כאן, אנו מציגים את פרוטוקול מצפני ויוו תמים CD4 T התא (תא T) הפעלה, התפשטות, בידול Th1 המושרה על ידי מח העצם GM-CSF (מוניטור)-נגזר תאים דנדריטים (Dc). בנוסף, פרוטוקול זה מתאר בידוד מוניטור ו- T-cell דור DC, DC ו- T-cell העברה המאמצת.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
מודל העכבר In Vivo הפעלת תא T CD4 תמים מידה, התפשטות של בידול Th1 הנגרם על ידי תאים דנדריטים הנגזרות מח עצם
במאמר זה
סיכום
תקציר
כימות של הפעלת תא CD4 T תמימה, התפשטות, בידול T helper 1 (Th1) התאים היא דרך שימושית כדי להעריך את התפקיד שממלאת בתאי T בתגובה חיסונית. פרוטוקול זה מתאר את הבידול במבחנה של מח העצם (מוניטור) אבות כדי להשיג גרנולוציט מקרופאג המושבה-מגרה פקטור (GM-CSF) נגזר-תאים דנדריטים (Dc). הפרוטוקול מתאר גם את ההעברה המאמצת של פפטיד אובלבומין (OVAp)-טעון DCs GM-CSF-derived ותאי CD4 T תמים מן העכברים הטרנסגניים OTII על מנת לנתח את הפעלת ויוו , התפשטות ו Th1 הבידול של תאי CD4 T שהועברו. פרוטוקול זה עוקף המגבלה של גרידא אין ויוו שיטות המוטלים על-ידי חוסר היכולת במיוחד לתמרן או בחר האוכלוסייה תא למד. יתר על כן, פרוטוקול זה מאפשר לימודים בסביבת ויוו , וכך להימנע שינויים לגורמים פונקציונלי שעלולות להתרחש במבחנה , לרבות את השפעת סוגי תאים וגורמים אחרים מצאו באיברים ללא פגע. הפרוטוקול הוא כלי שימושי עבור יצירת שינויים ב- DCs ו- T תאים זה לשנות את תגובות מערכת החיסון מסתגלת, פוטנציאל לספק תוצאות חשוב להבין את המקור או את התפתחות מחלות רבים הקשורים החיסון.
מבוא
תאי CD4 T אנטיגן הצגת תאים (נגמ שים) כגון DCs מגשרים נדרשת חסינות חיידקים פתוגנים1,2בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. באיברי הלימפה ההיקפית, תאי CD4 T מופעלים על הכרה של אנטיגנים ספציפיים שהוצגו על ידי נגמ שים3,4,5. תאי CD4 T מופעל להתרבות, להבדיל לתוך תאי Th ברורים אפקטור ספציפיים הדרושים להתפתחותם של תגובה חיסונית אדפטיבית נכונה6,7. שליטה על תהליכים אלה חיוני לייצור הגנה ראויה מסתגלת שהורג את הפתוגן מבלי לייצר רקמות מזיק נזק8. Th תאים מוג....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
נהלים ניסיוני אושרו על-ידי Fundación Centro נאסיונאל דה Investigaciones Cardiovasculares קרלוס השלישי (CNIC), את Autónoma קומונידד דה מדריד בהתאם להנחיות והאירופאים. עכברים התרבית פתוגן מסוים התנאים (SPF) חינם, היו מורדמים על ידי שאיפת פחמן דו-חמצני (CO2).
1. בידוד תאי מח עצם העכבר מ Tibias ועצמות ירך
הערה: המתח העכבר congenic C57BL/6 נושאת ליקוציט דיפרנציאלית הסמן Ptprc, כלל מוכרות כמו CD45.1 או Ly5.1, ואילו פראי-סוג C57BL זנים לשאת אלל Ptprcb , המכונה CD45.2 או Ly5.2. CD45.1 ו- CD45.2 משתנים ניתן לזיהוי על-ידי cytometry זרימה באמצעות נוגדנים. עכברים CD45.1, CD45....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
איור 1 מדגימה את השלבים המתוארים פרוטוקול זה. איור 2 מדגים את הבידוד והתרבות של העכבר מוניטור תאים. התוספת של GM-CSF ו LPS לתרבויות אלה מאפשר הדור במבחנה , ההבשלה של בקרי תחום. איור 3 מדגימה ניתוח cytometry זרימה של בידול ועם בגרות שהושג שנטענו DCs-OVAp GM-CSF BM-derived בקרי התחום התא חיוני מבודד מעקב שהוכתמו לצבוע בתאי T CD4/OTII הועבר הם adoptively לעכברים. איור 4
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
פרוטוקול זה מאפשר אפיון הקיבולת של מוניטור-derived DCs לווסת את ההפעלה, התפשטות, התמיינות של תאי CD4 T נאיביים. יתר על כן, זה יכול לשמש גם כדי להעריך את הרגישות של תאי CD4 T מודולציה על-ידי בקרי נגזר מוניטור. עם פרוטוקול זה, שינויים באירועים אלה יכולים להיות נמדד ויוו.
בהתאם ההשערה תחת חקירה, ניתן להשתמש במספר שילובים של תאי T ו- DCs. לדוגמה, אחד ניתן לנתח את ההשלכות של דופק או לדפוק גנים ספציפיים או את היעילות של גירוי ספציפי של הפעלת תא CD4 T, התפשטות או בידול Th1. ניתן לבצע הליכים .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים אין לחשוף
תודות
אנו מודים ד ר סיימון ברטלט לצורך עריכה באנגלית. מחקר זה נתמך על ידי מענקים אינסטיטוטו דה סאלוד קרלוס השלישי (ISCIII) (PI14/00526; PI17/01395; CP11/00145; CPII16/00022), ושל מיגל Servet התוכנית Fundación רמון Areces; עם השתתפות במימון של הועדה המחוזית Fondo Europeo דה Desarrollo (פדר). CNIC נתמך על ידי משרד הכלכלה, התעשייה, תחרותיות (MEIC), קרן CNIC Pro, Severo אוצ'ואה התמחות (SEV-2015-0505). RTF היא נוסדה על ידי Fundación רמון Areces, CNIC, VZG על ידי ISCIII, BHF על ידי דה אינסטיטוטו Investigación Sanitaria חולים 12 דה אוקטוברה (imas12) ו- jmg ב- G על ידי תוכנית Servet של מיגל ISCIII imas12.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| אתנול | VWR כימיקלים | 20,824,365 | 5 ליטר |
| מספריים | כלים מדעיים עדינים (FST) | 14001-12 | |
| מלקחיים | כלים מדעיים עדינים (F.S.T.) | 11000-13 | |
| מלקחיים עדינים | כלים מדעיים עדינים (FST) | 11253-20 | |
| אזמל | כלים מדעיים עדינים (F.S.T.) | 10020-00 | קופסה של 100 להבים |
| סרום בקר עוברי | SIGMA | F7524 | |
| פניצילין/סטרפטומיצין | LONZA | DE17-602E | |
| מכון הזיכרון רוזוול פארק מדיום (RPMI) | GIBCO | 21875-034 | |
| צלחות פטרי סטריליות | פלקון | 353003 | |
| מחט 25 מד | BD Microlance 3 | 300600 | |
| מזרק 1 מ"ל | Novico | N15663 | |
| 15 מ"ל צינורות חרוטיים | Falcon | 352096 | |
| 50 מ"ל צינורות חרוטיים | Falcon | 352098 | |
| 70 μ m ניילון מסנן רשת | BD Falcon | 352350 | |
| מאגר ליזה דם אדום | SIGMA | R7757 | 100 מ"ל |
| EDTA | SIGMA | ED2SS-250 | |
| סרום בקר אלבומין | SIGMA | A7906 | 100 גרם |
| טריפן כחול | SIGMA | 302643-25G | |
| צלחות תרבית | פלקון | 353003 | |
| 4-(2-הידרוקסיאתיל)-1-פיפראזין-חומצה סולפונית (HEPES) | Cambrex | BE17-737E | |
| בטא-מרקפטואתנול | Merck | 8-05740-0250 | |
| נתרן פירובט | LONZA | BE13-115E | |
| L-גלוטמין | LONZA | BE17-605E | |
| רקומביננטי עכברי גרנולוציטים גורם מגרה מושבת מקרופאגים (GM-CSF) | Prepotech | 315-03 | |
| ליפופוליסכריד (LPS) | SIGMA-ALDRICH | L2018 | |
| 96-well-plate | Costar | 3799 | |
| v450 נגד עכבר CD11b נוגדן | BD Biosciences | 560455 | |
| PE נגד עכבר CD64 נוגדן | BioLegend | 139303 | |
| PE נגד עכבר CD115 נוגדן | BioLegend | 135505 | |
| FITC נגד עכבר נוגדן CD11c | BioLegend | 117305 | |
| FITC נגד עכבר נוגדן MHCII | BioLegend | 125507 | |
| APC נגד עכבר נוגדן CD86 | נוגדן BioLegend | 105011 | |
| APC נגד עכבר נוגדן CD80 | BioLegend | 104713 | |
| צינורות ציטומטריה זרימה | Zelian | 300800-1 | PS 12X75 5 מ"ל |
| OTII Ovoalbumine peptide | InvivoGen | 323-339 | |
| נוגדן CD8 ואלפא ביוטיניל נגד עכבר | Tonbo Biosciences | 30-0081-U500 | |
| נוגדן IgM ביוטיניל נגד עכבר | BioLegend | 406503 | |
| נוגדן B220 ביוטיניל נגד עכבר | Tonbo Biosciences | 30-0452-U500 | |
| נוגדן CD19 ביוטיניל נגד עכבר | Tonbo Biosciences | 30-0193-U500 | |
| נוגדן MHCII ביוטיניל נגד עכבר (I-Ab) | BioLegend | 115302 | |
| נוגדן CD11b ביוטיניל נגד עכבר | Tonbo Biosciences | 30-0112-U500 | |
| נוגדן CD11c ביוטיניל נגד עכבר | BioLegend | 117303 | |
| נוגדן CD44 ביוטיניל לעכבר | BioLegend | 103003 | |
| ביוטינילציה נוגדן CD25 | Tonbo Biosciences | 30-0251-U100 | |
| נוגדן DX5 נגד עכבר ביוטינילציה | BioLegend | 108903 | |
| מיקרו-חרוזים מגנטיים מצופים סטרפטווידין | MACS Miltenyi Biotec | 130-048-101 | |
| מפריד תאים מגנטיים | MACS Miltenyi Biotec | 130-090-976 | עמודות הפרדת מפריד QuadroMACS |
| MACS Miltenyi Biotec | 130-042-401 | ||
| PE נגד עכבר CD4 נוגדן | BioLegend | 100408 | |
| APC נגד עכבר CD3 נוגדן | BioLegend | 100235 | |
| FITC נגד עכבר CD8 נוגדן | Tonbo Biosciences | 35-0081-U025 | |
| Cell Violet Tracer | Thermofisher | C34557 | |
| APC נגד עכבר CD25 נוגדן Tonbo | Biosciences | 20-0251-U100 | |
| Alexa647 נגד עכבר CD69 נוגדן | BioLegend | 104518 | |
| PerCPCY5.5 נגד עכבר CD45.1 נוגדן | Tonbo Biosciences | 65-0453 | |
| APC נגד עכבר CD45.1 נוגדן | Tonbo Biosciences | 20-0453 | |
| PECY7 נגד עכבר CD45.1 נוגדן | Tonbo Biosciences | 60-0453 | |
| FITC נגד עכבר CD45.2 נוגדן | Tonbo Biosciences | 35-0454 | |
| Ionomycin | SIGMA-ALDRICH | I0634 | |
| Phorbol 12 Myristate 13 אצטט (PMA) | SIGMA | P8139 | |
| Brefeldin A (BD GolgiPlug) | BD | 555029 | |
| Paraformaldehyde | Millipore | 8-18715-02100 | |
| מאגר חדירות תוך-תאי | eBioscience | 00-8333 | |
| APC נגד עכבר IFNg נוגדן | Tonbo Biosciences | 20-7311-U100 | |
| Fc-block (נגד עכבר CD16/CD32) | Tonbo Biosciences | 70-0161-U100 | |
| B6. עכברי SJL CD45.1 | מעבדת ג'קסון | 002014 | |
| BD LSRמוצרים ומסחר; מנתח תאים | BD Biosciences | 649225 | |
| פתרון DAPI | Thermofisher | 62248 |
מקורות
- Zhu, J., Yamane, H., Paul, W. E. Differentiation of effector CD4 T cell populations (*). Annual Review of Immunology. 28, 445-489 (2010).
- Bustos-Moran, E., Blas-Rus, N., Martin-Cofreces, N. B., Sanchez-Madrid, F. Orchestrating Lym....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
