סינתזה ואפיון של 1, 2-Dithiolane ששינה פפטידים וההספק עצמית

Summary

פרוטוקול לסינתזה של 1, 2-dithiolane ששינה פפטיד ואפיון המבנים סופרא מולקולרית הנובע פפטיד הרכבה עצמית.

Abstract

הדו ח מתמקד הסינתזה של קצה אמיני 1, 2-dithiolane שינוי עצמי וההספק פפטיד, אפיון וכתוצאה מכך התאספו עצמית מבנים סופרא מולקולרית. המסלול סינתטי מנצל מוצק-פאזי פפטיד סינתזה עם המושבים על-שרף של dithiolane מולקולה קודמן, 3-(acetylthio)-2-חומצה propanoic (acetylthiomethyl), את thioacetate בסיוע מיקרוגל deprotection של פפטיד אמיני לפני המחשוף הסופי של השרף להניב את 1, 2-dithiolane ששינה פפטיד. לאחר הטיהור ביצועים גבוהים כרומטוגרפיה נוזלית (HPLC) של פפטיד 1, 2-dithiolane, נגזר ליבת nucleating פפטיד Aβ הקשורים עם מחלת אלצהיימר, מוצג על פפטיד להרכיב עצמי לתוך סיבי עמילואיד קרוס-β. פרוטוקולים לאפיין את סיבי עמילואיד על ידי פורייה-ספקטרוסקופיית (FT-IR), קיווטות ספקטרוסקופיה (CD) במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (TEM) מוצגים. השיטות של שינוי N-מסוף עם moiety 1, 2-dithiolane פפטידים עצמית וההספק מאופיין היטב עכשיו ניתן לסייר כמערכות מודל לפיתוח אסטרטגיות ההרכבה שלאחר השינוי ולחקור דינמי כימיה קוולנטיות על פפטיד סופרא מולקולרית nanofiber משטחים.

Introduction

הקשר הפפטידי חזקים ויוצרים כימיה מעורב פפטיד מוצק-שלב הסינתזה ולעשות היכולת לשלוט רצף באורך ו הלחנה של פפטידים בעצמם למבנים סופרא מולקולרית שדה חקר בכבדות. הגורמים לשלוט ולייצב את מבנים מורכבים עצמית פפטיד, כולל שרשרת הצד הסטריים אלקטרוסטאטיות, מימן, וכוחות אפקטים הידרופובי¹, לשמש ערכה של כללי עיצוב. כמו המחקר לתוך אלה כללי עיצוב בסיסי ממשיך להתקדם, הצעד ההגיוני הבא בפפטיד כוללת הרכבה עצמית הרחבת המגוון של מבנים מבוססת על פפטיד ופונקציות. בעוד עצמית בהרכבת פפטידים נמצאים biomaterial רב-תכליתי נעשה בהם שימוש ביו יישומים רבים על-ידי כיוונון פפטיד רצף או מכלול התנאים^2,3,

Protocol

1. סינתזה ולטיהור 1, 2-Dithiolane ששינה פפטיד

1. סינתזה של קודמן dithiolane, 3-(acetylthio)-2-חומצה propanoic (acetylthiomethyl)¹⁹.
   1. להוסיף 1 גר' 3-ברומו - 2-(bromomethyl) חומצה propionic (1 equiv.) מומס כמות מינימלית של NaOH M 1 (כ- 4 מ"ל) אל בקבוק התגובה התחתון עגול 25-mL עם ערבוב-55 מעלות צלזיוס. לאטום את הבקבוקון התגובה עם septa ומניחים תחת חנקן אווירה.
   2. להכין פתרון המכיל 1.49 גרם אשלגן thioacetate (3.2 equiv.) ב- 4 מ"ל של מים יונים ו- 3 מ"ל של חומצה גופרתית 2 מ' (H₂אז₄) כדי ליצור thioacetic חומצה בחיי עיר.
   3. משוך את הפתרון חומצה thioacetic לתוך מזרק פלסטיק ח....

Results

מלבד הסינתזה הראשונית של צעד אחד של מולקולה קודמן dithiolane, מתרחשת שאר הסינתזה פפטיד 1, 2-dithiolane שונה על תמיכה מלאה (איור 1 א'). ההמרה של 3-ברומו - 2-(bromomethyl) חומצה propionic 3-(acetylthio)-2-חומצה propanoic (acetylthiomethyl), מבשר dithiolane, אושר על ידי ¹H ו- ¹³NMR C (איור 1B ו- C) לפני זה משולב חינם קצה אמיני אמין של פפטיד עדיין בשרף. Deprotection של thioacetate כדי תיולים עם .......

Discussion

מאמר זה דן הפרטים של שניהם הסינתזה ו הטיהור של פפטיד עצמית וההספק 1, 2-dithiolane ששינה N-מסוף ואפיון של המבנים סופרא מולקולרית וכתוצאה מכך. הסינתזה של פפטיד 1, 2-dithiolane שדווחו פה יש את היתרונות, כולל סינתזה של צעד אחד כדי לייצר מבשר dithiolane, 3-(acetylthio)-2-חומצה propanoic (acetylthiomethyl), ו---השרף מיקרוגל deprotection התגובה של קודמן thioacetate מגן קבוצתית להניב את moiety 1, 2 מחומצנת-dithiolane ניצול אמוניה מימית כפי חלופה בטוחה יותר deprotection הידרזין רעילים שדווח בעבר²⁹. הסינתזה.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
זירת החלקה אמיד שרף MBHA,	טכנולוגיות חלבון גירוס	RAM-5-HL	הימנע ממגע עם העור והעיניים; אין לשאוף
N,N-Dimethylformamide	Fisher Scientific	D119-4	נוזל דליק ואדים; מגרה את העיניים והעור; השתמש בציוד מגן אישי; יש להרחיק מלהבה פתוחה
Fmoc-L-Val-OH	טכנולוגיות חלבון Gyros	FLA-25-V	ללבוש ציוד מגן אישי; אין לשאוף
Fmoc-L-Leu-OH	Gyros Protein Technologies	FLA-25-L	ללבוש ציוד מגן אישי; אין לשאוף
Fmoc-L-Lys(Boc)-OH	Gyros Protein Technologies	FLA-25-KBC	ללבוש ציוד מגן אישי; אין לשאוף
Fmoc-L-Phe-OH	Gyros Protein Technologies	FLA-25-F	ללבוש ציוד מגן אישי; אין לשאוף
Fmoc-L-Ala-OH	Gyros Protein Technologies	FLA-25-A	ללבוש ציוד מגן אישי; אין לשאוף
Fmoc-L-Gln(Trt)-OH	Gyros Protein Technologies	FLA-25-QT	ללבוש ציוד מגן אישי; אין לשאוף
N,N,N′,N′-Tetramethyl-O-(1H-benzotriazol-1-yl)uronium hexafluorophosphate	Gyros Protein Technologies	26432	גורם לגירוי בעור, בעיניים ובנשימה; אין לשאוף; יש להשתמש מתחת למכסה המנוע או באזור מאוורר היטב
0.4M N-methylmorpholine ב-DMF	Gyros Protein Technologies	PS3-MM-L	דליק מאוד; ללבוש ציוד מגן אישי; יש להרחיק מחום ולשמור על המיכל סגור היטב; אין לשאוף או לבלוע; לשטוף את העור ביסודיות לאחר טיפול
ב-20% פיפרידין ב-DMF	Gyros Protein Technologies	PS3-PPR-L	גורם לכוויות חמורות בעיניים ובעור; נוזל דליק ואדים; אין לשאוף
דיכלורומתאן	פישר סיינטיפיק	D37-4	עלול לגרום לסרטן; אין לשאוף; ללבוש ציוד מגן אישי; השתמש מתחת למכסה המנוע בלבד; אם במגע יש להעלות עם מים למשך 15 דקות לפחות ולקבל טיפול רפואי
אצטוניטריל	פישר סיינטיפיק	A998-4	דליק; מגרה את העיניים; השתמש בציוד מגן אישי; השתמש רק מתחת למכסה אדים; הרחק מלהבה פתוחה או משטח חם; אם במגע יש לשטוף במים למשך 15 דקות לפחות ולפנות לטיפול רפואי
חומצה טריפלואורואצטית	Fisher Scientific	A116-50	גורם לכוויות קשות; אין לשאוף; מזיק לחיים במים; להשתמש בציוד מגן אישי; להשתמש רק מתחת למכסה אדים; אם במגע יש לשטוף במים למשך 15 דקות לפחות ולקבל טיפול רפואי מיידי
4% אורניל אצטט	מדעי מיקרוסקופ אלקטרונים	22400-4	אין לשאוף; מזיק לבעלי החיים במים
4-(2-הידרוקסיאתיל)פיפרזין-1-חומצה אתנסולפונית	Acros Organics	AC172571000	אין לשאוף; יש להשתמש בחוץ או באזור מאוורר היטב
חנקן	Gas TechAir		בלחץ, עלולה להתפוצץ אם מחוממים
חומצה 3-bromo-2-(bromomethyl) פרופיונית	Alfa Aesar	AAA1963014	אין לשאוף; גורם לגירוי בעור ובעיניים; קורוזיבי
נתרן הידרוקסיד	Fisher Scientific	S318-100	השתמש בציוד מגן אישי; השתמש רק מתחת למכסה המנוע; אם יש לשטוף את האזור במגע למשך 15 דקות לפחות ולקבל טיפול רפואי
אשלגן תיואצטט	Acros Organics	AC221300250	גורם לגירוי בעור ובעיניים; אין לשאוף; להשתמש בציוד מגן אישי
חומצה גופרתית	Fisher Scientific	SA213	גורם לכוויות; הרחק ממים; הרחק מחומר דליק; אין לשאוף; השתמש בציוד מגן אישי; במקרה של מגע יש לשטוף את האזור למשך 15 דקות לפחות ולפנות לטיפול רפואי
כלורופורם-d Acros	Organics	AC320690075	סיכון אפשרי לסרטן; מגרה את העור והעיניים; אין לשאוף; השתמש בציוד מגן אישי; השתמש רק מתחת למכסה המנוע; אם יש לשטוף את האזור במגע למשך 15 דקות לפחות ולקבל טיפול רפואי
כלורופורם	Fisher Scientific	C298-4	סיכון אפשרי לסרטן; מגרה את העור והעיניים; אין לשאוף; השתמש בציוד מגן אישי; השתמש רק מתחת למכסה המנוע; אם יש לשטוף את האזור במגע למשך 15 דקות לפחות ולקבל טיפול רפואי
N,N-diisopropylethylamine	Acros Organics	AC367841000	דליק מאוד; מזיק לחיים במים; ללבוש ציוד מגן אישי; אין לבלוע
אמוניום הידרוקסיד	Fisher Scientific	A669S-500	Corrosive; אין לשאוף
מתנול	Fisher Scientific	A452-4	נוזל ואדים דליקים; השתמש בציוד מגן אישי; אין לשאוף; אם יש לשטוף את האזור במגע למשך 15 דקות לפחות ולקבל טיפול רפואי
triisopropylsilane	Sigma Aldrich	233781	דליק; יש להשתמש בציוד בטיחות אישי; לשמור על המיכל סגור היטב
diethyl ether	Fisher Scientific	E138-1	דליק במיוחד; מגרה את העור והעיניים; יש להשתמש בציוד מגן אישי
2,5-חומצה דיהידרוקסיבנזואית	Sigma Aldrich	39319-10x10MG-F	אין לשאוף; מגרה את העור והעיניים
חומצה אלפא-ציאנו-4-הידרוקסיצינמית Alfa	Aesar	AAJ67635EXK
c18 zip-tip	Millipore	ZTC18S096
tris(2-carboxyethyl) פוספין הידרוכלוריד	Thermo Scientific	PI20490
סיליקה ג'ל 60 F254 יריעות TLC מצופות אלומיניום מגובות אלומיניום	EMD Millipore	1.05549.0001
צינורות תמ"ג מדויקים בעלי קירות דקים	Bel-Art	663000585	5 מ"מ OD
מזרקי Norm-Ject מפלסטיק מלא	Air Tite	AL10
מחט חד פעמית	BD PrecisionGlide	BD 305185	מחטים משומשות נפטרות במיכל פסולת
חד מזרק חד פעמי	Torviq	SF1000LL	10 מ"ל מזרקים מצועצעים שימשו בדוח, אך מזרקים גדולים יותר זמינים במידת הצורך לסינתזה בקנה מידה גדול יותר.
רשת פחמן	טד פלה, בע"מ	CF200-CU	הקפד להכין דגימות וצביעה בצד רשת הפחמן, לא בצד הנחושת המבריק של
פינצטה עם סגירה עצמית	Electron Microscopy Sciences	78318-3X	טיפים חדים מאוד, אורך: 120 מ"מ
0.1 מ"מ תא באורך נתיב קצר	Starna Cells, Inc.	20/C-Q-0.1	מכסי
כלי דם שבירים 10 מ"ל	CEM	909210
10 מ"ל כלי לחץ	CEM	908035
Aeris Semi-Prep HPLC עמוד	Phenomenex	00F-4632-N0	150 x 10 מ"מ
מחזיק תאים	Starna Cells, Inc.	CH-2049	נחוץ בעת שימוש בתאי אורך מסלול קצרים
PS3 פפטיד סינתיסייזר	Gyros Protein Technologies
DiscoverSP כור מיקרוגל	CEM
צנטריפוגה	HERMLE	Z 206 A	השתמש ברוטור קבוע 6x50 מ"ל
HPLC	Shimadzu		גלאי UV
ספקטרומטר תהודה מגנטית גרעינית	Avance, Bruker		300 מגה-הרץ
MALDI-TOF	Axima Confidence, Shimadzu
lyophilizer	Millrock Technology	BT85A
ספקטרומטר אינפרא אדום פורייה-טרנספורמציה	אלפא טנזור,
	Tecnai Spirit, FEI		בשימוש עם מצלמה דיגיטלית Gatan Orius Fiberoptic CCD. נגיש במרכז CSCU לננוטכנולוגיה
ספקטרופולארימטר דיכרואיזם מעגלי	J-810, JASCO		בשימוש עם בקר טמפרטורת פלטייר בעל שישה תאים. נגיש באוניברסיטת ווסליאן.