Method Article

תפוקה גבוהה, גבוהה-תוכן, בנוזל C. elegans Pathosystem

DOI:

10.3791/58068

⸱

July 1st, 2018

 ,  , 
1Department of Biosciences, Rice University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן נתאר פרוטוקול הוא מתאקלם מהר, כל מחשב מארח, כלי סינון גבוהה-תוכן יכול להיות מנוצל כדי ללמוד אינטראקציות פתוגן-פונדקאי ולשמש לצורך גילוי תרופות.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מספר תרופות חדשות שזוהו על ידי מסורתית, מסכי במבחנה נחלשה, הפחתת ההצלחה של גישה זו בחיפוש אחר נשק חדש למאבק רב תרופתיים. זה הוביל למסקנה כי החוקרים אינם רק צורך למצוא תרופות חדשות, אבל גם צריך לפתח דרכים חדשות למצוא אותם. בין המועמד המבטיח ביותר שיטות הן כל-אורגניזם, ויוו assays המפרט את השימוש תפוקה גבוהה, פנוטיפי ומארח שנעים בטווח שבין Caenorhabditis elegans ל רזבורה rerio. מארחים אלה יש מספר יתרונות רב עוצמה, כולל הפחתה דרמטית כניסות חיובי כוזב, שחרורן תרכובות רעילים המארח ו/או biounavailable הם בדרך כלל במסך הראשוני, לפני בצע יקר למעלה.

הנה אנחנו מראים כיצד נעשה שימוש assay שלנו לחקור מארח את הוריאציה מתועדת היטב C. elegans—Pseudomonas aeruginosa הרג נוזלי pathosystem. אנחנו גם להוכיח מספר הרחבות של טכניקה זו הסתדר היטב. לדוגמה, אנו מסוגלים לבצע את מסכי גנטי תפוקה גבוהה באמצעות RNAi ב 24 - או 96-ובכן צלחת תבניות לגורמים מארח שאילתה באינטראקציה זה פתוגן-פונדקאי. שימוש assay הזה, מסכי הגנום כולו ניתן להשלים רק כמה חודשים, אשר יכול באופן דרמטי לפשט את המשימה של זיהוי מטרות סמים, שעשוי להיות ללא צורך גישות טיהור הביוכימי מפרך.

אנחנו גם מדווחים כאן וריאציה של השיטה שלנו, שמחליפה את חיידק גראם חיוביים Enterococcus faecalis עבור המחלה גראם שליליים aeruginosa פ. כמו כן עבור aeruginosa פ, הרג מאת faecalis אי הוא תלוי-זמן. בניגוד הקודם C. elegans– מבחניאי faecalis , וזמינותו שלנו עבור faecalis אי לא דורשת preinfection, שיפור פרופיל הבטיחות שלה והפחתת הסיכוי לזיהום ציוד למיון נוזלי. וזמינותו היא חזקה מאוד, מציג ~ 95% שיעורי המוות 96 h פוסט זיהום.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בזיהוי ופיתוח של אפקטיביות, ותתנו לו אנטיביוטיקה, עכשיו כמעט לפני מאה שנה, הוביל רגע של התעוררות בתחום בריאות הציבור איפה שהיתה אמונה פרושות לרווחה כך זיהומיות מחלות יהיה יסורים של העבר. בתוך כמה עשורים קצר, האופטימיות הזו החלה לדעוך, כמו הפתוגן לאחר הפתוגן פיתחו מנגנוני ההתנגדות המוגבלת הטיפולים פעם מופלא. כבר כמה זמן, מרוץ החימוש בין במאמצי הגילוי סמים פתוגנים נראה מאוזן. עם זאת, ניצול לרעה של antimicrobials שהגיע לשיא לאחרונה לצמיחתה של זנים עמידים בפני פאן-התרופה של pneumoniae קלבסיאלה, Acinetobacter baumanii, בסרישיה marcescensו פ aeruginosa1, 3, 2,4.

Aeruginosa פ הוא הזדמנותית, גראם שלילי, מרובה מארחים הפתוגן שמהווה איום חמור לחולים עם כוויות חמורות, מי immunocompromised, או בעלי סיסטיק פיברוזיס. הוא גם יותר ויותר מזוהה בתור סוכן סיבתי זיהומים nosocomial חמורה, במיוחד בשל רכישתה מתמשך של עמידות מיקרוביאלית. כדי להתחיל לתת מענה לאיום הזה, השתמשנו את מתועדת היטב C. elegans-aeruginosa פ זיהום מערכת5. המעבדה שלנו יש ממונף מערכת זו לפתח פלטפורמה ההקרנה בנוזל, תפוקה גבוהה, גבוהה-תוכן כדי לזהות תרכובות הרומן להגביל את יכולתם של המחלה להרוג את המארח6. מסקרן, תרכובות אלו נראה שייך לפחות לשלוש קטגוריות כלליות, כולל antimicrobials7 והתקפה אלימה מעכבי8. אחרים מבחני גילוי סמים גבוהה-תוכן C . elegans דווחו Mycobacterium tuberculosum, כלמידיה trachomatis, Yersinia pestis, ליסטריה, Francisella tularensis, Staphylococcus aureus, קנדידה אלביקנס, ו Enterococcus faecalis, בין היתר9,10,11,12,13,14,15,16. סוגים אלה של מבחני יש מספר יתרונות מוכרת היטב, כגון הגבלת כניסות חיובי כוזב עלולים להיות רעילים הן המארח הפתוגן, גדל הסיכוי הזמינות הביולוגית לעומת מסך כימי, ואת היכולת לזהות את הלהיטים מעבר פשוט הגבלת צמיחת חיידקים, כגון אנטי-virulents, מערכת החיסון מולקולות מופחתים או תרכובות אחרת להטות את האיזון של אינטראקציה פתוגן-פונדקאי לטובת לשעבר. בנוסף, תרכובות גילה במסכים אלה הם לעתים קרובות יעיל בתרבית של המארחים.

ראוי לציין כי לפחות שני אחרים מבחני17,18 זמינים לביצוע בתפוקה גבוהה מסכי C . elegans בנוזל. עם זאת, כל אלה מבחני הוא שינוי המאפשר וזמינותו מעיים-קולוניזציה הטיפוסי, המכונה לאט-הרג, שיש לבצע בנוזל, הגדלת התפוקה ומאפשר תרכובות שיוקרנו בקלות רבה יותר. אפיון זהיר הוכיחה באופן סופי כי המנגנון של התקפה אלימה חיידקי הם שונים בין אלה מבחני שלנו בנוזל מסך7. מאז שני סוגי התקפה אלימה הם נצפו מערכות יונקים, חשוב לקחת בחשבון אילו דטרמיננטה התקפה אלימה רלוונטי ביותר עבור האינטרסים של הנסיין לפני בחירה וזמינותו.

כאן אנחנו מדגימים גירסה אופטימיזציה של בנוזל assay aeruginosa elegans-עמ' ג . אנחנו גם לדווח על ההסתגלות בשיטה assay בנוזל שלנו כדי להכיל את פתוגן חיידקי גראם חיוביים Enterococcus faecalis. כמו aeruginosa פ, א faecalis יותר ויותר מזוהה איום רציני nosocomial עם חימוש הגוברת של עמידות מיקרוביאלית מסלולים1. למרות שיטה קודמת להקרנה תפוקה גבוהה של אי faecalis קיים14, זה דורש preinfection עם המחלה, אשר מסבך את ההליך, מגבירה את הסבירות של מזהם ציוד כמו FlowSort COPAS. פרוטוקול שלנו מבטלת את הצורך לפני הפגיעה, לשפר את פרופיל הבטיחות. לבסוף, אנו מדווחים על אמצעי שבאמצעותו משני מבחני אלה יכול להיות משולב עם האכלה RNAi, המאפשר למשתמש לחפש גורמים מארח לשחק תפקיד בהקמת, או התנגדות, זיהום.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התראה: aeruginosa פ ו א faecalis פתוגנים אבטחה ברמה 2, נאות אמצעי זהירות יש לנקוט כדי למנוע זיהום מקרי וכדי לצמצם את זיהום של משטחים. כל המדיה והחומרים אשר באים במגע עם פתוגנים חייב להיות מעוקר ו/או שנמחקו. הנחיות נוספות זמינות מהפרסום CDC אבטחה Microbiological, ביו מעבדות (BMBL), המהדורה החמישית.

1. הכנה ותחזוקה של aeruginosa פ

  1. פס aeruginosa פ מ מניה קפוא על גבי צלחת אגר ליברות (Lysogeny מרק). דגירה 16 עד 24 h ב 37 ° C
    הערה: לבצע ניסויים aeruginosa פ בתוך ביטחון ביולוגי BSL-2 בארון כדי להבטיח עקרות. השתמש זהירות מתאימים כדי למזער את הסיכוי פתוגניים דלקת או זיהום.
  2. להעביר את הצלחת הזו 4 ° C. הצלחת הזו עשוי להיות נשמר ב 4 ° C, נהגה לחסן תרבויות עד לשבוע. אחרי שבוע אחד, decontaminate, למחוק את הצלחת ולעשות צלחת חדשה של פס ליברות.
    הערה: התקפה אלימה aeruginosa פ יורד לאחר אחסון ממושך.
  3. יומיים לפני הגדרת לוחות assay, לחסן 3-5 מ ל מרק LB סטרילי עם מושבה בודדת של aeruginosa פ מהצלחת ב 1.1. דגירה ב 37 ° C עבור h 12 עד 16.
    הערה: לא תדגור יותר 16 h בתרבויות נוזלי עשיר, PA14 aeruginosa פ מתחיל lyse.
  4. הכינו צלחות סטרילי 10 ס מ עם מדיה להרוג איטי (דור 3 NaCl, 3.5 g peptone, CaCl 1 מ2, 1 מ MgSO4, 25 מ של מאגר פוספט (כמות לליטר: 132 מ של K2HPO4 (1 מ') ו- mL 868 ח'2PO4 (1 מ')) ו- 18 גרם אגר/L).
    הערה: מכינים צלחות מבעוד מועד. והם יכולים להיות מאוחסנים עד 3 שבועות בכלי אטום לאוויר ב 4 º C.
  5. זרע כל 10 ס מ להרוג איטי צלחת (צלחת SK) עם 350 μL של aeruginosa פ מתרבות LB לילה טריים. באמצעות מפזר חיידקי, סטרילי להפיץ חיידקים באופן שווה על פני השטח של מדיה, אפשר להתייבש תוך ביטחון ביולוגי BSL-2 הקבינט.
  6. דגירה צלחות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ביממה.

2. הכנת RNAi חיידקים

  1. פס החוצה או pin-העברת זנים הרצוי של RNAi המכילים חיידקים על גבי צלחות אגר LB אנטיביוטיקה מתאימה (carbenicillin-µg 100/mL) ו טטרציקלין-µg/mL 15 עבור ספריות Ahringer, וידאל של מניה קפוא.
    הערה: בעת עבודה עם חיידקים nonpathogenic, השתמש BSL-2 א / B בטיחות ביולוגית ארון או זרימה שכבתית BSL-1 הוד כדי להבטיח עקרות של התרבויות וכדי למזער את הסיכוי של זיהום צולב של הספרייה.
  2. דגירה לוחות עבור 24 שעות ב 37 º C.
  3. חנות את הלוחיות ב 4 ° C עד שבועיים.
    1. אחרי שבועיים, למחוק את הצלחות והחלף אותם לוחות טריים.
  4. מבחן זני RNAi מרובות במקביל על ידי בנפרד מזריקים מושבה בודדת של כל המשובטים 4 מ ל בתוספת carbenicillin ליברות יחיד טוב של צלחת עמוקה 24-טוב-טוב או לתוך מבחנה סטרילית.
    הערה: טטרציקלין דווח כדי להפחית את היעילות של RNAi. אין להשתמש זה במדיה זו.
  5. למקם את לוחות 24-ובכן עמוק טוב חממה חזק ממוטב עבור לוחות multiwell, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 16 שעות תוך כדי טלטול-950 סל ד.
    הערה: קשה להשיג מדים התפתחות חיידקים בתוך צלחות multiwell באמצעות חממה חזק המקובלת. החממה חזק צריך להיות מסוגל לרעוד לכל הפחות 750 סל ד על מנת התרבויות הנצפות. בהיעדר מטרף מיוחדים, זה אפשרי לגדל כל תרבות בצינור בודדים. תרבויות ניתן להעביר על המשקולת 24-טוב עבור צנטריפוגה לאחר מכן, אם רצונך בכך.
  6. לאסוף חיידקים על ידי צריך שתוציאו למשך 5 דקות ב 2,000 x g.
  7. Decant תגובת שיקוע על-ידי היפוך לצלחת, ומנענע נמרצות. Resuspend RNAi חיידקים µL 100 של S הבזליים (5.85 g NaCl, 1 g K2HPO4, 6 g ח'2PO4 התפרקה לתוך 1 ליטר של מים הנדסה גנטית, מחוטא ע י אוטוקלב).
  8. פיפטה חיידקים resuspended לתוך מספר מתאים של בארות של צלחת NGM multiwell (תולעים נימיות צמיחה מדיה, דור 3 NaCl, peptone 2.5 g, CaCl 1 מ2, 1 מ MgSO4, 25 מ של מאגר פוספט (כמות לליטר: 132 מ של K2HPO4 (1 מ') ו- mL 868 ח'2PO4 (1 מ')), ו- 18 גרם אגר לליטר מים) בתוספת IPTG (ריכוז סופי של 1 מ מ), carbenicillin (100 ריכוז סופי μg/mL).
    1. השתמש 3.5 מיליליטר NGM מדיה לכל טוב של צלחת 6-ובכן, 1 מ"ל לכל טוב של צלחת 24-ובכן או µL 150 לכל טוב של 96-ובכן צלחת.
    2. השתמש μL 100/טוב של חיידקים על צלחת 6-טוב; ΜL 50/טוב של 24-טוב; או 20 μL טוב לצלחת 96-ובכן. אפשר להתייבש.
      הערה: ייבוש מתבצע בדרך כלל בשכונה זרימה סטרילי כדי לקדם את ייבוש מהיר, אחיד. ייבוש אחיד חשוב מאוד. הימנע ייבוש יתר על המידה, כמו סדקים אגר לקדם ומחילות של תולעים. זה מוביל תולעת הפסדים ואת סתימת פוטנציאלי של מערכות טיפול נוזלי.
  9. השתמש הלוחות מוכן מיד או לאחסן אותם ב 4 ° C עד שבועיים לשימוש מאוחר יותר.
    הערה: כדי למנוע ייבוש צלחות, ניתן אטום עם סרט פרפין פלסטיק או להציב במיכל אטום באופן הדוק עם מגבות נייר לח.

3. תחזוקה והכנה של C. elegans

הערה: לפני ביצוע ניסויים, ליצור אוכלוסיה מסונכרן של תולעים אנדרוגיניות gravid, למבוגרים כדלקמן.

  1. תשטוף gravid מבוגרים (קרי, עם גלוי בתוך בלוטת המין מספר העוברים) מ- 4-6 ס מ-10 NGM צלחות לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל על-ידי הוספת 4 מיליליטר הבזליים S צלחת מתערבל בעדינות, ואז לשפוך לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל.
  2. גלולה תולעים באמצעות צנטריפוגה ב 1,000 x g למשך 30 שניות.
  3. תגובת שיקוע וביופסיה, מטפל לא להפריע בגדר תולעת.
  4. להוסיף 3.5 מ של תולעת אקונומיקה פתרון (ריכוז סופי 0.5M NaOH, 1% נתרן תת-כלורי, במים סטריליים) צניפה תולעת ומיקס על ידי היפוך במשך דקה אחת.
  5. בקצרה מערבולת, צנטריפוגה ב 1,000 x g למשך 30 שניות.
  6. האחות או decant את תגובת שיקוע, דואגת שלא להפריע בגדר תולעת.
  7. מוסיפים 3.5 מ של תולעת טריים אקונומיקה פתרון בגדר תולעת.
  8. לערבב נמרצות תולעים בפתרון אקונומיקה. מעת לעת (בערך כל 10 שניות) בדוק חזותית תולעים מתחת למיקרוסקופ ויבתר. Watch עבור תולעת ציפורנייך לשבור, לשחרר ביציות. ברגע רוב תולעים בוגרות כבר מומס (~ 95%), למהול אקונומיקה כדי 15 מ"ל עם S הבסיס כדי לעצור את תהליך העיכול.
    הערה: קליפות ביצה הם עמידים יותר בפני אקונומיקה מאשר רקמות בוגרות, אבל הם יכולים להיות מומס במהלך חשיפה ממושכת. כדי למנוע התפרקות ביצה, אינם חושפים ביצים לתעל אקונומיקה פתרון יותר מ 7 דקות. אם קליפות ביצה פגומים בצורה מוגזמת, העוברים ימותו
  9. גלולה עוברי ב 1,000 x g למשך 30 שניות, מחוק לגמרי או decant את תגובת שיקוע מבלי להסיר בגדר של העוברים.
  10. Resuspend תולעים ב S הבזליים לאמצעי הסופי של 15 מ"ל לדלל פתרון אקונומיקה הנותרים.
  11. חזור על השלבים כביסה (3.9-3.10) שלוש פעמים נוספות עבור סכום כולל של 4 שוטף רצופים.
  12. לאחר לשטוף את הרביעי, תשאף תגובת שיקוע, מסתכמים 5 או 6 מ של הבסיס S סטרילי לתוך הצינור חרוט 15 מ"ל. המטרה היא resuspend העוברים על ריכוז של ~ 50 תולעים לכל µL.
    הערה: כמות הבזליים S תלויה בגודל של בגדר ביצה; גדול יותר בגדר, הבסיס S יותר יש צורך.
  13. דגירה הצינור חרוט בן לילה על מסובב שולחני בטמפרטורת החדר או 48 שעות ב 15 º C. הזחלים יבקעו, אך התפתחות הזחל אעצור בשלב L1 (L1 תרדמה ואסטרטגיה) עקב חוסר התזונתי.
  14. לבחון את העוברים תחת מיקרוסקופ ויבתר כדי לוודא כי רובם יש בקע, נעצרה בשלב L1 של פיתוח.
  15. לקבוע את ספירת תולעת על-ידי לקיחת µL 20 של תולעת הכנה לדלל אותה עם 80 µL של S הבזליים. פיפטה 10 µL של תולעת מדולל פתרון ישירות על גבי צלחת NGM ריק. חזור על 2 פעמים נוספות.
    1. לספור את הזחלים בכל מקום, לקבוע את המספר הממוצע. לחלק זה הממוצע ב- 2 כדי להשיג של ספירה משוער של תולעים לכל µL ב ההכנות תולעת. תולעת preps יכול לשמש לאחר מכן עבור הפצת לוחות או לניסויים.
      הערה: לאחר 4-5 ימים, הזחלים מורעבים יתחיל למות; למחוק את המפתח בשלב זה.
  16. להפצת המתח, פיפטה מספר מתאים של תולעים L1 (5,000-6,000) על גבי 3-4 ס מ-10 NGM צלחות מרובבים מרוכז OP50 e. coli – "מילק" (e. coli OP50 הבחין ב 25 X ריכוז (קרי, 1 ליטר של OP50 לילה תרבות גדל LB התשואות 40 מ של 25 X OP50 מילק); 2 מיליליטר ההשעייה חיידקי מרוכזים הם הבחינו על כל צלחת NGM 10 ס מ).
  17. כדי להכין צלחות לניסויים, בצע אחת מן הפעולות הבאות (עבור התקנת שימוש 3.17.1 "פרוטוקול בסיסי", עבור "מסך RNAi להגדיר" שימוש הצעדים 3.17.2 - 3.17.4 לפי הצורך):
    1. פיפטה ~ 5,000 תולעים/10 ס מ צלחת נזרע עם RNAi או OP50 מילק.
    2. פיפטה ~ 500 תולעים/טוב. צלחת 6-ובכן נזרע עם RNAi.
    3. פיפטה ~ 300 תולעים/היטב לתוך צלחת 24-ובכן נזרע עם RNAi.
    4. פיפטה ~ 100 תולעים/טוב בצלחת 96-ובכן נזרע עם RNAi.
      הערה: לקבלת הוראות כיצד RNAi היה נזרע עיין בשלבים הכנה של RNAi חיידקים 2.7-2.9.
  18. אם נעשה שימוש זן פורה של תולעים, דגירה תולעים 25 ° c עבור ~ 44-48 ה שימוש תולעים אלה מהר ככל האפשר לאחר האוכלוסייה הגיע. לגיל המתאים. פעולה זו ממזערת את ההשפעה של הביצה בוקע מהביצה בתוך התולעים במהלך וזמינותו.
  19. אם המתח בשימוש טמפרטורה סטרילי (למשל, fer-15(b26); fem-1(hc17) או glp-4(bn2)), דגירה תולעים-15 ° C עבור h ~ 16 ולאחר מכן להעביר עד 25 ° C עבור h 44 כדי להשלים את פיתוח ולמנוע מופרה.

4. נוזל הורג Assay ההתקנה (פרוטוקול בסיסי)

הערה: הוא זה פרוטוקול עבור זן חיידקי אחד ומקור אחד של תולעים.

  1. באמצעות המגרד של התא, להסיר את aeruginosa פ צלחת SK ו resuspend ב ~ 5 מ של S הבזליים. קנה המידה של במידת הצורך. למדוד את הצפיפות האופטית של המתלה חיידקי באמצעות ספקטרופוטומטרים (OD600)
  2. להכין 24 מ של מלאי מדוללת של aeruginosa פ ב- S הבזליים-OD600 ≈ 0.09 (3 X ריכוז סופי). פנה 4.6.2 עבור התוכן הסופי לכל טוב, קנה המידה של נפח של דילול חיידקי בהתאם.
  3. הוסף mL 21 של מדיה להרוג איטי נוזלי (3g של NaCl, 3.5 g של peptone/L בתוספת CaCl2 ו- MgSO4 כדי ריכוז סופי של 1 מ מ). באמצעות פיפטה רב-ערוצי, להעביר µL 45 של חיידקים ומדיה כל טוב של צלחת 384-. טוב.
  4. לשטוף תולעים ממקור שלהם (כלומר, שלב 3.17.1) לתוך צינור חרוטי 50 מ ל ולאפשר תולעים להתיישב תחת כוח כבידה. האחות תגובת שיקוע 5 מ. Resuspend סך של 50 מ ל S הבזליים.
  5. חזור על שלב 4.4 פעמיים.
  6. שימוש של סדרן תולעת, למיין כ 22 תולעים לבאר כל צלחת 384-. טוב.
    הערה: ההגדרה של טיפות כל תולעת ~1.1 µL של נוזל. תולעים 22 תסתכם µL 25, להביא assay סה כ נפח µL 70/טוב.
    1. ההרכב הסופי של כל טוב מורכב 70 µL. 45 µL של אמצעי אחסון זה מתווסף כמו חיידקי בינוני (חיידק600 OD 0.03 נקודות 24 µL S µL הבסיס, ו- 21 SK בתוספת CaCl2 ו- MgSO4). µL 25 אחרים נוסף עם התולעים 22.
    2. אם נעשה שימוש בסדרן כאן (ראה טבלה של חומרים) אינו זמין, תולעים יכולים לדלל את ריכוז סופי של תולעת/µL 1 ב S הבזליים ו- pipetted 25 µL/היטב באמצעות פיפטה רב-ערוצי. עם זאת, התוצאות ייתכן שיישומים השתנות מוגברת. לחלופין, זה אפשרי לשימוש מתקן סינון נוזלי, כפי שתואר על ידי ליונג ועמיתיו19.
  7. אחרי תולעים מוינו על המשקולת 384-ובכן, לאטום את הצלחת עם סרט גז-חדיר, דגירה צלחות ב 25 מעלות צלזיוס במשך 24-48 שעות.
  8. בזמן הרצוי, השתמש מנקה microplate לשטוף את הצלחת 384-ובכן עם S הבזליים סך של 5 פעמים.
    1. לאחר השטיפה השנייה האחות רוב התקשורת, עוזב µL ~ 20. נמרצות לנער צלחות באמצעות vortexer microplate לפחות 30 שניות כדי לשחרר נפולת מהחלק התחתון של הבארות).
  9. לאחר כביסה הסופי, תגובת שיקוע וביופסיה עד 20 להוסיף 50 µL µL. של חומצת גרעין מיקרומטר 0.98 כתם (ראה טבלה של חומרים) / טוב של צלחת 384-ובכן, עבור ריכוז סופי של 0.7 מיקרומטר.
  10. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 12-16 שעות. צבע זה יהיה רק כתם תולעים מתים. לאחר תקופת הדגירה הרצוי, שטיפת צלחות באמצעות microplate למכונת הכביסה כדי להסיר כל עודף כתם (מינימום של 3 מנקי).
  11. עבור ייבוא נתונים, להשתמש ספקטרופוטומטרים או במיקרוסקופ אוטומטי לשיקוף האור המשודר והן קרינה פלואורסצנטית (531 עירור nm ו פליטה 593).
    1. השתמש מטרה הגדלה נמוכה כדי לאפשר תמונה של הבאר כל ללכידה.
    2. לחלופין, השתמש זרימה vermimetry. טכניקה זו משתמש cytometer זרימה של אובייקטים גדולים כמו fluorimeter תולעת, מודדים את גודל ואת זריחה של כל אורגניזם (קרי, C. elegans) בצורה דומה מאוד לזו cytometry זרימה.
  12. השתמש בתוכנת ניתוח התמונה האוטומטי (כגון CellProfiler, סטודיו ניתוח תמונה חופשית בהתבסס על MatLab http://cellprofiler.org/) כדי לחשב את האזורים תולעת פלורסנט, הכולל לכל טוב בצורה לא משוחדת.
    הערה: המנה של מספרים אלה מייצג מוות שבר על כל טוב. אם אחד היה 7 מוכתם תולעים 20 הכולל, ולאחר מכן מותו שבר מורכב 0.35 או 35%.
    1. לפני השימוש הראשון, צינור עיבוד תמונה אוטומטית יש לאמת כשקלע ידנית. פעולה זו מתבצעת על-ידי השוואת התוצאות מקו הצינורות אוטומטיות ציוניהם מאת חזותית בוחנת תמונות והקלטת שברים של תולעים מתים לכל אחד מהם. תהליך האימות מבטיחה הפרמטרים עבור עיבוד ממוכן דימות מדויקות שייצגו את הנתונים בצורה נכונה.

5. הסתגלות ההקרנה מרובות C. elegans זנים או נפילות (RNAi מסך התקנה)

הערה: זהו ומציג מסך RNAi המתוארות עבור התקנה צלחת 24-. טוב.

  1. להוסיף 1 מ"ל של S הבסיס לכל טוב של צלחת 24-טוב (ראה שלב 3.17.3). בעדינות להתסיס תולעים ע י ניעור לצלחת, ולאחר מכן להעביר תולעים ריקה, סטרילי 24 באר צלחת. לאפשר תולעים להתיישב gravitationally (~ 5 דקות).
  2. תגובת שיקוע וביופסיה, עוזב כ 1 מ"ל. להוסיף 7 מ ל S הבסיס מכל קידוח.
  3. חזור על שלבים 5.1-5.2 מינימום של 2 פעמים נוספות. לאחר השטיפה הסופית תשאף תגובת שיקוע, עוזב כ 400 µL.
  4. באמצעות הפונקציה Resampler בסדרן תולעת, למיין תולעים 22 מתוך צלחת 24-ובכן תולעת ההשעיה לתוך כל טוב של צלחת 384-טוב (כל טוב של בארות התשואות 8-12 24-ובכן צלחת צלחת 384-ובכן).
    1. כדי להימנע מרעב, פיפטה חיידקים לתוך צלחות 384-טוב (זן אשר משמש אך ורק מזון, כגון OP50, או זן פתוגניים) לפני מיון.
      הערה: ניתן להוסיף פתוגנים לפי השלבים הבאים 2.3-2.5 או 6.4-6.5, ומקור מזון חיידקים יכולים להיות מדולל והוסיף לפי ערכת אותו באשר aeruginosa פ.
  5. לאחר תולעים מוינו על המשקולת 384-ובכן, להוסיף מולקולות קטנות או חומרים אחרים ספציפיים הניסוי.

6. הסתגלות עבור אי faecalis

הערה: רק ההבדלים מ פ aeruginosa assay מתוארים.

  1. להכין מקור טריים של אי faecalis על ידי ומבטא חיידקים של מניה קפוא על צלחת אגר BHI (המוח הלב אינפוזיה) המקננת עבור 16 עד 24 h ב- 37 מעלות צלזיוס.
    הערה: לבצע ניסויים faecalis אי בתוך ביטחון ביולוגי BSL-2 בארון כדי להבטיח עקרות. השתמש זהירות מתאימים כדי למזער את הסיכוי פתוגניים דלקת או זיהום.
  2. ניתן לאחסן צלחות ב 4 ° C עד לשבוע אחד. לאחר תקופה זו, החלף את צלחת טריים.
  3. לילה לפני מיון תולעים, לחסן 3-5 מ ל BHI סטרילי עם מושבה בודדת של א faecalis. דגירה 12-16 h ב 37 ° C עם עצבנות.
  4. להוסיף חיידקים הבארות באשר aeruginosa פ (3 x חיידקים בתוך הבסיס S, OD600≈0.09).
    הערה: עבור אי faecalis, ובכן הקומפוזיציה הסופית היא: אי faecalis (OD600≈0.03), BHI = 10% v/v, עם נפח הנותרים מורכבת S הבזליים. זוכר µL 25 של S הבזליים תימסר עם תולעים.
    הערה: אי faecalis מייצרת biofilms עבה לספוג על הכתם פלורסנט, גורם תמונות מטושטשות. כביסה נרחב עשוי להיות מספיק להסיר biofilm הזה. במקרה זה, ניתן להעביר תולעים בעזרת פיפטה רב-ערוצי עם צלחת ריקה. כדי להקל על העברת, Tween 20 יכול להתווסף הבזליים S כדי ריכוז סופי של 0.1% (v/v) Tween 20 ב S הבזליים. זו מסייעת בעת הסרת biofilm התולעים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרמטרים חשובים לביצועים assay

הבנה נכונה של הביולוגיה שבבסיס assay הזה הוא הכרחי עבור פתרון בעיות ומיטוב וזמינותו. לשם כך, אנו מתייחסים קודם בכמה עיתונים מרכזיים שחקרתי על מנגנוני פתוגנזה של פ aeruginosa-מתווכת הורג נוזלי7,20. ובלבד השלבים המתוארים לעיל עוקבים (ראו איור 1 סכימטי של פרוטוקול assay) רצח תלויי-זמן של C. el...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זה assay (או מבחני דומה שבו פתוגנים אחרים המוחלפים aeruginosa פ או faecalis א) שימושי למגוון רחב של מטרות, לרבות גילוי תרופות. זה שימושי גם למיעון שאלות הביולוגיים הבסיסיים, כגון בזיהוי הגורמים התקפה אלימה, הבהרה של המארח ההגנה מסלולים, וקביעת את הרגולציה והמיכון באינטראקציה פתוגן-פונדקאי.

למרות וזמינותו aeruginosa פ הרג נוזלי עמיד, ישנן מספר נקודות איפה צריך להיות משולם תשומת לב כדי למזער את הסיכוי לכשל. ראשית, כאמור, הצלחת מקור חיידקי על ההזרקות aeruginosa פ

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי יש להם שאין ניגודי אינטרסים לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה נתמך על ידי מכון המחקר של טקסס (CPRIT) פרס RR150044, ולש קרן מחקר גרנט C-1930, ומניעת סרטן על ידי את נבחרת מוסדות של בריאות K22 AI110552 מוענק NVK. התורמים שחיים היה אין תפקיד תכנון המחקר, איסוף נתונים, ניתוח, ההחלטה לפרסם או אופן ההכנה של כתב היד.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
COPAS FP BioSorterUnion Biometricaאובייקט גדול זרימת ציטומטר / סדרן תולעים
Cytation 5BioTek
EL406 מכונת כביסה מתקןBioTek
Multitron ProInfors HT
24 עמוק באר RB בלוקתרמו פישר מדעיCS15124
384 בארות צלחתגריינר Bio-OneMPG-781091
מצע גידול נמטודות (NGM)כמות לליטר: 18 גרם אגר, 3 גרם NaCl, 2.5 גרם פפטון, 1 מ"ל CaCl2 (1 מ'), 1 מ"ל MgSO<תת>4 (1 מ'), 25 מ"ל מאגר פוספט ו-973 מ"ל של
צלחותהרג איטי (SK) של מים מילי-Qכמות לליטר: 18 גרם אגר, 3 גרם NaCl, 3.5 גרם פפטון, 1 מ"ל CaCl2 (1 M), 1 מ"ל MgSO4 (1 M), 25 מ"ל מאגר פוספט ו-973 מ"ל של
הרג איטי (SK)כמות לליטר:  3 גרם NaCl, 3.5 גרם פפטון, 1 מ"ל CaCl2 (1 M), 1 מ"ל MgSO4 (1 M), 25 מ"ל מאגר פוספט ו-973 מ"ל של מי milli-Q
מרק ליזוגני (LB)USBiological Life SciencesL1520
Brian Heart Infusion Broth (BHI)Research Products International Corp50-488-526
תמיסתאקונומיקה תולעיםכמות ל-100 מ"ל: 10 מ"ל של תמיסת 5 M NaOH, 20 מ"ל של תמיסת נתרן היפוכלוריט 5% ו-70 מ"ל של מים סטריליים
בסיסיתלליטר: 5.85 גרם NaCl, 6 גרם KH2PO4, 1 גרם K2HPO4, ו-1 ליטר מים מילי-Q
אגרUSBמדעי החיים האיולוגייםA0930
NaCl USBמדעי החיים האיולוגייםS5000
פפטוןUSBמדעי החיים האיולוגייםP3300
CaCl2USBמדעי החיים האיולוגיים
MgSO4Fisher ScientificM63-500
מאגרלליטר: 132 מ"ל של K2HPO4 (1M) ו-868 מ"ל של KH2PO4 (1M)
KH2PO4Acros Organics7778-77-0
K2HPO4USBiological Life SciencesP5100
5% תמיסת נתרן היפוכלוריטBICCA7495.5-32
תמיסת NaOHFisher ScientificSS255-1
Breathe-easyמגוון ביוטקBEM-1
SYTOX כתם חומצת גרעין כתוםפישר סיינטיפיקS11368
<זני חיידקים חזקים>
P. aeruginosa (PA14)<
em>E. faecalis(OG1RF)
E. coli superfood (OP50)
E. coli RNAi (HT115)
זני תולעים <
em>glp-4(bn2) (Beanan and Strome, 1992, PMID: 1289064)
PINK-1::GFP reporter (Kang et al., 2018, PMID: 29532717)
חומר של מים milli-Q כמותכמות פוספט

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Falagas, M. E., et al. Pandrug-resistant Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii infections: Characteristics and outcome in a series of 28 patients. International Journal of Antimicrobial Agents. 32 (5), 450-454 (2008).
  2. Hsueh, P. R., et al. Pandrug-resistant Acinetobacter baumannii causing nosocomial infections in a university hospital, Taiwan. Emerging Infectious Diseases. 8 (8), 827-832 (2002).
  3. Wang, C. Y., et al. Pandrug-resistant Pseudomonas aeruginosa among hospitalised patients: clinical features, risk-factors and outcomes. Clinical Microbiology and Infection. 12 (1), 63-68 (2006).
  4. Yao, Y., et al. Draft genome sequences of pandrug-resistant Serratia marcescens clinical isolates harboring blaNDM-1. Genome Announcements. 5 (3), (2017).
  5. Utari, P. D., Quax, W. J. Caenorhabditis elegans reveals novel Pseudomonas aeruginosa virulence mechanism. Trends in Microbiology. 21 (7), 315-316 (2013).
  6. Conery, A. L., Larkins-Ford, J., Ausubel, F. M., Kirienko, N. V. High-throughput screening for novel anti-infectives using a C. elegans pathogenesis model. Current Protocols in Chemical Biology. 6 (1), 25-37 (2014).
  7. Kirienko, N. V., et al. Pseudomonas aeruginosa disrupts Caenorhabditis elegans iron homeostasis, causing a hypoxic response and death. Cell Host & Microbe. 13 (4), 406-416 (2013).
  8. Kirienko, D. R., Revtovich, A. V., Kirienko, N. V. A high-content, phenotypic screen identifies fluorouridine as an inhibitor of pyoverdine biosynthesis and pseudomonas aeruginosa virulence. mSphere. 1 (4), (2016).
  9. Manning, A. J., et al. A high content microscopy assay to determine drug activity against intracellular Mycobacterium tuberculosis. Methods. 127, 3-11 (2017).
  10. Marwaha, S., et al. N-acylated derivatives of sulfamethoxazole and sulfafurazole inhibit intracellular growth of Chlamydia trachomatis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (5), 2968-2971 (2014).
  11. Kota, K. P., et al. Integrating high-content imaging and chemical genetics to probe host cellular pathways critical for Yersinia pestis infection. PLoS One. 8 (1), e55167(2013).
  12. Arif, M., et al. Quantification of cell infection caused by Listeria monocytogenes invasion. Journal of Biotechnology. 154 (1), 76-83 (2011).
  13. Jayamani, E., et al. Characterization of a Francisella tularensis-Caenorhabditis elegans pathosystem for the evaluation of therapeutic compounds. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61 (9), (2017).
  14. Moy, T. I., et al. High-throughput screen for novel antimicrobials using a whole animal infection model. ACS Chemical Biology. 4 (7), 527-533 (2009).
  15. Rajamuthiah, R., et al. Whole animal automated platform for drug discovery against multi-drug resistant Staphylococcus aureus. PLoS One. 9 (2), e89189(2014).
  16. Breger, J., et al. Antifungal chemical compounds identified using a C. elegans pathogenicity assay. PLoS Pathogens. 3 (2), e18(2007).
  17. Garvis, S., et al. Caenorhabditis elegans semi-automated liquid screen reveals a specialized role for the chemotaxis gene cheB2 in Pseudomonas aeruginosa virulence. PLoS Pathogens. 5 (8), e1000540(2009).
  18. Zhou, Y. M., et al. An efficient and novel screening model for assessing the bioactivity of extracts against multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa using Caenorhabditis elegans. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 75 (9), 1746-1751 (2011).
  19. Leung, C. K., Deonarine, A., Strange, K., Choe, K. P. High-throughput screening and biosensing with fluorescent C. elegans strains. Journal of Visual Experiments. (51), (2011).
  20. Kirienko, N. V., Ausubel, F. M., Ruvkun, G. Mitophagy confers resistance to siderophore-mediated killing by Pseudomonas aeruginosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (6), 1821-1826 (2015).
  21. Kirienko, N. V., Cezairliyan, B. O., Ausubel, F. M., Powell, J. R. Pseudomonas aeruginosa PA14 pathogenesis in Caenorhabditis elegans. Methods in Molecular Biology. 1149, 653-669 (2014).
  22. Kang, D., Kirienko, D. R., Webster, P., Fisher, A. L., Kirienko, N. V. Pyoverdine, a siderophore from Pseudomonas aeruginosa, translocates into C. elegans, removes iron, and activates a distinct host response. Virulence. , 1-41 (2018).
  23. Garsin, D. A., et al. Long-lived C. elegans daf-2 mutants are resistant to bacterial pathogens. Science. 300 (5627), 1921(2003).
  24. Estes, K. A., Dunbar, T. L., Powell, J. R., Ausubel, F. M., Troemel, E. R. bZIP transcription factor zip-2 mediates an early response to Pseudomonas aeruginosa infection in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (5), 2153-2158 (2010).
  25. Tjahjono, E., Kirienko, N. V. A conserved mitochondrial surveillance pathway is required for defense against Pseudomonas aeruginosa. PLoS Genetics. 13 (6), e1006876(2017).
  26. Moy, T. I., et al. Identification of novel antimicrobials using a live-animal infection model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (27), 10414-10419 (2006).
  27. Henderson, S. T., Bonafe, M., Johnson, T. E. daf-16 protects the nematode Caenorhabditis elegans during food deprivation. The Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences and Medical Sciences. 61 (5), 444-460 (2006).
  28. Beanan, M. J., Strome, S. Characterization of a germ-line proliferation mutation in C. elegans. Development. 116 (3), 755-766 (1992).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

C Elegans PathosystemLiquid Killing AssayHigh throughput ScreeningRNAi Genetic ScreenPseudomonas AeruginosaEnterococcus FaecalisWorm SortingSpectrophotometer AnalysisMulti well PlateBiosafety Cabinet

Related Articles