הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

סינתזה ואפיון של 1, 2-Dithiolane ששינה פפטידים וההספק עצמית

7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/58135

⸱

20 באוגוסט 2018

 ,  , 
1Department of Chemistry and Biochemistry, Fairfield University

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול לסינתזה של 1, 2-dithiolane ששינה פפטיד ואפיון המבנים סופרא מולקולרית הנובע פפטיד הרכבה עצמית.

תקציר

הדו ח מתמקד הסינתזה של קצה אמיני 1, 2-dithiolane שינוי עצמי וההספק פפטיד, אפיון וכתוצאה מכך התאספו עצמית מבנים סופרא מולקולרית. המסלול סינתטי מנצל מוצק-פאזי פפטיד סינתזה עם המושבים על-שרף של dithiolane מולקולה קודמן, 3-(acetylthio)-2-חומצה propanoic (acetylthiomethyl), את thioacetate בסיוע מיקרוגל deprotection של פפטיד אמיני לפני המחשוף הסופי של השרף להניב את 1, 2-dithiolane ששינה פפטיד. לאחר הטיהור ביצועים גבוהים כרומטוגרפיה נוזלית (HPLC) של פפטיד 1, 2-dithiolane, נגזר ליבת nucleating פפטיד Aβ הקשורים עם מחלת אלצהיימר, מוצג על פפטיד להרכיב עצמי לתוך סיבי עמילואיד קרוס-β. פרוטוקולים לאפיין את סיבי עמילואיד על ידי פורייה-ספקטרוסקופיית (FT-IR), קיווטות ספקטרוסקופיה (CD) במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (TEM) מוצגים. השיטות של שינוי N-מסוף עם moiety 1, 2-dithiolane פפטידים עצמית וההספק מאופיין היטב עכשיו ניתן לסייר כמערכות מודל לפיתוח אסטרטגיות ההרכבה שלאחר השינוי ולחקור דינמי כימיה קוולנטיות על פפטיד סופרא מולקולרית nanofiber משטחים.

מבוא

הקשר הפפטידי חזקים ויוצרים כימיה מעורב פפטיד מוצק-שלב הסינתזה ולעשות היכולת לשלוט רצף באורך ו הלחנה של פפטידים בעצמם למבנים סופרא מולקולרית שדה חקר בכבדות. הגורמים לשלוט ולייצב את מבנים מורכבים עצמית פפטיד, כולל שרשרת הצד הסטריים אלקטרוסטאטיות, מימן, וכוחות אפקטים הידרופובי1, לשמש ערכה של כללי עיצוב. כמו המחקר לתוך אלה כללי עיצוב בסיסי ממשיך להתקדם, הצעד ההגיוני הבא בפפטיד כוללת הרכבה עצמית הרחבת המגוון של מבנים מבוססת על פפטיד ופונקציות. בעוד עצמית בהרכבת פפטידים נמצאים biomaterial רב-תכליתי נעשה בהם שימוש ביו יישומים רבים על-ידי כיוונון פפטיד רצף או מכלול התנאים2,3,4, הפיתוח של אסטרטגיות שינויים שלאחר ההרכבה פפטיד nanofibers5,6,7,8,9 נשאר אזור יחסית שאינו גלוי.

כימיה exchange ותיול דיסולפידי דינמי על פני השטח של מבנים סופרא מולקולרית היא אזור בעל פוטנציאל תשואה biomaterials חדש ופונקציונלי. שילוב של 1, 2-dithiolane moieties (בדרך כלל נגזרת של חומצה ליפואית (la) או חומצה asparagusic (aa)) דווחו ליפוזום מערכות10,11,12,copolymers בלוק13, וכן ארגון עוגנים משטחים14,15. במסמך זה, אנחנו מדווחים על סינתזה ואפיון של פפטיד עצמית וההספק המופק nucleating הליבה של פפטיד Aβ הקשורים עם מחלת אלצהיימר ששונתה ב קצה אמיני עם קבוצה פונקציונלית 1, 2-dithiolane16, 17. הסיבים סופרא מולקולרית וכתוצאה מכך עכשיו לשמש פלטפורמה ניסיוני ללמוד את תגובתיות דיסולפידי-exchange ותיול על פני השטח סופרא מולקולרית של סיבי עמילואיד18.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. סינתזה ולטיהור 1, 2-Dithiolane ששינה פפטיד

  1. סינתזה של קודמן dithiolane, 3-(acetylthio)-2-חומצה propanoic (acetylthiomethyl)19.
    1. להוסיף 1 גר' 3-ברומו - 2-(bromomethyl) חומצה propionic (1 equiv.) מומס כמות מינימלית של NaOH M 1 (כ- 4 מ"ל) אל בקבוק התגובה התחתון עגול 25-mL עם ערבוב-55 מעלות צלזיוס. לאטום את הבקבוקון התגובה עם septa ומניחים תחת חנקן אווירה.
    2. להכין פתרון המכיל 1.49 גרם אשלגן thioacetate (3.2 equiv.) ב- 4 מ"ל של מים יונים ו- 3 מ"ל של חומצה גופרתית 2 מ' (H2אז4) כדי ליצור thioacetic חומצה בחיי עיר.
    3. משוך את הפתרון חומצה thioacetic לתוך מזרק פלסטיק חד פעמיות 10 מ ל, במקום מחט על המזרק. להוסיף את התערובת dropwise הבקבוקון התגובה על ידי פירסינג דרך septa עם המחט. המשך התגובה בין לילה-55 מעלות צלזיוס.
    4. נטר את התגובה על ידי שכבה דקה כרומטוגרפיה (TLC) על צלחות254 סיליקה ג'ל 60 F באמצעות תערובת של מתנול דיכלורומתאן (1:9). דמיינו את התקדמות התגובה על ידי הכתם הירוק bromocresol. המוצר כולל Rf = 0.57.
    5. לאחר התגובה המלאה ומצוננים לטמפרטורת החדר, acidify את התערובת עד ה-pH 1 עם 2 M H2אז4. מפריד שמן צהוב טובה מתוך פתרון.
    6. לחלץ את המוצר עם הכלורופורם קר (40 מ ל x 3). לשלב את שכבות אורגני ויבש מעל מגנזיום גופרתי. הסר את הכלורופורם תחת לחץ מופחת.
    7. לאשר את זהותו של המוצר מבודד, 1, על ידי תהודה מגנטית גרעינית (NMR) ספקטרוסקופיה כפי שמוצג דמויות 1B ו- C. לצפות את התוצאות הבאות: 1H NMR, CDCl3, 300 MHz: d = 10.1 (b, 1 H) 3.2 (ז, ח 4), 2.9 (ז, ח 1), 2.4 (s, 6-אייץ '); 13 C NMR, CDCl3, 75 מגה-הרץ: d = 195.1 (CH3ג'OS-), 177.6 (-אוC), 45.1 (CH2S-), 30.5 (CH), 29.2 (-SCOCH3).
      הערה: המוצר הוא שמן צהוב ויש לו את התשואה הכוללת של 83%. להשתמש במוצר ללא טיהור נוסף.
  2. SPPS ו---שרף צימוד של קודמן Dithiolane
    הערה: הסינתזה שלב מוצק פפטיד המתוארים להלן נערך על סינתיסייזר פפטיד אוטומטיות, בעקבות הפרוטוקולים של היצרן המומלצת. הגדרות של ריאגנטים עשוי להיות מותאם לכלים מסחריים אחרים או בעת שימוש מיוחדים חומצות אמינו.
    1. שוקלים לצאת 0.156 גר' רינק אמיד 4-methylbenzhydrylamine (MBHA) שרף (0.1 mmol) ומניחים בתוך קיבול התגובה. להתנפח השרף ב- dimethylformamide (DMF) למשך לפחות 15 דקות לפני תחילתה של הסינתזה.
    2. שוקלים לצאת 4 במקבילות של כל fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) מוגן חומצת אמינו (0.4 mmol) רצף, 0.152 גר' N, N, N', N'- tetramethyl-O-(1H- benotriazol-1-yl) אורניום hexafluorophosphate (0.4 mmol, HBTU) עבור כל חומצה אמינית ברצף. בכל מחסנית מכיל חומצת אמינו המוגנים Fmoc והן HBTU.
    3. לאחר הפעלת סינתזה קדם כל בדיקות על סינתיסייזר (למלא ריאגנטים, ריקון ריאגנט קווים, המרפד את כל הבקבוקים ריאגנט), למקם את מכלי חומצת אמינו הקרוסלה ב- C' ל N' כיוון טרמינוס. הנח מחסנית ריקה לאחר התנוחה הסופית חומצת אמינו עבור השלב הסופי של deprotection Fmoc N-מסוף.
    4. לסנתז את פפטיד באמצעות ההגדרות המומלצות סטנדרטי.
      1. Deprotect קבוצת Fmoc של השרף עם 5 מ של 20% פיפרידין ב DMF (5 דקות x 2).
      2. לשטוף את השרף עם DMF (6 x 5 מ"ל) לפני השלב צימוד.
      3. עבור צעד וזיווג, להוסיף 4 מיליליטר 0.4 M N-methylmorpholine DMF חומצת אמינו המוגנים באמצעות Fmoc ו- HBTU. להפעיל את הפתרון המוגנים Fmoc חומצת אמינו עבור 30 s לפני העברת הפתרון מיכל התגובה.
        הערה: סינתיסייזר פפטיד אוטומטית תערובות השרף, הפתרון על ידי גז2 N מבעבעים כל 30 s עבור 20 דקות בזמן התגובה צימוד מתרחש. עבור סינתזה פפטיד ידנית, הנח את הכלי התגובה על תפקודי לב / נשימה במהירות נמוכה משך השלב צימוד.
      4. מסננים את הפתרון ולשטוף השרף עם DMF (3 x 5 מ"ל).
      5. חזור על שלבים 1.2.4.1 דרך 1.2.4.4 עבור כל חומצת אמינו המוגן על-ידי Fmoc ב C' ל N'-terminus כיוון לסנתז את פפטיד עניין.
    5. לאחר השלב הסופי deprotection N-מסוף, להעביר את השרף לתוך מזרק חד פעמיות fritted. לשטוף את השרף עם DMF (3 x 5 מ"ל), דיכלורומתאן (DCM, 3 x 5 מ"ל).
      הערה: ניתן לאחסן השרף לאחר DCM כביסה ב desiccator ואקום. אם השרף היה מאוחסן הקודמת לצימוד, ודא להתנפח השרף ב DMF לפני התגובה צימוד.
    6. כמה מבשר dithiolane (1) ל N-הסופית של פפטיד בשרף על-ידי הוספת 4 במקבילות של 1, 5 מ של DMF, המקבילים 4 HBTU ושווי 10 של N, N-diisopropylethylamine (DIPEA). מראש להפעיל את התערובת צימוד 10 דקות לפני הוספת שרף המכיל מזרק fritted.
    7. לנער את התגובה צימוד כבר שעתיים. לאחר 2 h, לשטוף את השרף עם DMF (3 x 5 מ"ל) וחזור על התגובה צימוד עם טלטולים למשך הלילה.
    8. לאחר המושבים השנייה, לשטוף השרף עם DMF (3 x 5 מ"ל) ו DCM (3 x 5 מ"ל).
      הערה: השרף ניתן לאחסן בנקודה זו תחת ואקום עד המחשוף.
  3. Thioacetate Deprotection, פפטיד המחשוף של שרף
    1. כדי deprotect את הקבוצה thioacetate מן ההתחלה dithiolane אמיני, להעביר את השרף מיובשים צינור התגובה מיקרוגל 10 מ"ל ולהוסיף 2 מיליליטר DMF. לאפשר לשרף להתנפח, להוסיף פס קטן מערבבים מגנטי לכלי השיט, וכן להשעות מחדש עם מהירות נמוכה של בחישה מגנטית למשך 15 דקות.
    2. להוסיף 2 מיליליטר מרוכז אמוניה מימית, קפטן הספינה התגובה עם septa סיליקון, ולמקם את מיכל התגובה לתוך כור מיקרוגל משתמש בהגדרות מיקרוגל של 75 מעלות צלזיוס במשך 45 דקות עם ערבוב.
    3. בתום התגובה מיקרוגל, להעביר את השרף לתוך מזרק חד פעמיות נקי fritted. לשטוף עם DMF (2 x 5 מ"ל), מתנול (MeOH, 2 x 5 מ"ל).
    4. להוסיף פתרון של. אמוניה מימית מרוכזים ב מתנול (1:4), עבור הנפח הכולל של 5 מ. יוצאים לרעוד לילה כדי להגביר חמצון התפלגות של קשר דיסולפידי בטבעת dithiolane.
    5. לשטוף את השרף עם MeOH (2 x 5 מ"ל) ו DCM (3 x 5 מ"ל).
      הערה: שרף יבשים ניתן לאחסן ב- desiccator ואקום בשלב זה.
    6. להוסיף את הקוקטייל המחשוף שרף המכיל את המזרק עם מנענע בעדינות עבור 1.5 h. המחשוף קוקטייל בשימוש היא 95% חומצה trifluoroacetic (TFA), 2.5% triisopropylsilane (טיפים), 2.5% מים-הנפח הכולל של 5 מ.
      התראה: לעבוד תחת fume כימי המנוע בלבד. TFA הוא תנודתי, מאכל.
      הערה: עבור רוב פפטיד רצפי חומצות אמינו sidechain הגנה על קבוצות, הפתרון קוקטייל מעל המחשוף מספיקה; עם זאת, קוקטיילים המחשוף אלטרנטיבית עשוי להיות נחוץ עבור מסוימים שרשרת הצד של חומצת אמינו מגנה על קבוצות (פפטידים מסוים המכיל Cys, Met, Trp Arg) או נוספות כימיה שרף20.
    7. לזרז את פפטיד גסה לתוך 25 מיליליטר קר דיאתיל אתר צינור חרוטי 50 מ על-ידי חיבור dropwise של המזרק fritted. פפטיד ארגונייט שוקע כמו מוצק לבן. צניפה פפטיד על ידי צנטריפוגה-1300 גרם x עבור 10 דקות decant בקפידה את דיאתיל אתר לתוך מיכל נפרדת לאיסוף פסולת.
    8. להוסיף עוד 25 מ של דיאתיל אתר צינור חרוטי, מחדש להשעות את התמיסה על-ידי vortexing. אני חוזר על צנטריפוגה-1300 גרם x 10 דקות, decant של דיאתיל אתר שוב. יבש בגדר תחת ואקום.
  4. טיהור של 1, 2-Dithiolane ששינה פפטיד
    הערה: לטהר את פפטיד גולמי על ידי היפוך פאזה-HPLC. לאסוף, לשלב את הפסגות פפטיד ואשר המסה באמצעות ספקטרומטר מסה MALDI-TOF.
    1. להמיס בגדר פפטיד גסה כמות מינימלית של acetonitrile עם 0.1% TFA. הודות hydrophobicity של פפטיד של צבירת הנטייה, בעדינות לחמם את הדגימה ב 40 ° C כדי לסייע מסיסות.
      הערה: להימנע גבוה טמפרטורות sonication של פפטיד על מנת למנוע פוטנציאליים דיסולפידי חילופי תגובות21,22,23.
    2. כדי להכין 1 מ"ל של פפטיד גולמי לטיהור HPLC, להוסיף μL 400 מניות פפטיד מרוכזים ב acetonitrile 600 μL של H2O עם 0.1% TFA וסינון דרך מסנן מזרק 22 μm לתוך בקבוקון HPLC. ניתן להוסיף אלכוהול איזופרופיל נוספת 5% כדי למנוע צבירת פפטיד משקעים.
    3. לטהר פפטיד באמצעות העמודה למחצה מפוח C-18 עם קצב זרימה של 3 mL/min מעל מעבר צבע ליניארי של 15-55% acetonitrile ב- 20 מינימלית קבע את גלאי UV 222 nm (אמיד backbone), 330 nm (קשר דיסולפידי). לאסוף ולשלב את הפסגות של הריבית (איור 2 א).
    4. לאשר את המסה המוצר פפטיד באמצעות ספקטרומטר מסה MALDI-TOF במצב reflectron (איור 2B). לניתוח, מערבבים 0.5 μL של שיא שנאספו על הצלחת MALDI עם 0.5 μL של 2, 5-dihydroxybenzoic חומצה (DHB) מטריקס (10 מ"ג/מ"ל DHB ב- 50% acetonitrile, 0.1% TFA).
      הערה: המשותף adducts ב MALDI-TOF ספקטרומטר מסה כוללים הנתרן, אשלגן מלח adduct ([M + Na]+ , [M + K]+) פסגות. Desalting המדגם לפני הניתוח מומלץ אם הפסגות adduct מלח לדכא את האות של הפסגה [M + H]+ הראשי. בנוסף, לשיא מחמצנים [M + O]+ הוא זוהה גם בפפטיד 1, 2-dithiolane שונה. דו ח על לייזר המושרה חמצון מ יינון MALDI באמצעות מטריצת DHB עולה כי גורמים שונים, לרבות ריכוז מדגם, הממס, לייזר בעוצמה יכול להיות שונה כדי להגביל את החפץ חמצון MALDI המושרה24.
    5. לאחר אישור MALDI-תוף של המסה נכונה, lyophilize פפטיד לאחר הקפאה פלאש. לשמור את האבקה פפטיד lyophilized תחת ואקום עד העצרת.

2. אפיון סופרא מולקולרית מבני הרכבה עצמית

  1. היווצרות של סיבי עמילואיד
    1. כדי להכין הרכבה עצמית פתרון, לשקול את 1 מ ג של האבקה פפטיד באמצעות איזון האנליטי. להתמוסס אל תוך תערובת (pH 7.5) של 20% acetonitrile ו 10 מ מ (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic חומצה (HEPES) בצינור 1.5 mL-microcentrifuge, כדי ריכוז סופי של 1 מ"ג/מ"ל פפטיד הרכבה תערובת. מערבולת הפתרון הרכבה ולהשאיר להרכיב בטמפרטורת החדר.
  2. אפיון ספקטרוסקופיות של סיבי עמילואיד
    1. בצע את תהליך ההרכבה פפטיד דרך פורייה-(FTIR) ספקטרוסקופיית כל כמה ימים. לשיא רחבה סביב 1670 ס מ-1 הוא חתימת האינפרא-אדום הנובעים פפטידים unassembled מדגם ה-17. הדגימות הרכבה פפטיד שבד כ שבוע עד שבועיים הפסגה unassembled רחבה להיעלם ולהגיע ההבשלה.
      1. יבשה aliquot של 8-10 μL של הפתרון הרכבה כמו סרט דק של קריסטל יהלום ATR. לפקח על היעלמותו של שיא מים רחבה ועמוקה של 1640 עד 1630 ס מ-1 כטפסים הסרט יבש.
      2. רוכשים את ספקטרום אינפרא-אדום בין 1500-1800 ס מ-1 בממוצע 50 סריקות עם רזולוציה-1 2 ס מ. לרכוש ולהחסיר את הרקע סריקות לפני כל סריקה הדגימה. חתימת האינפרא-אדום עבור β-גיליון ההרכבה היא שיא חדה בין 1625, 1635 ס מ-1 (באיור 3 א)25,26.
    2. לאפיין את מכלול פפטיד למבנים סופרא מולקולרית עשיר β-גיליון על-ידי קיווטות (CD). לתעד את הספקטרום באמצעות spectropolarimeter תקליטור עם מערכת בקרת טמפרטורה Peltier.
      1. פיפטה 30 μL של הפתרון הרכבה ב microcuvette אורך הנתיב 0.1 מ מ.
        הערה: בעל תא צורך מלחציים ולמיקומו בתא אורך הנתיב הקצר המכשיר.
      2. עבור כל הספקטרום, להגדיר כלי תקליטור הפרמטרים הבאים: סריקה אורכי הגל של 300 ננומטר 180 ננומטר, קצב סריקה של 100 לדקה, רוחב פס של 1 ננומטר, 25 ° C, ממוצע של שלושה סריקות.
      3. לאסוף קשת של המאגר (20% acetonitrile/10 מ מ HEPES, pH 7.5), להפחית מכל סריקה מדגם כפקד. חתימה תקליטור עבור גליונות β הוא שמינימום ellipticity ממורכז nm (איור 3B) בסביבות 22027.
  3. מיקרוסקופיה של סיבי עמילואיד
    1. לאפשר שבועיים עד שלושה שבועות על הדגימות פפטיד להבשיל למבנים סופרא מולקולרית עשיר β-גיליונות.
      הערה: ההרכבות יכול לדימות שימוש במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (TEM) בשלבים מוקדמים יותר של תהליך ההרכבה גם כן.
      1. פיפטה 10 μL של הפתרון הרכבה פפטיד על גבי המשטח של רשת פחמן TEM.
        הערה: הקפידו לא לגעת בקצה פיפטה השטח רשת. ברמת דיוק גבוהה, סגירה עצמית פינצטה משמשים להכלת הרשת TEM במהלך ההכנה.
      2. המתן 1-2 דקות כדי לאפשר את ההרכבות לספוח על פני הרשת. להסיר את עודף לדוגמה על-ידי נגיעה נייר סינון על הקצה של הרשת.
      3. להכין כתם אצטט uranyl 2% על-ידי הוספת 100 μL של מים יונים זמינים מסחרית 4% uranyl אצטט פתרון. פיפטה 10 μL של 2% uranyl אצטט הכתם על גבי משטח רשת, תקופת דגירה של 2-3 דקות. לאחר הדגירה, להסיר את הכתם עודף על-ידי נגיעה נייר סינון על הקצה של הרשת.
      4. מקם את רשתות TEM desiccator ואקום למשך הלילה. לאחסן תחת ואקום עד הדמיה.
      5. תמונה הדגימות מוכן עם TEM (איור 3C). פרמטרים טיפוסי של מיקרוסקופיית הם כדלקמן: תמונות בהגדלה ועד 9,300 X 23, 000 X, נימה טונגסטן עם מתח מאיץ של 120 kV.
        פתק: ניתן להשתמש ImageJ כדי למדוד את רוחב סיב הממוצע של המבנים סופרא מולקולרית של תמונות TEM רכשה28.
        אזהרה: נא עיין כל גליונות נתונים בטיחות רלוונטי (מרחביות) לפני השימוש. מספר כימיקלים המשמשים הסינתזה, טיהור, ואפיון של פפטידים עצמית וההספק 1, 2-dithiolane שמתואר לשנות מאכל או רעילים אמורה לשמש רק תחת ברדס fume כימי. השתמש תמיד המתאים ציוד מגן אישי (כולל בטיחות משקפיים, חלוק המעבדה, מכנסיים באורך מלא, נעליים סגורות) כאשר עובד במעבדה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

מלבד הסינתזה הראשונית של צעד אחד של מולקולה קודמן dithiolane, מתרחשת שאר הסינתזה פפטיד 1, 2-dithiolane שונה על תמיכה מלאה (איור 1 א'). ההמרה של 3-ברומו - 2-(bromomethyl) חומצה propionic 3-(acetylthio)-2-חומצה propanoic (acetylthiomethyl), מבשר dithiolane, אושר על ידי 1H ו- 13NMR C (איור 1B ו- C) לפני זה משולב חינם קצה אמיני אמין של פפטיד עדיין בשרף. Deprotection של thioacetate כדי תיולים עם ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מאמר זה דן הפרטים של שניהם הסינתזה ו הטיהור של פפטיד עצמית וההספק 1, 2-dithiolane ששינה N-מסוף ואפיון של המבנים סופרא מולקולרית וכתוצאה מכך. הסינתזה של פפטיד 1, 2-dithiolane שדווחו פה יש את היתרונות, כולל סינתזה של צעד אחד כדי לייצר מבשר dithiolane, 3-(acetylthio)-2-חומצה propanoic (acetylthiomethyl), ו---השרף מיקרוגל deprotection התגובה של קודמן thioacetate מגן קבוצתית להניב את moiety 1, 2 מחומצנת-dithiolane ניצול אמוניה מימית כפי חלופה בטוחה יותר deprotection הידרזין רעילים שדווח בעבר29. הסינתזה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף.

תודות

המחברים רוצה תודה ד ר ב' אלן Scanley שלה הדרכה טכנית ולעזור להשתמש TEM את מכללות מדינת קונטיקט ומרכז האוניברסיטה (CSCU) של ננו-טכנולוגיה, ד ר Ishita Mukerji באוניברסיטת מתה עבור גישה אל הדיסק שלה ספקטרופוטומטרים. העבודה שדווחה באופן חלקי נתמך על ידי המכון למדע באוניברסיטת פיירפילד, נאס א קונטיקט החלל מענק האיחוד, ועל -ידי הקרן הלאומית למדע תחת גרנט מספר צ'ה-1624774.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
זירת החלקה אמיד שרף MBHA,טכנולוגיות חלבון גירוסRAM-5-HLהימנע ממגע עם העור והעיניים; אין לשאוף
N,N-DimethylformamideFisher ScientificD119-4נוזל דליק ואדים; מגרה את העיניים והעור; השתמש בציוד מגן אישי; יש להרחיק מלהבה פתוחה
Fmoc-L-Val-OHטכנולוגיות חלבון GyrosFLA-25-Vללבוש ציוד מגן אישי; אין לשאוף
Fmoc-L-Leu-OHGyros Protein TechnologiesFLA-25-Lללבוש ציוד מגן אישי; אין לשאוף
Fmoc-L-Lys(Boc)-OHGyros Protein TechnologiesFLA-25-KBCללבוש ציוד מגן אישי; אין לשאוף
Fmoc-L-Phe-OHGyros Protein TechnologiesFLA-25-Fללבוש ציוד מגן אישי; אין לשאוף
Fmoc-L-Ala-OHGyros Protein TechnologiesFLA-25-Aללבוש ציוד מגן אישי; אין לשאוף
Fmoc-L-Gln(Trt)-OHGyros Protein TechnologiesFLA-25-QTללבוש ציוד מגן אישי; אין לשאוף
N,N,N′,N′-Tetramethyl-O-(1H-benzotriazol-1-yl)uronium hexafluorophosphateGyros Protein Technologies26432גורם לגירוי בעור, בעיניים ובנשימה; אין לשאוף; יש להשתמש מתחת למכסה המנוע או באזור מאוורר היטב
0.4M N-methylmorpholine ב-DMFGyros Protein TechnologiesPS3-MM-Lדליק מאוד; ללבוש ציוד מגן אישי; יש להרחיק מחום ולשמור על המיכל סגור היטב; אין לשאוף או לבלוע; לשטוף את העור ביסודיות לאחר טיפול
ב-20% פיפרידין ב-DMFGyros Protein TechnologiesPS3-PPR-Lגורם לכוויות חמורות בעיניים ובעור; נוזל דליק ואדים; אין לשאוף
דיכלורומתאןפישר סיינטיפיקD37-4עלול לגרום לסרטן; אין לשאוף; ללבוש ציוד מגן אישי; השתמש מתחת למכסה המנוע בלבד; אם במגע יש להעלות עם מים למשך 15 דקות לפחות ולקבל טיפול רפואי
אצטוניטרילפישר סיינטיפיקA998-4דליק; מגרה את העיניים; השתמש בציוד מגן אישי; השתמש רק מתחת למכסה אדים; הרחק מלהבה פתוחה או משטח חם; אם במגע יש לשטוף במים למשך 15 דקות לפחות ולפנות לטיפול רפואי
חומצה טריפלואורואצטיתFisher ScientificA116-50גורם לכוויות קשות; אין לשאוף; מזיק לחיים במים; להשתמש בציוד מגן אישי; להשתמש רק מתחת למכסה אדים; אם במגע יש לשטוף במים למשך 15 דקות לפחות ולקבל טיפול רפואי מיידי
4% אורניל אצטטמדעי מיקרוסקופ אלקטרונים22400-4אין לשאוף; מזיק לבעלי החיים במים
4-(2-הידרוקסיאתיל)פיפרזין-1-חומצה אתנסולפוניתAcros OrganicsAC172571000אין לשאוף; יש להשתמש בחוץ או באזור מאוורר היטב
חנקןGas TechAirבלחץ, עלולה להתפוצץ אם מחוממים
חומצה 3-bromo-2-(bromomethyl) פרופיוניתAlfa AesarAAA1963014אין לשאוף; גורם לגירוי בעור ובעיניים; קורוזיבי
נתרן הידרוקסידFisher ScientificS318-100השתמש בציוד מגן אישי; השתמש רק מתחת למכסה המנוע; אם יש לשטוף את האזור במגע למשך 15 דקות לפחות ולקבל טיפול רפואי
אשלגן תיואצטטAcros OrganicsAC221300250גורם לגירוי בעור ובעיניים; אין לשאוף; להשתמש בציוד מגן אישי
חומצה גופרתיתFisher ScientificSA213גורם לכוויות; הרחק ממים; הרחק מחומר דליק; אין לשאוף; השתמש בציוד מגן אישי; במקרה של מגע יש לשטוף את האזור למשך 15 דקות לפחות ולפנות לטיפול רפואי
כלורופורם-d AcrosOrganicsAC320690075סיכון אפשרי לסרטן; מגרה את העור והעיניים; אין לשאוף; השתמש בציוד מגן אישי; השתמש רק מתחת למכסה המנוע; אם יש לשטוף את האזור במגע למשך 15 דקות לפחות ולקבל טיפול רפואי
כלורופורםFisher ScientificC298-4סיכון אפשרי לסרטן; מגרה את העור והעיניים; אין לשאוף; השתמש בציוד מגן אישי; השתמש רק מתחת למכסה המנוע; אם יש לשטוף את האזור במגע למשך 15 דקות לפחות ולקבל טיפול רפואי
N,N-diisopropylethylamineAcros OrganicsAC367841000דליק מאוד; מזיק לחיים במים; ללבוש ציוד מגן אישי; אין לבלוע
אמוניום הידרוקסידFisher ScientificA669S-500Corrosive; אין לשאוף
מתנולFisher ScientificA452-4נוזל ואדים דליקים; השתמש בציוד מגן אישי; אין לשאוף; אם יש לשטוף את האזור במגע למשך 15 דקות לפחות ולקבל טיפול רפואי
triisopropylsilaneSigma Aldrich233781דליק; יש להשתמש בציוד בטיחות אישי; לשמור על המיכל סגור היטב
diethyl etherFisher ScientificE138-1דליק במיוחד; מגרה את העור והעיניים; יש להשתמש בציוד מגן אישי
2,5-חומצה דיהידרוקסיבנזואיתSigma Aldrich39319-10x10MG-Fאין לשאוף; מגרה את העור והעיניים
חומצה אלפא-ציאנו-4-הידרוקסיצינמית AlfaAesarAAJ67635EXK
c18 zip-tipMilliporeZTC18S096
tris(2-carboxyethyl) פוספין הידרוכלורידThermo ScientificPI20490
סיליקה ג'ל 60 F254 יריעות TLC מצופות אלומיניום מגובות אלומיניוםEMD Millipore1.05549.0001
צינורות תמ"ג מדויקים בעלי קירות דקיםBel-Art6630005855 מ"מ OD
מזרקי Norm-Ject מפלסטיק מלאAir TiteAL10
מחט חד פעמיתBD PrecisionGlideBD 305185מחטים משומשות נפטרות במיכל פסולת
חד מזרק חד פעמיTorviqSF1000LL10 מ"ל מזרקים מצועצעים שימשו בדוח, אך מזרקים גדולים יותר זמינים במידת הצורך לסינתזה בקנה מידה גדול יותר.
רשת פחמןטד פלה, בע"מCF200-CUהקפד להכין דגימות וצביעה בצד רשת הפחמן, לא בצד הנחושת המבריק של
פינצטה עם סגירה עצמיתElectron Microscopy Sciences78318-3Xטיפים חדים מאוד, אורך: 120 מ"מ
0.1 מ"מ תא באורך נתיב קצרStarna Cells, Inc.20/C-Q-0.1מכסי
כלי דם שבירים 10 מ"לCEM909210
10 מ"ל כלי לחץCEM908035
Aeris Semi-Prep HPLC עמודPhenomenex00F-4632-N0150 x 10 מ"מ
מחזיק תאיםStarna Cells, Inc.CH-2049נחוץ בעת שימוש בתאי אורך מסלול קצרים
PS3 פפטיד סינתיסייזרGyros Protein Technologies
DiscoverSP כור מיקרוגלCEM
צנטריפוגהHERMLEZ 206 Aהשתמש ברוטור קבוע 6x50 מ"ל
HPLCShimadzuגלאי UV
ספקטרומטר תהודה מגנטית גרעיניתAvance, Bruker300 מגה-הרץ
MALDI-TOFAxima Confidence, Shimadzu
lyophilizerMillrock TechnologyBT85A
ספקטרומטר אינפרא אדום פורייה-טרנספורמציהאלפא טנזור,
Tecnai Spirit, FEIבשימוש עם מצלמה דיגיטלית Gatan Orius Fiberoptic CCD. נגיש במרכז CSCU לננוטכנולוגיה
ספקטרופולארימטר דיכרואיזם מעגליJ-810, JASCOבשימוש עם בקר טמפרטורת פלטייר בעל שישה תאים. נגיש באוניברסיטת ווסליאן.
בעומס גבוה תכולת אוויר של הרשת ספקטרומטר מסה מיקרוסקופ אלקטרונים שידור Bruker

מקורות

  1. Wang, J., Liu, K., Xing, R., Yan, X. Peptide self-assembly: Thermodynamics and kinetics. Chemical Society Reviews. 45, 5589-5604 (2016).
  2. Dong, R., et al. Functional supramolecular polymers for biomedical applications. Advanced Materials. 27, 498-526 (2015).
  3. Edwards-Gayle, C. J. C., Hamley, I. W. Self-assembly of bioactive peptides, peptide conjugates, and peptide mimetic materials. Organic and Biomolecular Chemistry. 15, 5867-5876 (2017).
  4. Goor, O. J. G. M., Hendrikse, S. I. S., Dankers, P. Y. W., Meijer, E. W. From supramolecular polymers to multi-component biomaterials. Chemical Society Reviews. 46, 6621-6637 (2017).
  5. DiMaio, J. T. M., Doran, T. M., Ryan, D. M., Raymond, D. M., Nilsson, B. L. Modulating supramolecular peptide hydrogel viscoelasticity using biomolecular recognition. Biomacromolecules. 18, 3591-3599 (2017).
  6. DiMaio, J. T. M., Raymond, D. M., Nilsson, B. L. Display of functional proteins on supramolecular peptide nanofibrils using a split-protein strategy. Organic and Biomolecular Chemistry. 15, 5279-5283 (2017).
  7. Mahmoud, Z. N., Gunnoo, S. B., Thomson, A. R., Fletcher, J. M., Woolfson, D. N. Bioorthogonal dual functionalization of self-assembling peptide fibers. Biomaterials. 32, 3712-3720 (2011).
  8. Petkau-Milroy, K., Uhlenheuer, D. A., Spiering, A. J. H., Vekemans, J. A. J. M., Brunsveld, L. Dynamic and bio-orthogonal protein assembly along a supramolecular polymer. Chemical Science. 4, 2886-2891 (2013).
  9. Li, A., et al. Neurofibrillar tangle surrogates: Histone H1 binding to patterned phosphotyrosine peptide nanotubes. Biochemistry. 53, 4225-4227 (2014).
  10. Sadownik, A., Stefely, J., Regen, S. L. Polymerized liposomes formed under extremely mild conditions. Journal of the American Chemical Society. 108, 7789-7791 (1986).
  11. Zhang, N., et al. ATN-161 Peptide functionalized reversibly cross-linked polymersomes mediate targeted doxorubicin delivery into melanoma-bearing C57BL/6 mice. Molecular Pharmaceutics. 14, 2538-2547 (2017).
  12. Margulis, K., et al. Formation of polymeric nanocubes by self-assembly and crystallization of dithiolane-containing triblock copolymers. Angewandte Chemie International Edition. 56, 16357-16362 (2017).
  13. Zhang, X., Waymouth, R. 1,2-Dithiolane-Derived Dynamic, Covalent Materials: Cooperative Self-Assembly and Reversible Cross-Linking. Journal of the American Chemical Society. 139, 3822-3833 (2017).
  14. Sakia, N., Matile, S. Stack exchange strategies for the synthesis of covalent double-channel photosystems by self-organizing surface-initiated polymerization. Journal of the American Chemical Society. 133, 18542-18545 (2011).
  15. Uji, H., Morita, T., Kimura, S. Molecular direction dependence of single-molecule conductance of a helical peptide in molecular junction. Physical Chemistry Chemical Physics. 15, 757-760 (2013).
  16. Liang, C., Ni, R., Smith, J. E., Childers, W. S., Mehta, A. K., Lynn, D. G. Kinetic intermediates in amyloid assembly. Journal of the American Chemical Society. 136, 15116-15149 (2014).
  17. Smith, J. E., et al. Defining the dynamic conformational network of cross-β peptide assembly. Israel Journal of Chemistry. 55, 763-769 (2015).
  18. Black, S. P., Sanders, J. K. M., Stefankiewicz, A. R. Disulfide exchange: Exposing supramolecular reactivity through dynamic covalent chemistry. Chemical Society Reviews. 43, 1861-1872 (2014).
  19. Vendetti, A., et al. Dihydroasparagusic acid: Antioxidant and tyrosinase inhibitory activities and improved synthesis. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 61, 6848-6855 (2013).
  20. Stawikowski, M., Fields, G. B. Introduction to peptide synthesis. Current Protocols in Protein Science. 26, (2002).
  21. Canadell, J., Goossens, H., Klumperman, B. Self-healing materials based on disulfide links. Macromolecules. 44, 2536-2541 (2011).
  22. Lafont, U., van Zeijl, H., van der Zwaag, S. Influence of cross-linkers on the cohesive and adhesive self-healing ability of polydisulfide-based thermosets. ACS Applied Materials and Interfaces. 4, 6280-6288 (2012).
  23. Komaromy, D., Stuart, M. C. A., Santiago, G. M., Tezcan, M., Krasnikov, V. V., Otto, S. Self-assembly can direct dynamic covalent bond formation toward diversity or specificity. Journal of the American Chemical Society. 139, 6234-6241 (2017).
  24. McAvery, K. M., Guan, B., Fortier, C. A., Tarr, M. A., Cole, R. B. Laser-induced oxidation of cholesterol observed during MALDI-TOF mass spectrometry. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 22, 659-669 (2011).
  25. Krimm, S., Bandekar, J. Vibrational spectroscopy and conformation of peptides, polypeptides, and proteins. Advances in Protein Chemistry. 38, 181-364 (1986).
  26. Halverson, K. J., Sucholeiki, I., Ashburn, T. T., Lansbury, P. T. Location of β-sheet-forming sequences in amyloid proteins by FTIR. Journal of the American Chemical Society. 113, 6701-6703 (1991).
  27. Greenfield, N., Fasman, G. D. Computed circular dichroism spectra for the evaluation of protein confirmation. Biochemistry. 8, 4108-4116 (1969).
  28. Rasband, W. S. ImageJ. , National Institutes of Health. Bethesda, Maryland, USA. Available from: https://imagej.nih.gov/ij (2016).
  29. Roy, S., Shinde, S., Hamilton, G. A., Hartnett, H. E., Jones, A. K. Artificial [FeFe]-hydrogenase: On resin modification of an amino acid to anchor a hexacarbonyldiiron cluster in a peptide framework. European Journal of Inorganic Chemistry. 2011, 1050-1055 (2011).
  30. Van Duinen, S. G., Castano, E. M., Prelli, F., Bots, G. T. A. B., Luyendijk, W., Frangione, B. Hereditary cerebral hemorrhage with amyloidosis in patients of Dutch origin is related to Alzheimer disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84, 5991-5994 (1987).
  31. Barth, A. The infrared absorption of amino acid sidechains. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 74, 141-173 (2000).
  32. Jayaraman, M., et al. Slow amyloid nucleation via α-helix-rich oligomeric intermediates in short polyglutamine-containing Huntingtin fragments. Journal of Molecular Biology. 415, 881-899 (2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

12 DithiolaneHPLCMALDI TOFFT IR
סינתזה ואפיון של 1, 2-Dithiolane ששינה פפטידים וההספק עצמית
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.