כאן, אנו מתארים את פרוטוקול עבור האפיון הביוכימי של שמרים שינוי RNA האנזים, Mod5, ונדון כיצד פרוטוקול זה יכול לחול על אנזימים אחרים שינוי RNA.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
Assay ב Vitro לגילוי פעילות טרנספראז tRNA-Isopentenyl
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
N6- isopentenyladenosine RNA שינויים הינם מגוונים באופן פונקציונלי מאוד שנשמרת בין אאוקריוטים פרוקריוטים. אחד השינויים שנשמרת ביותר של - isopentenyladenosine6N מתרחשת במיקום A37 בקבוצת משנה של tRNAs. שינוי זה משפר את יעילות התרגום ונאמנות על ידי הגדלת את הקרבה של tRNA הריבוזום. מוטציה של אנזימים האחראים את השינוי בפרוקריוטים משויכות מספר מצבי מחלה, כולל תפקוד מיטוכונדריאלי וסרטן. לכן, הבנת את המצע ירידה לפרטים ופעילויות הביוכימי של אנזימים אלה חשוב להבנה של ביולוגיה האיקריוטים נורמלי, פיפטות. כבר מועסקים מערך מגוון של שיטות לאפיון אני6א שינויים. בזאת הוא תיאר גישה ישירה של איתור isopentenylation על ידי Mod5. שיטה זו משתמשת דגירה של RNAs עם טרנספראז isopentenyl רקומביננטי, ואחריו RNase T1 עיכול, וניתוח חד-מימדי ג'ל אלקטרופורזה לזהות אני6א שינויים. בנוסף, נדון על הסתגלות פוטנציאלי של הפרוטוקול לאפיין אנזימים אחרים שינוי RNA.
מבוא
163. לפחות שינויים ברורים posttranscriptional RNA זוהו, עם שינויים אלה היוועצות פונקציות מגוונות and תלויי-ההקשר RNAs ישירות המשפיעים על מבנה רנ א, המשפיעים על האינטראקציות של RNA עם השני מולקולות1,2. הערכה ממגוון גדול של RNA שינויים גודלת, חיוני לפתח מבחני זה שניתן לחקור בצורה אמינה את השינויים RNA והן האנזימים לעודד אותם.
אחד השינויים RNA הראשון להיות מזוהה מתרחשת 37 בסיס ב- tRNAs, סמוך codon אנטי-3' צד3,4. קבוצת isopentenyl של dimethylallylpyrophosphate (DMAPP) מועבר המיקום N6 של אדנוזין 37 (אני6A37)
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הערה: הפרוטוקול הותאם מ הפניה למעורר 24.
1. לקבל RNA ואנזים עניין
- השתמש במבחנה עיבד RNAs פנימי עם התווית עם 32P, His6 רקומביננטי-Mod5 לידי ביטוי וטיהרו מ- e. coli, כפי שתואר לעיל24.
- להציג במבחנה עיבד RNAs (סעיף 3) באמצעות T7 RNA פולימראז בנוכחות ATP ללא תווית, זוג שזור, CTP, GTP ו- µCi 10 של ג'ל טהור, זירז אתנול α-ATP, resuspended ב 1 x TE (10 מ מ טריס-HCl pH 7.5, 0.1 מ מ EDTA), והם מאוחסנים ב-80 מעלות צלזיוס 24.
- לחלופין, להשיג זמינים מסחרית fluorescently שכותרתו RNAs עניין. לייצר את enzyme(s....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
Mod5, נדגרה עם טירוזין tRNA או סרין tRNA, נוכחות או היעדרות של DMAPP. בעקבות התגובה השינוי, מוצרים היית RNase T1-מעוכלים, אשר cleaves 3' סוף כל guanosines עוזב בגודל 3' guanosine monophosphates (GMP)24 (איור 1). עיכול מלא של RNAs מפיק דפוס צפוי של שברי radiolabeled (איור 2א), ואז אתה נחוש לזיהוי 20% denaturing ג'ל. ההעברה של קבוצת isopentenyl מ- DMAPP ל הרנ א גורם משמרת ניידות של המקטע המכ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
שינויים RNA להמשיך להציג את ממלאים תפקידים מגוונים וחשובים יותר בתפקוד הסלולר, organismal. ככזה, הפיתוח של מבחני לחקור RNA שינוי אנזימים הוא מרכזי כדי להבין טוב יותר את ההיבטים הבסיסיים של הביולוגיה. פרוטוקול זה מתאר assay ברזולוציה גבוהה במבחנה כדי לאפיין את פעילות שינוי tRNA Mod5.
פרוטוקול זה יש יתרון מובהק של מתן readout isopentenylation ישירה, interpretable בקלות. הפרוטוקול המתואר מאפשר חזקים איפיון ביוכימי של isopentenyl transferases. יתר על כן, מערכת זו יכולה לשמש עם גרסאות או ש.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תודות
ברצוננו להודות ד ר דוד Engelke שלו הדרכה והערות מועילות על כתב היד הזה. פיג'מה - אוניברסיטת המדינה של הכדור מעבדה הפעלה כספים; כי אמחה קלות - להעניק 1R15AI130950-01.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| <חזק>ריאגנטים | |||
| תרכיז אוריאה-ג'ל | Diagnostics | EC-833 | כחלק מערכה |
| UreaGel | Diluent National Diagnostics | EC-833 | כחלק מערכה |
| UreaGel Buffer | National Diagnostics | EC-833 | כחלק מערכה |
| 10x TBE | National Diagnostics | EC-833 | כחלק מערכה |
| אמוניום פרסולפט (APS) | סיגמא-אולדריץ' | 7727-54-0 | |
| N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine (TMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| חומצה בורית | Sigma-Aldrich | 10043-35-3 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 60-00-4 | |
| ATP | סיגמא-אולדריץ' | 34369-07-8 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 7786-30-3 | |
| DMAPP | Caymen Chemical | 1186-30-7 | |
| Super RNaseIN | ThermoFisher Scientific | AM2694 | |
| 2-מרקפטואתנול | סיגמא-אולדריץ' | 60-24-2 | |
| אתנול | סיגמא-אולדריץ' | 64-17-5 | |
| נתרן אצטט | Sigma-Aldrich | 127-09-3 | |
| Rnase T1 | ThermoFisher Scientific | EN0541 | |
| גליצרול | סיגמא-אולדריץ' | 56-81-5 | |
| קסילן ציאנול | סיגמא-אולדריץ' | 2650-17-1 | |
| <חזק>ציוד ואספקה | |||
| צלחות זכוכית קצרות (20-40 ס"מ רוחב x 40 ס"מ L) | הג'ל | ||
| לוחות זכוכית ארוכים (20-40 ס"מ רוחב x 40 ס"מ L) | הג'ל | ||
| מנגנון ג'ל אנכי | The Gel Company | S2-3040 | |
| 50 מ"ל מזרק חד פעמי | פישר סיינטיפיק | 03-377-26 | |
| קליפס קלסר נירוסטה | Idea Scientific | 1066 | |
| Phosphoscreen | סיגמא-אולדריץ' | 28-9564-74 | |
| ניילון נצמד | (מכולת מקומית) |
מקורות
- Boccaletto, P., et al. MODOMICS: a database of RNA modification pathways. 2017 update. Nucleic Acids Research. 46 (D1), 303-307 (2018).
- Lewis, C. J., Pan, T., Kalsotra, A. RNA modifications and structures cooperate to guid....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
