הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מודל העכבר In Vivo הפעלת תא T CD4 תמים מידה, התפשטות של בידול Th1 הנגרם על ידי תאים דנדריטים הנגזרות מח עצם

18.5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/58118

⸱

22 באוגוסט 2018

 ,  ,  , 
1LamImSys Lab, Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Carlos III (CNIC), 2LamImSys Lab, Instituto de Investigación Sanitaria Hospital 12 de Octubre (imas12), 3CIBER de Enfermedades Cardiovasculares

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מציגים את פרוטוקול מצפני ויוו תמים CD4 T התא (תא T) הפעלה, התפשטות, בידול Th1 המושרה על ידי מח העצם GM-CSF (מוניטור)-נגזר תאים דנדריטים (Dc). בנוסף, פרוטוקול זה מתאר בידוד מוניטור ו- T-cell דור DC, DC ו- T-cell העברה המאמצת.

תקציר

כימות של הפעלת תא CD4 T תמימה, התפשטות, בידול T helper 1 (Th1) התאים היא דרך שימושית כדי להעריך את התפקיד שממלאת בתאי T בתגובה חיסונית. פרוטוקול זה מתאר את הבידול במבחנה של מח העצם (מוניטור) אבות כדי להשיג גרנולוציט מקרופאג המושבה-מגרה פקטור (GM-CSF) נגזר-תאים דנדריטים (Dc). הפרוטוקול מתאר גם את ההעברה המאמצת של פפטיד אובלבומין (OVAp)-טעון DCs GM-CSF-derived ותאי CD4 T תמים מן העכברים הטרנסגניים OTII על מנת לנתח את הפעלת ויוו , התפשטות ו Th1 הבידול של תאי CD4 T שהועברו. פרוטוקול זה עוקף המגבלה של גרידא אין ויוו שיטות המוטלים על-ידי חוסר היכולת במיוחד לתמרן או בחר האוכלוסייה תא למד. יתר על כן, פרוטוקול זה מאפשר לימודים בסביבת ויוו , וכך להימנע שינויים לגורמים פונקציונלי שעלולות להתרחש במבחנה , לרבות את השפעת סוגי תאים וגורמים אחרים מצאו באיברים ללא פגע. הפרוטוקול הוא כלי שימושי עבור יצירת שינויים ב- DCs ו- T תאים זה לשנות את תגובות מערכת החיסון מסתגלת, פוטנציאל לספק תוצאות חשוב להבין את המקור או את התפתחות מחלות רבים הקשורים החיסון.

מבוא

תאי CD4 T אנטיגן הצגת תאים (נגמ שים) כגון DCs מגשרים נדרשת חסינות חיידקים פתוגנים1,2בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. באיברי הלימפה ההיקפית, תאי CD4 T מופעלים על הכרה של אנטיגנים ספציפיים שהוצגו על ידי נגמ שים3,4,5. תאי CD4 T מופעל להתרבות, להבדיל לתוך תאי Th ברורים אפקטור ספציפיים הדרושים להתפתחותם של תגובה חיסונית אדפטיבית נכונה6,7. שליטה על תהליכים אלה חיוני לייצור הגנה ראויה מסתגלת שהורג את הפתוגן מבלי לייצר רקמות מזיק נזק8. Th תאים מוגדרים על פי הביטוי או ייצור מולקולות על פני, גורמי שעתוק, ציטוקינים אפקטור ולבצע פונקציות חיוניות ומדויק בתגובה פתוגנים1. תאים של המשנה תא Th1 להביע את T-התערבות של גורם שעתוק של ציטוקין אינטרפרון וγ (IFNγ) ולהשתתף מארח הגנה מפני פתוגנים תאיים1. כימות של הפעלת תא CD4 T תמימה, התפשטות Th1 בידול היא אמצעי שימושי להעריך את משחק התפקידים T תאים, תגובה חיסונית.

ניתוח זה הפרוטוקול מאפשר vivo בתוך לקיבולת של חוץ גופיתבשנוצר BM-derived DCs לווסת את ההפעלה, התפשטות ו Th1 התמיינות של תאי CD4 T נאיביים. הפרוטוקול משמש גם כדי להעריך את היכולת של תאי CD4 T נאיבי להיות מופעל, המושרה כדי להתרבות, Th1 מבודלים (איור 1). פרוטוקול רב-תכליתי זה עוקף חוסר היכולת במיוחד לתמרן או בחר האוכלוסייה תא למדה גרידא אין ויוו בפרוטוקולים. ניתן יהיה ללמוד את ההשפעות של מולקולות שונות וטיפולים על בקרי תחום באמצעות מוניטור עכברים מהונדסים5 או בטיפול או מניפולציה גנטית מוניטור מבודד התאים9. באופן דומה, ניתן לסייר תא T תגובות על ידי קבלת בתאי T להעברת המאמצת ממקורות שונים או לאחר מספר מניפולציות3,8,10.

היתרונות העיקריים של פרוטוקול זה הם כפולה. הפעלת תא t התפשטות, בידול Th1 ניתוח בגישה cytometry זרימה; זה בשילוב עם ויוו מחקרים, ובכך הסב שינויים שעלולות להתרחש במבחנה , לרבות סוגי תאים וגורמים אחרים מצאו איברים שלמים11.

השימוש של צבע חיוני היא טכניקה בשימוש נרחב כדי לעקוב אחר התפשטות תאים תוך הימנעות את השימוש רדיואקטיביות. מידת התפשטות עם ריאגנטים אלה מבוסס על דילול צבע לאחר חלוקת התא. יתר על כן, צבעים אלה ניתן להבחין באורכי גל מרובים, מנותחים בקלות על ידי cytometry זרימה בשילוב עם נוגדנים פלורסנט או סמני מרובים. אנחנו להדגיש את התועלת של פרוטוקול זה לפי מראה כיצד הפעלת תא T התפשטות, בידול Th1 ניתן לנתח מאת cytometry זרימה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

נהלים ניסיוני אושרו על-ידי Fundación Centro נאסיונאל דה Investigaciones Cardiovasculares קרלוס השלישי (CNIC), את Autónoma קומונידד דה מדריד בהתאם להנחיות והאירופאים. עכברים התרבית פתוגן מסוים התנאים (SPF) חינם, היו מורדמים על ידי שאיפת פחמן דו-חמצני (CO2).

1. בידוד תאי מח עצם העכבר מ Tibias ועצמות ירך

הערה: המתח העכבר congenic C57BL/6 נושאת ליקוציט דיפרנציאלית הסמן Ptprc, כלל מוכרות כמו CD45.1 או Ly5.1, ואילו פראי-סוג C57BL זנים לשאת אלל Ptprcb , המכונה CD45.2 או Ly5.2. CD45.1 ו- CD45.2 משתנים ניתן לזיהוי על-ידי cytometry זרימה באמצעות נוגדנים. עכברים CD45.1, CD45.2 ו CD45.1/CD45.2 יכול לשמש כמקורות התא או הנמענים להעברת המאמצת, המתיר העקיבה של אוכלוסיות תאים נפרדים על-ידי cytometry זרימה. מעדיפים להשתמש גיל- ועכברים מתאימים-מין זכריים או נקביים מתחת גיל 12 שבועות.

  1. הכנת עצמות הירך, Tibias
    1. המתת חסד עכברים באמצעות פרוטוקול שאושר על ידי הוועדה המוסדית טיפול בבעלי חיים.
    2. לחטא את הגפיים האחוריות ע י ריסוס על פני חיים עם 70% אתנול.
    3. להשתמש במספריים סטרילי, מלקחיים, ואזמלי מנתחים. עם איזמל, לעשות חתך בעור ולהסיר את העור מן החלק הדיסטלי של העכבר כולל את העור המכסה את קצות הגפיים האחורי. לקלף את העור סביב שריר עגל נמוך יותר ולהסיר את העור מן הרגליים לחלוטין (איור 2 א, 2 ב).
    4. להפריד את השריר הארבע ראשי בין עצם הירך באמצעות אזמל. Disarticulate מפרק הירך מבלי לשבור את הראש של עצם הירך. הסר את השרירים בשוקיים באמצעות אזמל (איור 2C, 2D). להפריד בין עצם הירך לבין עצם השוקה מבלי לשבור את קצות העצם.
    5. שמור את העצמות בצלוחית המכילה 10% סרום שור עוברית (FBS) ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין במדיום רוזוול פארק אנדרטת המכון (RPMI) 1640 x 1 קרה כקרח.
  2. תא בידוד
    הערה: כל השלבים הבאים חייב להתבצע תחת ברדס תרבות ועם חומר סטרילי כדי למנוע זיהום.
    1. בצלחת פטרי סטריליות, בזהירות לחתוך את קצוות לקרע, כל עצם עם אזמל.
    2. לרוקן את העצמות שוב ושוב עם הנפח הכולל של 10 מ"ל של מדיום חם RPMI מלאה (RPMI + 10% FBS, 2 מ מ EDTA, 1% פניצילין/סטרפטומיצין, 20 מ מ HEPES, 55 מיקרומטר מרקפטואתנול, פירובט נתרן 1 מ מ ו- 2 מ מגלוטמין). לרוקן את העצמות משני הכיוונים באמצעות מחט 25 גרם המצורפת מזרק 1 מ"ל.
    3. להעביר את effluate צינור חרוטי 50 מ ל מצויד במסנן אינטרנט 70 מיקרומטר ניילון. בזהירות לסלק פסולת ותא וקונצרנים על ידי ערבוב עדין ו pipetting.
    4. Centrifuge התליה תא ב x 250 g 10 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
    5. Resuspend בגדר תא ב 1 מ"ל של מאגר קר פירוק תאי דם אדומים (0.15 מ' NH4קלרנית + 1 מ"מ KHCO3 + 0.1 מ"מ EDTA, מנוכי עונתיות pH עד 7.2 עם HCl N 1, מיקרומטר 0.4 סטרילי מסונן, ומאוחסנים ב 4 ° C). לשמור בקירור למשך 5 דקות עם המדריך רועדת.
    6. להוסיף 10 מ ל מאגר קר (1 x buffered פוספט תמיסת מלח (PBS) + 2 מ מ EDTA + 2% אלבומין שור (BSA)) בטל. ולשטוף את המאגר פירוק תאי דם אדומים.
    7. Centrifuge התליה תא ב x 250 g למשך 5 דקות ב 4 º C.
    8. לשטוף תאים עם 25 מ ל בינונית RPMI מלאה, צנטריפוגה ב 250 x g למשך 5 דקות ב 4 º C.
    9. Resuspend התאים 5 מיליליטר בינוני RPMI מלאה. מערבבים 50 µL של התליה תא 1:1 עם trypan blue. לקבוע את מספר הנייד בחדר הספירה תחת מיקרוסקופ. לחשב את מספר הנייד באמצעות הנוסחה: תאים למ"ל = [(ספירת תאים שאינם שהוכתמו/4) x 2 x 10,000]12.
      הערה: עצם זה התשואות 40 x 10 בשיטה6 עד 60 x 106 תאים במח לכל 8-12 בת שבוע C57BL/6 העכבר נגוע.
    10. Centrifuge התליה תא ב x 250 g למשך 5 דקות ב 4 º C.

2. DC בידול, ההבשלה וטעינה אנטיגן

  1. תא מוניטור קציר
    1. זרע התרבות מלאה על 6-ובכן נמוך במיוחד-מצורף משטח צלחות-106 תאים לכל מיליליטר בינוני, בדרך כלל ב 5 מ לכל טוב. מקרופאגים הבדיל לצרף התרבות-הצלחות. לאחר 12 שעות, להעביר את תגובת שיקוע, המכיל בעיקר ומונוציטים, לנקות צלחות 6-ובכן, השמטת צלחות 6-ובכן הישן עם המקרופאגים מודבקת.
    2. לקדם תאית התמיינות, התרבות התאים שאינם מחסידי ב 5 x 10 תאי5 מ ל בדרך כלל 5 מ"ל לכל טוב של בינוני RPMI מלאה המכילה 20 ng/mL מסחרית שהושג רקומביננטי מאתר GM-CSF-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני (CO2), התבונן מדי יום.
    3. כל 3 ימים, ספין למטה תאים מושעה לאסוף את תאים חסיד עם 5 מ מ EDTA ב- PBS ו ספין למטה. לשלב, resuspend ב 5 x 105 תאים למ"ל בינוני טריים המכילים 20 ng/mL rm-GM-CSF.
    4. ביום 8, לאסוף תאים חסיד ומנותק כאמור לעיל ו- resuspend-5 x 105 תאים למ"ל בשנת בינוני המכיל 20 ng/mL GM-CSF ו ng/mL 20 ליפופוליסכריד (LPS) במשך 24 שעות ביממה בשאינם תרביות רקמה-מטופלים עקר פטרי, לזירוז גבוהה MHC-II , ביטוי CD80 ו- CD86.
    5. בידול DC הסימון מאת cytometry זרימה כפי שמצוין בשלב 2.2.
  2. בידול Cytometry זרימה וניתוח ההבשלה.
    1. Centrifuge התליה תא ב x 250 g למשך 5 דקות ב 4 º C. חזור על שלב זה פעמיים.
    2. Fc לחסום קולטנים מאת המקננת בגדר תא resuspended ב העכבר Fc קולטן חוסם הפריטים המוקפצים (מטוהרים אנטי עכבר נוגדן2b אג CD16/CD32) למשך 15 דקות ב 4 ° C לפי הוראות היצרן.
    3. Centrifuge התליה תא ב x 250 g למשך 5 דקות ב 4 º C.
    4. עבור כל בדיקה, resuspend 250,000 בתאים µL 300 מאגר cytometry זרימה (1 x PBS + 2 מ מ EDTA + 2% BSA) ב 4 º C.
    5. להעביר 30 µL של התא פתרון לכל טוב 96-ובכן-צלחת.
    6. Centrifuge התליה תא ב x 250 g למשך 5 דקות ב 4 º C.
    7. למחוק את תגובת שיקוע והוסף 30 µL של נוגדן המכיל מאגר כדי כל גם בעקבות האינדיקציות של היצרן. דגירה התאים עם נוגדנים במשך 20 דקות ב 4 º C.
      הערה: בדרך כלל המועסקים סמנים עבור בקרי קבוצת מחשבים, ומונוציטים ו מקרופאגים הם CD11b, CD64, CD115, CD11c, MHCII, CD80 ו CD86 (איור 3).
    8. Centrifuge את הדגימות ב x 250 g למשך 5 דקות ב 4 ° C ו resuspend ב µL 200 לאדם טוב של מאגר cytometry זרימה קר המכילה סמן כדי לא לכלול תאים מתים (למשל, propidium יודיד, 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי) או של צבע אמין-ריאקטיבי )-הריכוז המומלץ של היצרן13.
    9. צג התמיינות תאים על-ידי העברת הדגימות צינורות cytometry זרימה וביצוע הניתוח cytometry זרימה לא כולל תאים מתים בימים 0, 3, 6 ו- 9.
  3. טעינת DC אנטיגן.
    1. יום 8, centrifuge את הדגימות ב x 250 g למשך 5 דקות ב 4 ° C, resuspend כדורי במדיום µL 200 (RPMI + 10% FBS ללא אנטיביוטיקה). חזור על שלב זה פעמיים.
    2. דגירה Dc עם µg/mL 10 OVAp (323-339; ISQAVHAAHAEINEAGR) לכל עונה 1 פרק 107 DCs ב 1 מ"ל של מדיום (RMPI + 1% FBS) צינור פלסטיק במשך לפחות 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס. השתמש DCs שאינם טעונים OVAp כתנאי שליטה שלילי.
    3. Centrifuge את הדגימות ב x 250 g למשך 5 דקות ב 4 ° C, resuspend כדורי 200 µL בינוני RPMI מלאה. חזור על שלב זה פעמיים.
    4. Centrifuge את הדגימות ב x 250 g למשך 5 דקות ב 4 ° C, resuspend כדורי במדיום µL 200 (RPMI + 10% FBS)-עונה 2 פרק 106 תאים/מ ל....

3. בידוד תאי T CD4 תמים מן OTII עכברים

הערה: שיטה זו מניבה כ 100 x 10 spleenocytes6 לכל 8 נגוע העכבר C57BL/6 בת שבוע 12. הן הזכרים והן הנקבות יכול לשמש. תאי CD4 T ניתן לבודד את הטחול או בלוטות הלימפה; תאי CD4 T חשבון עבור 25% ו- 50% של תאים באיברים אלה, בהתאמה. בצע את השלבים הבאים בתנאים סטריליים.

  1. לבודד מפשעי בבית השחי, נחתכו, צוואר הרחם, מצע המעי העליון בלוטות הלימפה והטחול מן העכברים הטרנסגניים OTII (איור 4) ומעבירים אותם אל פלסטיק פטרי המכיל 10 מ"ל של מדיום RPMI מלאה.
  2. לשטוף את מסננת תא 2 מ של מדיום RPMI מלאה ולהסיר אותו מהצינור 50 מ. העברת הלימפה והטחול כדי מסננת תא מיקרומטר 70 הניח צינור 50 מ. Homogenize באמצעות מזרק בוכנה (איור 5) ולהוסיף בינוני עד 15 מ"ל.
  3. Centrifuge את הדגימות ב x 250 g למשך 5 דקות ב 4 ° C, resuspend בגדר ב-15 מיליליטר בינוני RPMI מלאה. חזור על שלב זה פעמיים.
  4. הטחול תא השעיה, resuspend בגדר התא ואת lyse כדוריות דם אדומות כפי שמצוין בשלב 1.2.5.
  5. Centrifuge התליה תא ב x 250 g למשך 5 דקות ב 4 º C.
  6. לשטוף תאים עם 25 מ ל בינונית RPMI מלאה, צנטריפוגה ב 250 x g למשך 5 דקות ב- RT.
  7. Resuspend התאים 5 מ של מדיום. מערבבים 50 µL של התליה תא 1:1 עם Trypan blue. לקבוע את מספר הנייד באמצעות חדר הספירה תחת מיקרוסקופ. לחשב את מספר הנייד באמצעות הנוסחה: תאים למ"ל = [(ספירת תאים שאינם שהוכתמו/4) x 2 x 10,000]12.
  8. חזור על שלב 2.2.2.
  9. עקבתי אחרי ההוראות של היצרן, דגירה התאים עם 1:800 דילולים של נוגדנים biotinylated CD8α IgM, B220, CD19, MHCII (I-Ab), CD11b, CD11c, CD44, CD25, DX5 במשך 30 דקות על הקרח מאוחר יותר שלילי לבחירה של תאי CD4 T.
  10. ההוראות של היצרן, בהתבסס על מספר התאים לבין היכולת של החרוזים, לחשב את הכמות הנדרשת של גרגרי מגנטי מצופה streptavidin בידוד תאי CD4 T באמצעות מפריד תא מגנטי המתאים ההפרדה עמודות.
  11. Resuspend התאים 5 מיליליטר בינוני RPMI מלאה ולשמור אותם על קרח בזמן ספירת תאים חיים כפי שמתואר בשלב 3.7.
  12. חלץ 2 x 105 תאים וסמנו את הטוהר של התאים שנאספו באמצעות אנטי CD4, CD3, B220 ו CD8 נוגדנים פלורסנט ב cytometer זרימה באמצעות ממליץ יצרן דילולים נוגדן.
  13. כתם תאי CD4/OTII T נאיבי מבודד-resuspend 106 תאים במאגר µL 500 (1 x PBS + 2 מ מ EDTA + 2% BSA). הכנת 500 µL המכיל מאגר (1 x PBS + 2 מ מ EDTA + 2% BSA) להכפיל את הריכוז מומלץ היצרן הסופי של התא חיוני מעקב לצבוע. לערבב שני פתרונות על-ידי הוספת לאט הפתרון מעקב תא התליה תא. דגירה את התאים עבור 5 דקות ב 37 º C.
  14. לשטוף את התאים עם 5 מיליליטר בינונית RPMI מלאה, צנטריפוגה ב 250 x g דקות 5-4 מעלות צלזיוס. חזור על שלב זה פעמיים. Resuspend תאי 1 מ"ל של מדיום RPMI מלאה-עונה 1 פרק 107תאים/מ ל....

4. הפעלת in Vivo , התפשטות, Th1 בידול Assay

הערה: תא חיוני מעקב צבע carboxyfluorescein diacetate succinimidyl אסתר (CFSE), אחרים succinimidyl מבוסס-אסתר צבעים, אשר שמחים, פולטים קרינה פלואורסצנטית באורכי גל שונים, נמצאים בשימוש נרחב כדי להעריך את התפשטות לימפוציטים על ידי זרימת cytometry שלהם בעוצמה גבוהה פלורסצנטיות, חיים ארוכים, השתנות נמוך וכתוצאה רעילות נמוכה14.

  1. Adoptively להעביר דרך הווריד (עירוי) עונה 1 פרק 106 התא חיוני בשידור חי מעקב תמים שהוכתמו לצבוע T CD4/OTII בתאים µL 100 ל- PBS לכל העכבר. תאי T עם תוויות יכול להיות הועבר adoptively על-ידי וריד הזנב או רטרו-מסלולית הזרקת15; בשני המקרים, התאים בית לאיברים הלימפה (איור 6A).
  2. אתגר העכברים הנמען יום אחד מאוחר יותר על ידי העברת adoptively 100,000 התבגר-LPS טעונים OVAp DCs בזריקה תת עורית (ס. י) ב- footpads (איור 6B).
  3. הקציר popliteal הלימפה עכברים הנמען ולעבד אותם עד הקניית המתלים תא בודד ביצוע הפעולות המתוארות כאמור 3.1 ו- 3.2. לעשות זאת על חיסונים שלאחר יום 2 כדי למדוד את הפעלת תא T CD4/OTII ועל יום 5 כדי למדוד את התפשטות פלוס Th1 בידול.
  4. כדי לנתח את תא T הפעלה ביום 2, כתם תאים עם פלורסנט נוגדנים נגד CD4, CD69 ו CD25 (לחלופין CD45.1 ו- CD45.2), לקבוע את אחוזי C69+CD25+ T תאים באוכלוסיה CD4. ניתוח על ידי cytometry זרימה (איור 7).
  5. כדי לבדוק את תא T התפשטות ביום 5, כתם תאים באמצעות נוגדנים פלורסנט המתאים CD4, ובמידת CD45.1, CD45.2. לנתח את הדעיכה של האות לצבוע תא חיוני מעקב באוכלוסייה CD4 ידי cytometry זרימה (איור 8). מספר פרמטרים יכול להיקבע במחקרים אלה, כגון מספר חלוקות תאים עברה על ידי תאים בלוחיות לצבוע מעקב תא חיוני האחוז של תאים שיחצה כל שיא פלורסצנטיות, אחוז התאים החלוקה בתא סכום אוכלוסייה.
  6. כדי לקבוע Th1 בידול ביום 5, צלחת תאים 400,000 לכל טוב של צלחת 96-ובכן ב- 200 µL בינוני RPMI מלאה המכילה 1 מיקרומטר ionomycin ו 10 ננוגרם למ"ל phorbol 12 פעילים 13 אצטט (PMA) עבור 6-אייץ ' ב 37 מעלות צלזיוס בחממה. במשך 4 שעות האחרונות, להוסיף 3 – 10 µg/mL brefeldin כדי לחסום את הפרשת ציטוקינים למדיום.
  7. Centrifuge הלוחות עבור 5 דקות ב x 250 g ב- 4 מעלות צלזיוס. למחוק את תגובת שיקוע על-ידי היפוך מהיר של צלחת 96-ובכן.
  8. חזור על שלב 2.2.2.
  9. כתם קרום התא על ידי המקננת למשך 15 דקות ב 4 ° C ב- 30 µL מאגר (1 x PBS + 2 מ מ EDTA + 2% BSA) המכיל נוגדנים ל CD4 ולבחירתך גם CD45.1, CD45.2-דילולים יצרן-מומלץ. לשטוף את התאים על-ידי הוספת µL 150 מאגר (1 x PBS + 2 מ מ EDTA + 2% BSA), centrifuge את הצלחות במשך 5 דקות ב x 250 g ב 4 ° C ולמחוק את תגובת שיקוע.
  10. לתקן התאים על-ידי הוספת µL 100 של paraformaldehyde/1% 2% סוכרוז למשך 20 דקות ב- RT. צנטריפוגה הלוחות עבור 5 דקות ב x 1000 g ו- 4 מעלות צלזיוס. למחוק את תגובת שיקוע.
  11. Permeabilize בתאים על-ידי הוספת µL 50 permeabilization תאיים מאגר (1 x PBS + 0.1% BSA, 0.01 M HEPES, סאפונין 0.3%) ואת תקופת דגירה של 30 דקות ב 4 º C.
  12. להוסיף 150 µL של PBS, צנטריפוגה עבור 5 דקות בכל 1,000 x g ב- RT. להשליך תגובת שיקוע.
  13. כתם ציטוקינים תאיים על-ידי הוספת 30 µL של fluorophore-מצומדת אנטי-נוגדן IFNγ במאגר (PBS + 0.1% סאפונין) ואת תקופת דגירה של 30 דקות ב- RT.
  14. לשטוף את התאים על-ידי הוספת µL 150 מאגר (PBS + 0.1% סאפונין). Centrifuge הלוחות עבור 5 דקות ב x 1000 g ב- RT וזורקים את תגובת שיקוע. חזור על שלב זה פעמיים.
  15. לנתח אוכלוסיות תאים על-ידי cytometry זרימה (איור 8).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

איור 1 מדגימה את השלבים המתוארים פרוטוקול זה. איור 2 מדגים את הבידוד והתרבות של העכבר מוניטור תאים. התוספת של GM-CSF ו LPS לתרבויות אלה מאפשר הדור במבחנה , ההבשלה של בקרי תחום. איור 3 מדגימה ניתוח cytometry זרימה של בידול ועם בגרות שהושג שנטענו DCs-OVAp GM-CSF BM-derived בקרי התחום התא חיוני מבודד מעקב שהוכתמו לצבוע בתאי T CD4/OTII הועבר הם adoptively לעכברים. איור 4

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

פרוטוקול זה מאפשר אפיון הקיבולת של מוניטור-derived DCs לווסת את ההפעלה, התפשטות, התמיינות של תאי CD4 T נאיביים. יתר על כן, זה יכול לשמש גם כדי להעריך את הרגישות של תאי CD4 T מודולציה על-ידי בקרי נגזר מוניטור. עם פרוטוקול זה, שינויים באירועים אלה יכולים להיות נמדד ויוו.

בהתאם ההשערה תחת חקירה, ניתן להשתמש במספר שילובים של תאי T ו- DCs. לדוגמה, אחד ניתן לנתח את ההשלכות של דופק או לדפוק גנים ספציפיים או את היעילות של גירוי ספציפי של הפעלת תא CD4 T, התפשטות או בידול Th1. ניתן לבצע הליכים ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף

תודות

אנו מודים ד ר סיימון ברטלט לצורך עריכה באנגלית. מחקר זה נתמך על ידי מענקים אינסטיטוטו דה סאלוד קרלוס השלישי (ISCIII) (PI14/00526; PI17/01395; CP11/00145; CPII16/00022), ושל מיגל Servet התוכנית Fundación רמון Areces; עם השתתפות במימון של הועדה המחוזית Fondo Europeo דה Desarrollo (פדר). CNIC נתמך על ידי משרד הכלכלה, התעשייה, תחרותיות (MEIC), קרן CNIC Pro, Severo אוצ'ואה התמחות (SEV-2015-0505). RTF היא נוסדה על ידי Fundación רמון Areces, CNIC, VZG על ידי ISCIII, BHF על ידי דה אינסטיטוטו Investigación Sanitaria חולים 12 דה אוקטוברה (imas12) ו- jmg ב- G על ידי תוכנית Servet של מיגל ISCIII imas12.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אתנולVWR כימיקלים20,824,3655 ליטר
מספרייםכלים מדעיים עדינים (FST)14001-12
מלקחייםכלים מדעיים עדינים (F.S.T.)11000-13
מלקחיים עדיניםכלים מדעיים עדינים (FST)11253-20
אזמלכלים מדעיים עדינים (F.S.T.)10020-00קופסה של 100 להבים
סרום בקר עובריSIGMAF7524
פניצילין/סטרפטומיציןLONZADE17-602E
מכון הזיכרון רוזוול פארק מדיום (RPMI)GIBCO21875-034
צלחות פטרי סטריליותפלקון353003
מחט 25 מדBD Microlance 3300600
מזרק 1 מ"לNovicoN15663
15 מ"ל צינורות חרוטייםFalcon352096
50 מ"ל צינורות חרוטייםFalcon352098
70 μ m ניילון מסנן רשתBD Falcon352350
מאגר ליזה דם אדוםSIGMAR7757100 מ"ל
EDTASIGMAED2SS-250
סרום בקר אלבומיןSIGMAA7906100 גרם
טריפן כחולSIGMA302643-25G
צלחות תרביתפלקון353003
4-(2-הידרוקסיאתיל)-1-פיפראזין-חומצה סולפונית (HEPES)CambrexBE17-737E
בטא-מרקפטואתנולMerck8-05740-0250
נתרן פירובטLONZABE13-115E
L-גלוטמיןLONZABE17-605E
רקומביננטי עכברי גרנולוציטים גורם מגרה מושבת מקרופאגים (GM-CSF)Prepotech315-03
ליפופוליסכריד (LPS)SIGMA-ALDRICHL2018
96-well-plateCostar3799
v450 נגד עכבר CD11b נוגדןBD Biosciences560455
PE נגד עכבר CD64 נוגדןBioLegend139303
PE נגד עכבר CD115 נוגדןBioLegend135505
FITC נגד עכבר נוגדן CD11cBioLegend117305
FITC נגד עכבר נוגדן MHCIIBioLegend125507
APC נגד עכבר נוגדן CD86נוגדן BioLegend105011
APC נגד עכבר נוגדן CD80BioLegend104713
צינורות ציטומטריה זרימהZelian300800-1PS 12X75 5 מ"ל
OTII Ovoalbumine peptideInvivoGen323-339
נוגדן CD8 ואלפא ביוטיניל נגד עכברTonbo Biosciences30-0081-U500
נוגדן IgM ביוטיניל נגד עכברBioLegend406503
נוגדן B220 ביוטיניל נגד עכברTonbo Biosciences30-0452-U500
נוגדן CD19 ביוטיניל נגד עכברTonbo Biosciences30-0193-U500
נוגדן MHCII ביוטיניל נגד עכבר (I-Ab)BioLegend115302
נוגדן CD11b ביוטיניל נגד עכברTonbo Biosciences30-0112-U500
נוגדן CD11c ביוטיניל נגד עכברBioLegend117303
נוגדן CD44 ביוטיניל לעכברBioLegend103003
ביוטינילציה נוגדן CD25Tonbo Biosciences30-0251-U100
נוגדן DX5 נגד עכבר ביוטינילציהBioLegend108903
מיקרו-חרוזים מגנטיים מצופים סטרפטווידיןMACS Miltenyi Biotec130-048-101
מפריד תאים מגנטייםMACS Miltenyi Biotec130-090-976עמודות הפרדת מפריד QuadroMACS
MACS Miltenyi Biotec130-042-401
PE נגד עכבר CD4 נוגדןBioLegend100408
APC נגד עכבר CD3 נוגדןBioLegend100235
FITC נגד עכבר CD8 נוגדןTonbo Biosciences35-0081-U025
Cell Violet TracerThermofisherC34557
APC נגד עכבר CD25 נוגדן TonboBiosciences20-0251-U100
Alexa647 נגד עכבר CD69 נוגדןBioLegend104518
PerCPCY5.5 נגד עכבר CD45.1 נוגדןTonbo Biosciences65-0453
APC נגד עכבר CD45.1 נוגדןTonbo Biosciences20-0453
PECY7 נגד עכבר CD45.1 נוגדןTonbo Biosciences60-0453
FITC נגד עכבר CD45.2 נוגדןTonbo Biosciences35-0454
IonomycinSIGMA-ALDRICHI0634
Phorbol 12 Myristate 13 אצטט (PMA)SIGMAP8139
Brefeldin A (BD GolgiPlug)BD555029
ParaformaldehydeMillipore8-18715-02100
מאגר חדירות תוך-תאיeBioscience00-8333
APC נגד עכבר IFNg נוגדןTonbo Biosciences20-7311-U100
Fc-block (נגד עכבר CD16/CD32)Tonbo Biosciences70-0161-U100
B6. עכברי SJL CD45.1מעבדת ג'קסון002014
BD LSRמוצרים ומסחר; מנתח תאיםBD Biosciences649225
פתרון DAPIThermofisher62248

מקורות

  1. Zhu, J., Yamane, H., Paul, W. E. Differentiation of effector CD4 T cell populations (*). Annual Review of Immunology. 28, 445-489 (2010).
  2. Bustos-Moran, E., Blas-Rus, N., Martin-Cofreces, N. B., Sanchez-Madrid, F. Orchestrating Lymphocyte Polarity in Cognate Immune Cell-Cell Interactions. International Review of Cell and Molecular Biology. 327, 195-261 (2016).
  3. Gonzalez-Granado, J. M., et al. Nuclear envelope lamin-A couples actin dynamics with immunological synapse architecture and T cell activation. Science Signaling. 7 (322), ra37(2014).
  4. Rocha-Perugini, V., Gonzalez-Granado, J. M. Nuclear envelope lamin-A as a coordinator of T cell activation. Nucleus. 5 (5), 396-401 (2014).
  5. Rocha-Perugini, V., et al. CD9 Regulates Major Histocompatibility Complex Class II Trafficking in Monocyte-Derived Dendritic Cells. Molecular and Cellular Biology. 37 (15), (2017).
  6. Kaech, S. M., Wherry, E. J., Ahmed, R. Effector and memory T-cell differentiation: implications for vaccine development. Nature Reviews Immunology. 2 (4), 251-262 (2002).
  7. Iborra, S., Gonzalez-Granado, J. M. In Vitro Differentiation of Naive CD4(+) T Cells: A Tool for Understanding the Development of Atherosclerosis. Methods in Molecular Biology. 1339, 177-189 (2015).
  8. Toribio-Fernandez, R., et al. Lamin A/C augments Th1 differentiation and response against vaccinia virus and Leishmania major. Cell Death & Disease. 9 (1), 9(2018).
  9. Lee, T., Shevchenko, I., Sprouse, M. L., Bettini, M., Bettini, M. L. Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice. Journal of Visualized Experiments. (113), (2016).
  10. Cruz-Adalia, A., et al. Conventional CD4(+) T cells present bacterial antigens to induce cytotoxic and memory CD8(+) T cell responses. Nature Communications. 8 (1), 1591(2017).
  11. Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. The use of fluorescent target arrays for assessment of T cell responses in vivo. Journal of Visualized Experiments. (88), e51627(2014).
  12. Cruz-Adalia, A., Ramirez-Santiago, G., Torres-Torresano, M., Garcia-Ferreras, R., Veiga Chacon, E. T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells. Journal of Visualized Experiments. (107), e52976(2016).
  13. Cossarizza, A., et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies. European Journal of Immunology. 47 (10), 1584-1797 (2017).
  14. Quah, B. J., Parish, C. R. New and improved methods for measuring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo using CFSE-like fluorescent dyes. Journal of Immunological Methods. 379 (1-2), 1-14 (2012).
  15. Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. Lab Animals (NY). 40 (5), 155-160 (2011).
  16. Warth, S. C., Heissmeyer, V. Adenoviral transduction of naive CD4 T cells to study Treg differentiation. Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).
  17. Liou, H. L., Myers, J. T., Barkauskas, D. S., Huang, A. Y. Intravital imaging of the mouse popliteal lymph node. Journal of Visualized Experiments. (60), (2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

הפעלת תאי T מסוג CD4 נאיבייםהעברה מאמצת של תאיםניתוח בציטומטריית זרימהבידוד מחולש העצםקצירת קשרי לימפהפרוליפרציה של תאי Tצביעה תוך-תאית של ציטוקיניםעכברי OTII טרנסגניים
מודל העכבר In Vivo הפעלת תא T CD4 תמים מידה, התפשטות של בידול Th1 הנגרם על ידי תאים דנדריטים הנגזרות מח עצם
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.