבוך במים מהנהר הסמוך
משאבה פריסטלטית עם צינורותקול פארמרMasterflex 07557-00לניהול ריחות במבוך
מחולל אינוורטרהונדהEU1000iמפעיל משאבה פרסטלטית
כלוב שחרורבהתאמה אישיתN / Aמשמש לאקלום צמדים במבוך
רשתגנריתשימשה להכיל את ממדי המבוך ולמזער מערבולות מים עם גלילי רשת
דליים (5 ליטר)גנרילערבוב ריחות
מד זרימהMarsh-McBirneyFlo-Mate 2000למדידת פריקה
XAD 7 שרף HPDow כימי37380-43-1למיצוי מים ממוזגים 
מתנולסיגמא34860למיצוי מים ממוזגים 
אמבט מיםYamatoBM 200לשאיבת מים ממוזגים 
מייבש הקפאהLabconcoCentriVap Concentratorלמיצוי מים ממוזגים
כלורופורםSigmaCX1050לבידוד בריכות שברים
סיליקה ג'ל 70-230 רשתSigma112926-00-8לבידוד בריכות שברים
סיליקה ג'ל 230-400 רשתSigma112926-00-8לבידוד בריכות שברים
סיליקה מצופה מראש ג'ל TLC צלחותSigma99571לבידוד מאגרי שברים
אניסלדהידSigmaA88107לבידוד מאגרי שברים
Sephadex LH-20GE Healthcare17-0090-01לבידוד בריכות שברים
Amberlite XAD 7 שרף HPSigmaXAD7HPלמיצוי מים ממוזגים 
4, עמודי זכוכית בקיבולת 2.5 ליטראייס זכוכית בע"מ.5820לשאיבת מים ממוזגים 
אצטוןסיגמא650501למיצוי מים ממוזגים 
TQ-S TOF LC ספקטרומטר מסה (או שווה ערך)Waters Co.N/Aלהבהרת מבנה
משאבת HPLC בינאריתWaters Co.1525לבידוד של בריכות/תרכובות שברים
ספקטרומטר NMR זריז, 900MHz (או שווה ערך)AgilentN/Aלהבהרת מבנה
מערכת ייבוש RotovapBuchiRIIלמיצוי מים ממוזגים 
מנורת UV (254 ננומטר)ספקטרוניקס ושות'ENF-240Cלכרומטוגרפיה בשכבה דקה 
אלקטרודת הקלטה וייחוס קצה אגר מותך למתן מחט תת משותק צינורות של

מקורות

  1. Wyatt, T. D. Pheromones and Animal Behavior: Chemical Signals and Signatures. , Cambridge University Press. Cambridge, UK. (2014).
  2. El-Sayed, A. M. The pherobase: database of insect pheromones and semiochemicals. , Available from: http://www.pherobase.com (2009).
  3. Zhu, J., et al. Reverse chemical ecology: Olfactory proteins from the giant panda and their interactions with putative pheromones and bamboo volatiles. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (46), E9802-E9810 (2017).
  4. Leal, W. S. Reverse chemical ecology at the service of conservation biology. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (46), 12094-12096 (2017).
  5. Carde, R. T., Minks, A. K. Control of moth pests by mating disruption: successes and constraints. Annual Review of Entomology. 40 (1), 559-585 (1995).
  6. Witzgall, P., Kirsch, P., Cork, A. Sex pheromones and their impact on pest management. Journal of chemical ecology. 36, (2010).
  7. Cheng, Y. -n, Wen, P., Dong, S. -h, Tan, K., Nieh, J. C. Poison and alarm: the Asian hornet Vespa velutina uses sting venom volatiles as an alarm pheromone. Journal of Experimental Biology. 220 (4), 645-651 (2017).
  8. Howse, P., Stevens, J., Jones, O. T. Insect Pheromones and Their Use in Pest Management. , Springer Science & Business Media. (2013).
  9. Pizzolon, M., et al. When fathers make the difference: efficacy of male sexually selected antimicrobial glands in enhancing fish hatching success. Functional Ecology. 24 (1), 141-148 (2010).
  10. Stacey, N., Sorensen, P. Hormones in communication | Hormonal Pheromones Encyclopedia of Fish Physiology. , Elsevier Inc. (2011).
  11. Kobayashi, M., Sorensen, P. W., Stacey, N. E. Hormonal and pheromonal control of spawning behavior in the goldfish. Fish Physiology and Biochemistry. 26 (1), 71-84 (2002).
  12. Stacey, N. Hormonally-derived pheromones in teleost fishes. Fish Pheromones and Related Cues. , 33-88 (2015).
  13. Kuhlisch, C., Pohnert, G. Metabolomics in chemical ecology. Natural Product Reports. 32 (7), 937-955 (2015).
  14. Prince, E. K., Pohnert, G. Searching for signals in the noise: metabolomics in chemical ecology. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 396 (1), 193-197 (2010).
  15. Teeter, J. Pheromone communication in sea lampreys (Petromyzon marinus): implications for population management. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 37 (11), 2123-2132 (1980).
  16. Moore, H., Schleen, L. Changes in spawning runs of sea lamprey (Petromyzon marinus) in selected streams of Lake Superior after chemical control. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 37 (11), 1851-1860 (1980).
  17. Vrieze, L. A., Bergstedt, R. A., Sorensen, P. W. Olfactory-mediated stream-finding behavior of migratory adult sea lamprey (Petromyzon marinus). Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 68, (2011).
  18. Wagner, C. M., Jones, M. L., Twohey, M. B., Sorensen, P. W. A field test verifies that pheromones can be useful for sea lamprey (Petromyzon marinus) control in the Great Lakes. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 63 (3), 475-479 (2006).
  19. Wagner, C. M., Twohey, M. B., Fine, J. M. Conspecific cueing in the sea lamprey: do reproductive migrations consistently follow the most intense larval odour? Animal Behaviour. 78, (2009).
  20. Siefkes, M. J., Winterstein, S. R., Li, W. Evidence that 3-keto petromyzonol sulphate specifically attracts ovulating female sea lamprey Petromyzon marinus. Animal Behaviour. 70, (2005).
  21. Siefkes, M. J., Steeves, T. B., Sullivan, W. P., Twohey, M. B., Li, W. Sea lamprey control: past, present, and future. Great Lakes Fisheries Policy and Management. , Michigan State University Press. East Lansing, MI. 651-704 (2013).
  22. Li, K., et al. Three Novel Bile Alcohols of Mature Male Sea Lamprey (Petromyzon marinus) Act as Chemical Cues for Conspecifics. Journal of Chemical Ecology. 43 (6), 543-549 (2017).
  23. Hird, S. J., Lau, B. P. -Y., Schuhmacher, R., Krska, R. Liquid chromatography-mass spectrometry for the determination of chemical contaminants in food. TRAC Trends in Analytical Chemistry. 59, 59-72 (2014).
  24. Little, J. L., Williams, A. J., Pshenichnov, A., Tkachenko, V. Identification of "known unknowns" utilizing accurate mass data and ChemSpider. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 23 (1), 179-185 (2012).
  25. Beckonert, O., et al. Metabolic profiling, metabolomic and metabonomic procedures for NMR spectroscopy of urine, plasma, serum and tissue extracts. Nature Protocols. 2 (11), 2692(2007).
  26. Kaiser, B., Wright, A. Draft Bruker XRF Spectroscopy User Guide: Spectral Interpretation and Sources of Interference. , BRUKER. Madison, WI. (2008).
  27. Breitmaier, E., Sinnema, A. Structure Elucidation by NMR in Organic Chemistry: A Practical Guide. , Wiley. Chichester, New York, Brisbane, Toronto, Singapore. (1993).
  28. Seco, J. M., Quinoá, E., Riguera, R. The assignment of absolute configuration by NMR. Chemical Reviews. 104 (1), 17-118 (2004).
  29. Li, K., et al. Bile Salt-like Dienones Having a Novel Skeleton or a Rare Substitution Pattern Function as Chemical Cues in Adult Sea Lamprey. Organic Letters. , (2017).
  30. Li, K., Buchinger, T. J., Li, W. Discovery and characterization of natural products that act as pheromones in fish. Natural Product Reports. , In press (2018).
  31. Yambe, H., et al. L-Kynurenine, an amino acid identified as a sex pheromone in the urine of ovulated female masu salmon. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (42), 15370-15374 (2006).
  32. Rasmussen, L., Lee, T. D., Zhang, A., Roelofs, W. L., Daves, G. D. Jr Purification, identification, concentration and bioactivity of (Z)-7-dodecen-1-yl acetate: sex pheromone of the female Asian elephant, Elephas maximus. Chemical Senses. 22 (4), 417-437 (1997).
  33. Sorensen, P. W., et al. Mixture of new sulfated steroids functions as a migratory pheromone in the sea lamprey. Nature Chemical Biology. 1 (6), 324-328 (2005).
  34. Hoye, T. R., et al. Details of the structure determination of the sulfated steroids PSDS and PADS: New components of the sea lamprey (Petromyzon marinus) migratory pheromone. The Journal of organic chemistry. 72 (20), 7544-7550 (2007).
  35. Fine, J. M., Sorensen, P. W. Isolation and biological activity of the multi-component sea lamprey migratory pheromone. Journal of Chemical Ecology. 34 (10), 1259-1267 (2008).
  36. De Buchinger, T. J., Wang, H., Li, W., Johnson, N. S. Evidence for a receiver bias underlying female preference for a male mating pheromone in sea lamprey. Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 280, (2013).
  37. De Bruyne, M., Baker, T. Odor detection in insects: volatile codes. Journal of Chemical Ecology. 34 (7), 882-897 (2008).
  38. Bradshaw, J., Baker, R., Lisk, J. Separate orientation and releaser components in a sex pheromone. Nature. 304 (5923), 265-267 (1983).
  39. Linn, C., Campbell, M., Roelofs, W. Pheromone components and active spaces: what do moths smell and where do they smell it. Science. 237 (4815), 650-652 (1987).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

NMR

מאמרים קשורים