תפוקה גבוהה, גבוהה-תוכן, בנוזל C. elegans Pathosystem

Summary

כאן נתאר פרוטוקול הוא מתאקלם מהר, כל מחשב מארח, כלי סינון גבוהה-תוכן יכול להיות מנוצל כדי ללמוד אינטראקציות פתוגן-פונדקאי ולשמש לצורך גילוי תרופות.

Abstract

מספר תרופות חדשות שזוהו על ידי מסורתית, מסכי במבחנה נחלשה, הפחתת ההצלחה של גישה זו בחיפוש אחר נשק חדש למאבק רב תרופתיים. זה הוביל למסקנה כי החוקרים אינם רק צורך למצוא תרופות חדשות, אבל גם צריך לפתח דרכים חדשות למצוא אותם. בין המועמד המבטיח ביותר שיטות הן כל-אורגניזם, ויוו assays המפרט את השימוש תפוקה גבוהה, פנוטיפי ומארח שנעים בטווח שבין Caenorhabditis elegans ל רזבורה rerio. מארחים אלה יש מספר יתרונות רב עוצמה, כולל הפחתה דרמטית כניסות חיובי כוזב, שחרורן תרכובות רעילים המארח ו/או biounavailable הם בדרך כלל במסך הראשוני, לפני בצע יקר למעלה.

הנה אנחנו מראים כיצד נעשה שימוש assay שלנו לחקור מארח את הוריאציה מתועדת היטב C. elegans—Pseudomonas aeruginosa הרג נוזלי pathosystem. אנחנו גם להוכיח מספר הרחבות של טכניקה זו הסתדר היטב. לדוגמה, אנו מסוגלים לבצע את מסכי גנטי תפוקה גבוהה באמצעות RNAi ב 24 - או 96-ובכן צלחת תבניות לגורמים מארח שאילתה באינטראקציה זה פתוגן-פונדקאי. שימוש assay הזה, מסכי הגנום כולו ניתן להשלים רק כמה חודשים, אשר יכול באופן דרמטי לפשט את המשימה של זיהוי מטרות סמים, שעשוי להיות ללא צורך גישות טיהור הביוכימי מפרך.

אנחנו גם מדווחים כאן וריאציה של השיטה שלנו, שמחליפה את חיידק גראם חיוביים Enterococcus faecalis עבור המחלה גראם שליליים aeruginosa פ. כמו כן עבור aeruginosa פ, הרג מאת faecalis אי הוא תלוי-זמן. בניגוד הקודם C. elegans– מבחניאי faecalis , וזמינותו שלנו עבור faecalis אי לא דורשת preinfection, שיפור פרופיל הבטיחות שלה והפחתת הסיכוי לזיהום ציוד למיון נוזלי. וזמינותו היא חזקה מאוד, מציג ~ 95% שיעורי המוות 96 h פוסט זיהום.

Introduction

בזיהוי ופיתוח של אפקטיביות, ותתנו לו אנטיביוטיקה, עכשיו כמעט לפני מאה שנה, הוביל רגע של התעוררות בתחום בריאות הציבור איפה שהיתה אמונה פרושות לרווחה כך זיהומיות מחלות יהיה יסורים של העבר. בתוך כמה עשורים קצר, האופטימיות הזו החלה לדעוך, כמו הפתוגן לאחר הפתוגן פיתחו מנגנוני ההתנגדות המוגבלת הטיפולים פעם מופלא. כבר כמה זמן, מרוץ החימוש בין במאמצי הגילוי סמים פתוגנים נראה מאוזן. עם זאת, ניצול לרעה של antimicrobials שהגיע לשיא לאחרונה לצמיחתה של זנים עמידים בפני פאן-התרופה של pneumoniae קלבסיאלה, Acinetobacter baumanii, בסרישיה marcescensו פ aeruginosa^{1, 3,}

Protocol

התראה: aeruginosa פ ו א faecalis פתוגנים אבטחה ברמה 2, נאות אמצעי זהירות יש לנקוט כדי למנוע זיהום מקרי וכדי לצמצם את זיהום של משטחים. כל המדיה והחומרים אשר באים במגע עם פתוגנים חייב להיות מעוקר ו/או שנמחקו. הנחיות נוספות זמינות מהפרסום CDC אבטחה Microbiological, ביו מעבדות (BMBL), המהדורה החמישית.

1. הכנה ותחזוקה של aeruginosa פ

1. פס aeruginosa פ מ מניה קפוא על גבי צלחת אגר ליברות (Lysogeny מרק). דגירה 16 עד 24 h ב 37 ° C
   הערה: לבצע ניסויים aeruginosa פ בתוך ביטחון ביולוגי BSL-2 בארון כדי להבטיח עקרות. השתמש זהירות מתאימים כדי למזער את הסיכוי פתוגניים דלקת או זיהום.
2. להעביר את....

Results

פרמטרים חשובים לביצועים assay

הבנה נכונה של הביולוגיה שבבסיס assay הזה הוא הכרחי עבור פתרון בעיות ומיטוב וזמינותו. לשם כך, אנו מתייחסים קודם בכמה עיתונים מרכזיים שחקרתי על מנגנוני פתוגנזה של פ aeruginosa-מתווכת הורג נוזלי^7,20. ובלבד השלבים המתוארים לעיל עוקבים (ראו איור 1 סכימטי של פרוטוקול assay) רצח תלויי-זמן של C. el.......

Discussion

זה assay (או מבחני דומה שבו פתוגנים אחרים המוחלפים aeruginosa פ או faecalis א) שימושי למגוון רחב של מטרות, לרבות גילוי תרופות. זה שימושי גם למיעון שאלות הביולוגיים הבסיסיים, כגון בזיהוי הגורמים התקפה אלימה, הבהרה של המארח ההגנה מסלולים, וקביעת את הרגולציה והמיכון באינטראקציה פתוגן-פונדקאי.

למרות וזמינותו aeruginosa פ הרג נוזלי עמיד, ישנן מספר נקודות איפה צריך להיות משולם תשומת לב כדי למזער את הסיכוי לכשל. ראשית, כאמור, הצלחת מקור חיידקי על ההזרקות aeruginosa פ

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
COPAS FP BioSorter	Union Biometrica		אובייקט גדול זרימת ציטומטר / סדרן תולעים
Cytation 5	BioTek
EL406 מכונת כביסה מתקן	BioTek
Multitron Pro	Infors HT
24 עמוק באר RB בלוק	תרמו פישר מדעי	CS15124
384 בארות צלחת	גריינר Bio-One	MPG-781091
מצע גידול נמטודות (NGM)			כמות לליטר: 18 גרם אגר, 3 גרם NaCl, 2.5 גרם פפטון, 1 מ"ל CaCl2 (1 מ'), 1 מ"ל MgSO<תת>4 (1 מ'), 25 מ"ל מאגר פוספט ו-973 מ"ל של
צלחות			הרג איטי (SK) של מים מילי-Qכמות לליטר: 18 גרם אגר, 3 גרם NaCl, 3.5 גרם פפטון, 1 מ"ל CaCl2 (1 M), 1 מ"ל MgSO4 (1 M), 25 מ"ל מאגר פוספט ו-973 מ"ל של
		הרג איטי (SK)	כמות לליטר:  3 גרם NaCl, 3.5 גרם פפטון, 1 מ"ל CaCl2 (1 M), 1 מ"ל MgSO4 (1 M), 25 מ"ל מאגר פוספט ו-973 מ"ל של מי milli-Q
מרק ליזוגני (LB)	USBiological Life Sciences	L1520
Brian Heart Infusion Broth (BHI)	Research Products International Corp	50-488-526
תמיסת			אקונומיקה תולעיםכמות ל-100 מ"ל: 10 מ"ל של תמיסת 5 M NaOH, 20 מ"ל של תמיסת נתרן היפוכלוריט 5% ו-70 מ"ל של מים סטריליים
בסיסית			לליטר: 5.85 גרם NaCl, 6 גרם KH2PO4, 1 גרם K2HPO4, ו-1 ליטר מים מילי-Q
אגר	USBמדעי החיים האיולוגיים	A0930
	NaCl USBמדעי החיים האיולוגיים	S5000
פפטון	USBמדעי החיים האיולוגיים	P3300
CaCl2	USBמדעי החיים האיולוגיים
MgSO4	Fisher Scientific	M63-500
מאגר			לליטר: 132 מ"ל של K2HPO4 (1M) ו-868 מ"ל של KH2PO4 (1M)
KH2PO4	Acros Organics	7778-77-0
K2HPO4	USBiological Life Sciences	P5100
5% תמיסת נתרן היפוכלוריט	BICCA	7495.5-32
תמיסת NaOH	Fisher Scientific	SS255-1
Breathe-easy	מגוון ביוטק	BEM-1
SYTOX כתם חומצת גרעין כתום	פישר סיינטיפיק	S11368
<זני חיידקים חזקים>
P. aeruginosa (PA14)<
em>E. faecalis(OG1RF)
E. coli superfood (OP50)
E. coli RNAi (HT115)
זני תולעים <
em>glp-4(bn2) (Beanan and Strome, 1992, PMID: 1289064)
PINK-1::GFP reporter (Kang et al., 2018, PMID: 29532717)